脫氫表雄酮聯(lián)合高脂飲食誘導(dǎo)建立小鼠多囊卵巢綜合征模型的研究

彭洋洋，張怡，謝青貞

(武漢大學(xué)人民醫(yī)院生殖醫(yī)學(xué)中心，湖北省輔助生殖與胚胎發(fā)育醫(yī)學(xué)臨床研究中心，武漢 430060)

多囊卵巢綜合征(PCOS)是育齡期婦女常見的生殖內(nèi)分泌疾病之一，育齡期婦女中發(fā)病率約為8%～13%，以月經(jīng)稀發(fā)/閉經(jīng)、高雄激素血癥和多囊卵巢為基本特征，且大多數(shù)患者常伴發(fā)肥胖、胰島素抵抗、糖脂代謝紊亂等代謝異常，成為2型糖尿病、心腦血管疾病和子宮內(nèi)膜癌發(fā)病的高危因素[1]。近年來，多項臨床研究發(fā)現(xiàn)，PCOS患者罹患非酒精性脂肪肝(NAFLD)的風(fēng)險高于健康對照組，且與肥胖、胰島素抵抗、高雄激素血癥及炎癥反應(yīng)等相關(guān)[2-3]。

PCOS作為一種難治性、異質(zhì)性疾病，病因及發(fā)病機制復(fù)雜，且難以獲取臨床標(biāo)本進(jìn)行研究，因此建立一種理想的PCOS動物模型在相關(guān)病理生理機制研究及臨床治療指導(dǎo)中具有深遠(yuǎn)的意義。自1935年首次描述PCOS以來，已應(yīng)用了許多方法構(gòu)造PCOS嚙齒動物模型，包括使用類固醇激素進(jìn)行產(chǎn)前、青春期前及青春期后造模，應(yīng)用雌激素、芳香化酶抑制劑、胰島素(INS)聯(lián)合人絨毛促性腺激素(HCG)及基因敲除/轉(zhuǎn)基因小鼠等方式進(jìn)行造模[4-5]。然而，目前尚缺乏PCOS小鼠動物模型構(gòu)建的統(tǒng)一方法及標(biāo)準(zhǔn)；此外，關(guān)于PCOS小鼠動物模型中糖脂代謝、肝功能及肝臟結(jié)構(gòu)變化也鮮有報道。本研究擬采用脫氫表雄酮(DHEA)聯(lián)合高脂飼料誘導(dǎo)雌性 C57BL/6 小鼠建立 PCOS模型，并與傳統(tǒng)的DHEA單一雄激素造模法進(jìn)行比較，分析其生殖、代謝特征及肝臟組織病理變化，旨在尋找一種簡便有效、更加符合人體PCOS病理特征的動物模型，為PCOS病因及發(fā)病機制研究提供更多研究模型。

材料與方法

一、實驗動物

選取21日齡SPF級C57BL/6J小鼠30只(湖南斯萊克景達(dá)實驗動物)，體重為10～15 g，SPF級屏障環(huán)境飼養(yǎng)，飼養(yǎng)濕度為50%～70%，溫度為(22±2)℃，光照和黑暗時間為12 h/12 h，自由飲水和攝食。實驗動物許可證：WDRM動(福)第20200902號，所有動物實驗操作過程符合美國國立衛(wèi)生研究院(NIH)規(guī)定的實驗動物福利和道德規(guī)定，且本研究實驗方案已通過武漢大學(xué)人民醫(yī)院動物實驗倫理委員會審議批準(zhǔn)。

二、主要試劑和儀器

DHEA(上海阿拉丁)、芝麻油(上海麥克林)、高脂飼料(北京華阜康)、精蛋白生物合成人胰島素注射液(預(yù)混30R，諾和諾德)，睪酮(T)、LH、FSH、胰島素(INS)等ELISA檢測試劑盒均購自中國武漢伊萊瑞特生物；血糖儀(590，江蘇魚躍)、組織脫水機(Donatello，DIAPATH，意大利)、石蠟包埋機(JB-P5，武漢俊杰電子)、石蠟切片機(RM2016，上海徠卡)、酶標(biāo)儀(Flexstation3，MD，美國)、全自動生化分析儀(ADVLA 2400，西門子，日本)。

三、研究方法

1.造模與分組：小鼠適應(yīng)性喂養(yǎng)3 d后，將30只小鼠按體重排序，采用隨機數(shù)字表法，隨機分為3組：對照組、DHEA組、DHEA+高脂飲食(DHEA+HFD)組，每組各10只。對照組：每日頸背部皮下注射芝麻油0.2 ml并給予普通飼料；DHEA組[6]：將DHEA按 60 mg·kg-1·d-1溶于0.2 ml芝麻油，每天頸背部皮下注射，并給予普通飼料，共21 d；DHEA+HFD組：在 DHEA注射給藥基礎(chǔ)上，每天給予60%高脂飼料喂養(yǎng)。

2.小鼠體重及動情周期監(jiān)測：實驗期間每3 d上午測量小鼠體重，監(jiān)測小鼠體重增長情況。于實驗第10天開始，每天上午固定時間行陰道拭子涂片，用0.9%生理鹽水浸濕的無菌棉簽，沿小鼠陰道壁涂抹并沿同一方向涂抹到載玻片上，持續(xù)10 d，于光學(xué)顯微鏡下觀察陰道上皮細(xì)胞形態(tài)，并根據(jù)陰道涂片細(xì)胞變化特點劃分為動情前期、動情期、動情后期和動情間期，監(jiān)測各組小鼠動情周期變化。

3.腹腔內(nèi)注射葡萄糖耐量實驗和胰島素耐量實驗：治療第19天禁食不禁飲12 h后進(jìn)行腹腔內(nèi)注射葡萄糖耐量試驗(IPGTT)，根據(jù)體重腹腔注射葡萄糖溶液(2 g/kg)，分別于0、15、30、60、90和120 min采集尾靜脈血，并用血糖儀測量血糖。治療第20天禁食不禁飲6 h后進(jìn)行胰島素耐量試驗(ITT)，根據(jù)體重腹腔注射稀釋后胰島素溶液(0.75 U/kg)，于上述相同時間點采集尾靜脈血測量血糖。計算IPGTT及ITT葡萄糖反應(yīng)曲線下總面積(AUC)。

4.小鼠血清檢測：實驗第21天全部小鼠禁食6 h后，采用乙醚吸入性麻醉，用尖頭鑷子摘取眼球，并采用EP管收集血液，4℃靜置過夜，第2天4℃、3 000 rpm離心15 min后，取上清，-80℃凍存?zhèn)溆?。部分血清進(jìn)行ELISA檢測：嚴(yán)格按照FSH、LH、T、FINS各試劑盒說明書操作，用酶標(biāo)儀于450 nm波長下測定其OD值，并計算 LH/FSH 比值；部分血清使用全自動生化儀進(jìn)行檢測：(1)空腹血糖(FPG)；(2)血脂四項：總膽固醇(TCHO)、甘油三脂(TG)、高密度脂蛋白(HDL)、低密度脂蛋白(LDL)；(3)肝功能：谷丙轉(zhuǎn)氨酶(ALT)、谷草轉(zhuǎn)氨酶(AST)。計算穩(wěn)態(tài)模型評估胰島素抵抗指數(shù)(HOMA-IR)=FPG(mmol/L)×FINS(mU/L)/22.5。

5.小鼠卵巢組織學(xué)觀察：采用頸椎脫臼法處死小鼠，解剖小鼠雙側(cè)卵巢，去除其表面的脂肪組織及覆蓋包膜，以4%多聚甲醛固定24 h，常規(guī)脫水石蠟包埋，4 μm最大切面切片后進(jìn)行蘇木精伊紅(HE)染色，脫水，透明中性樹膠封片，顯微鏡下觀察各組小鼠卵巢組織學(xué)變化。

6.小鼠肝臟組織學(xué)觀察：選取小鼠肝右側(cè)最厚一葉，同一部位切取大致相同體積肝組織1塊，4%多聚甲醛固定24 h，梯度乙醇脫水，二甲苯透明，石蠟包埋，4 μm最大切面切片，HE染色后顯微鏡下觀察各組小鼠肝臟組織學(xué)變化。取肝組織石蠟切片，行油紅O染色，顯微鏡下觀察肝組織脂質(zhì)沉積情況，脂滴呈鮮紅色，細(xì)胞核呈藍(lán)色，紅色面積越大代表脂肪沉積越嚴(yán)重。

四、統(tǒng)計學(xué)分析

結(jié) 果

一、小鼠體重及動情周期比較

造模前3組間平均體重比較無顯著性差異(P>0.05)，造模后的第12、15、18、21天，DHEA+HFD組和DHEA組小鼠的平均體重增加，均顯著高于對照組(P<0.01)，且DHEA+HFD組平均體重較DHEA組顯著增加(P<0.01)(圖1)。

同時段3組組間比較，**P<0.01

實驗第10天開始行陰道涂片，觀察小鼠動情周期變化。結(jié)果顯示，對照組的陰道涂片可見規(guī)律的排卵周期，說明其動情周期規(guī)則；DHEA+HFD組及DHEA組均多見大片不規(guī)則形狀的鱗狀上皮細(xì)胞，提示動情周期紊亂、無規(guī)律排卵(圖2)。

P：動情前期；E：動情期；M：動情后期；D：動情間期

二、小鼠卵巢HE病理改變

小鼠卵巢HE染色后顯微鏡下觀察，DHEA+HFD組和DHEA組均觀察到卵巢表面呈多囊樣改變，黃體數(shù)量少于對照組，卵泡顆粒細(xì)胞層數(shù)減少。對照組卵巢內(nèi)可見各級不同發(fā)育階段的卵泡，偶見極少量囊性卵泡，且成熟卵泡結(jié)構(gòu)完整，存在放射冠、卵丘及卵細(xì)胞，卵巢顆粒細(xì)胞層致密且排列整齊，多為 8～9層(圖3)。

圖3 小鼠卵巢組織結(jié)構(gòu)比較(HE染色)

三、小鼠血清生殖激素及糖代謝檢測結(jié)果

DHEA+HFD組FSH水平顯著高于對照組(P<0.05)，DHEA組FSH水平高于對照組，但差異無統(tǒng)計學(xué)意義(P>0.05)。DHEA+HFD組及DHEA組小鼠血清T、LH水平均顯著高于對照組(P<0.01)。DHEA組LH/FSH值顯著高于對照組(P<0.01)，DHEA+HFD組LH/FSH值高于對照組，但差異無統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05)。DHEA組及DHEA+HFD組FPG及FINS水平均顯著高于對照組(P<0.05)，DHEA+HFD組HOMA-IR顯著高于DHEA組和對照組(P<0.01)(表1)。

表1 小鼠組間血清生殖激素及糖代謝情況比較

四、小鼠血脂水平和肝功能比較

3組小鼠間TG水平無顯著性差異(P>0.05)；DHEA組TCHO、HDL水平較對照組顯著增加(P<0.05)，DHEA+HFD組TCHO、HDL(P<0.01)及LDL(P<0.05)水平較DHEA組及對照組均顯著增加(表2)。DHEA+HFD組及DHEA組血清ALT水平均高于對照組，但差異無統(tǒng)計學(xué)意義(P>0.05)；DHEA組血清AST水平顯著高于對照組(P<0.05)，DHEA+HFD組AST水平顯著高于DHEA組和對照組(P<0.01)(表2)。

表2 小鼠組間血脂水平及肝功能比較

五、小鼠肝臟病理比較

肝臟HE染色結(jié)果顯示，3組間結(jié)構(gòu)沒有明顯差異；進(jìn)一步通過油紅O染色評估肝臟中的脂質(zhì)含量，顯微鏡下觀察發(fā)現(xiàn)DHEA+HFD組小鼠的肝臟脂質(zhì)蓄積量較對照組和DHEA組增加(圖4)。

圖4 小鼠肝臟組織結(jié)構(gòu)比較(HE及油紅O染色 ×400)

六、小鼠糖耐量及胰島素抵抗情況比較

IPGTT實驗結(jié)果顯示：DHEA組及DHEA+HFD組在葡萄糖注射給藥后15、30 min血清葡萄糖水平較對照組顯著增加(P<0.01)(圖5A)；DHEA+HFD組AUC顯著高于DHEA組及對照組(P<0.01)，DHEA組AUC較對照組升高，但差異無統(tǒng)計學(xué)意義(P>0.05)(圖5B)。此外，ITT實驗顯示胰島素注射15、30、60及90 min后，DHEA+HFD組及DHEA組小鼠血清葡萄糖水平均顯著高于對照組(P<0.01)(圖5C)，且兩組小鼠AUC均顯著高于對照組(P<0.01)(圖5D)。

A：小鼠IPGTT曲線；B：小鼠IPGTT葡萄糖曲線下面積(AUC)比較；C：小鼠ITT曲線；D：小鼠ITT葡萄糖曲線下面積(AUC)比較。與對照組比較，*P<0.05，**P<0.01；與DHEA組比較，#P<0.05，##P<0.01

討 論

PCOS作為一種以生殖障礙和代謝紊亂為特征的疾病，國內(nèi)外研究者多采用PCOS動物模型深入研究其病因、病理生理及藥物治療機制，其中以嚙齒動物雄激素造模法最常見。Ryan等[7]研究發(fā)現(xiàn)，長期暴露于雄激素環(huán)境中，小鼠可表現(xiàn)出典型的PCOS特點，包括卵巢多囊樣改變、排卵障礙、內(nèi)分泌紊亂及肥胖等，且氟他胺抗雄激素治療可逆轉(zhuǎn)其病理改變。李天鶴等[8]研究發(fā)現(xiàn)，DHEA及雙氫睪酮(DHT)連續(xù)造模21 d均可成功建立PCOS大鼠模型，且DHEA組大鼠糖脂代謝紊亂程度更甚。

DHEA是主要在腎上腺皮質(zhì)合成的雄激素，也是卵泡膜細(xì)胞中孕烯醇酮經(jīng)Δ4途徑合成雄烯二酮的中間產(chǎn)物。外源性提高DHEA水平可升高血清睪酮水平，從而引起卵泡發(fā)育障礙及排卵障礙[9]。DHEA最初用于誘導(dǎo)PCOS大鼠模型，近十幾年來也用于誘導(dǎo)PCOS小鼠模型，且被廣泛用于各種基因敲除、轉(zhuǎn)基因和組織特異性基因敲除小鼠中，以探究PCOS發(fā)病機制中特定基因的功能[10]。Lai 等[11]及王玉閣等[12]采用DHEA聯(lián)合60%高脂飲食構(gòu)建PCOS小鼠模型，分別造模20 d及30 d，均成功誘導(dǎo)出了PCOS的生殖及代謝表型。但Caldwell等[13]研究發(fā)現(xiàn)，用 DHEA 連續(xù)造模90 d并不能成功誘導(dǎo)出PCOS小鼠相關(guān)表型，說明DHEA建模時程對模型成功與否至關(guān)重要。

近年來，研究發(fā)現(xiàn)PCOS患者的NAFLD發(fā)病率增加。Cui等[14]開展的動物實驗也發(fā)現(xiàn)，DHT誘導(dǎo)的PCOS動物模型出現(xiàn)胰島素抵抗(IR)、肝臟脂質(zhì)蓄積、肝臟不同程度炎癥反應(yīng)，提示雄激素與肝臟病變具有相關(guān)性。但采用DHEA誘導(dǎo)PCOS動物模型并觀察肝臟組織病理學(xué)改變的研究甚少，同時考慮到高脂飲食(HFD)對生殖和代謝疾病的可能影響[15]，因此我們采用DHEA聯(lián)合HFD進(jìn)行造模，并與單純應(yīng)用DHEA造模進(jìn)行比較。本研究采用21 d頸背部皮下注射DHEA或聯(lián)合HFD構(gòu)建PCOS小鼠模型，結(jié)果顯示DHEA組小鼠體重較對照組增加，并可進(jìn)一步引起小鼠動情周期紊亂、卵巢多囊樣改變、高雄激素血癥(HA)、LH/FSH比值升高等異常改變，說明DHEA成功誘導(dǎo)小鼠出現(xiàn)類PCOS樣表現(xiàn)，提示高雄激素水平在 PCOS 發(fā)生發(fā)展中發(fā)揮重要作用，但DHEA在肥胖中的確切作用機制尚不清楚。此外，DHEA聯(lián)合HFD同樣促進(jìn)小鼠出現(xiàn)類PCOS表現(xiàn)，且生殖表型更嚴(yán)重，且與對照組及DHEA組相比小鼠血清膽固醇水平顯著升高，肝功能受損程度加重并觀察到明顯的肝脂肪變性，提示DHEA聯(lián)合HFD增加肝臟脂肪變性風(fēng)險，HFD在其中發(fā)揮重要作用。DHEA聯(lián)合HFD是構(gòu)建PCOS合并NAFLD動物模型的理想方法，為進(jìn)一步研究兩者間病理生理機制聯(lián)系提供基礎(chǔ)。

為了研究處理因素對小鼠葡萄糖耐量及胰島素抵抗的影響，進(jìn)行了IPGTT及ITT試驗。結(jié)果表明，DHEA組及DHEA聯(lián)合HFD小鼠均表現(xiàn)出糖耐量異常和胰島素抵抗，提示DHEA促進(jìn)糖代謝紊亂且HFD進(jìn)一步加重糖代謝紊亂。既往研究發(fā)現(xiàn)，IR發(fā)生在大約50%～80% 的PCOS患者中，且肥胖可進(jìn)一步加重PCOS的IR[16]。動物實驗表明，青春期前過度暴露于雄激素的雌性嚙齒類動物皮下和內(nèi)臟脂肪組織中脂肪細(xì)胞體積增大，且脂肪因子表達(dá)水平降低，可能與IR的發(fā)生有關(guān)[17-18]。但HA在PCOS中誘導(dǎo)IR的具體機制尚不清楚，未來需進(jìn)一步探究兩者間的聯(lián)系和相互作用，為PCOS診治提供新的臨床靶點。

綜上，本研究采用DHEA及DHEA聯(lián)合HFD 2種造模方法誘導(dǎo)C57BL/6J雌性小鼠建立PCOS動物模型，均成功構(gòu)建出小鼠PCOS模型，表現(xiàn)出PCOS的生殖與代謝特征，且DHEA聯(lián)合HFD法較單純DHEA法卵巢病理學(xué)變化、內(nèi)分泌紊亂、糖脂代謝異常及肝臟脂質(zhì)蓄積更加顯著。因此，DHEA聯(lián)合HFD造?？勺鳛檠芯壳嗌倌關(guān)COS代謝紊亂發(fā)病機制的一種手段，特別是用于研究PCOS患者伴肝脂肪變性的潛在機制。