如何減少冷凍切片中的類(lèi)冰晶現(xiàn)象

林興滔，葛 巖，鄧雪琴，郭壽銘，李 智

術(shù)中冷凍切片快速病理診斷是協(xié)助臨床醫(yī)師明確病變性質(zhì)、指導(dǎo)手術(shù)方式和范圍的重要依據(jù)。由于冷凍切片技術(shù)、取材范圍有限和報(bào)告時(shí)間短等問(wèn)題，易導(dǎo)致病理醫(yī)師延遲診斷，甚至是誤診。高質(zhì)量的冷凍切片是病理醫(yī)師準(zhǔn)確發(fā)出術(shù)中快速病理診斷的基礎(chǔ)。筆者在臨床實(shí)踐操作中觀察到部分冷凍切片組織結(jié)構(gòu)扭曲、細(xì)胞擠壓變形，存在類(lèi)冰晶現(xiàn)象，而冰對(duì)組織石蠟切片中未見(jiàn)此類(lèi)現(xiàn)象。本實(shí)驗(yàn)旨在探討切片類(lèi)冰晶現(xiàn)象產(chǎn)生的原因及解決方法，以進(jìn)一步提高冷凍切片的質(zhì)量。

1 材料與方法

1.1 材料收集2020年8月廣東省人民醫(yī)院病理科行術(shù)中冷凍切片病理診斷標(biāo)本30例，包括甲狀腺、乳腺、肺、腦、肝臟、卵巢和淋巴結(jié)組織。

1.2 儀器與試劑德國(guó)Leica CM1960恒溫冷凍切片機(jī)，全自動(dòng)冷凍染色機(jī)，OCT冷凍包埋劑，電冷熱吹風(fēng)筒(1 kw)，冷甲醇50 mL，Lillie-Mayer蘇木精，水溶性伊紅Y，1%碳酸鋰溶液，耐確冷凍染色機(jī)NQ200S。

1.3 方法根據(jù)組織大小選取不同規(guī)格的夾頭，根據(jù)冷凍組織類(lèi)型設(shè)置箱體溫度，使組織保持合適的硬度。將樣本支持器平穩(wěn)放置在速凍臺(tái)上，滴加少許OCT包埋劑讓其硬化，將規(guī)范取材(厚度≤3 mm)的術(shù)中冷凍新鮮組織放在其表面，用OCT包埋膠完全包裹，組織變硬后即可切片，6～8 μm厚[1]。實(shí)驗(yàn)分成兩組：(1)人為冰晶組，新鮮組織塊浸泡于生理鹽水15 min后，不吸干水分直接冷凍切片。(2)實(shí)驗(yàn)組，新鮮組織用紙巾吸干表面水分后冷凍切片。2組病例均冷凍切片8張，分別進(jìn)行4種不同操作方法處理：A.切片后即刻入冷甲醇固定1 min后直接水洗，再行進(jìn)行性HE染色；B.切片后即刻入冷甲醇固定1 min后冷風(fēng)吹干20 s，水洗后行進(jìn)行性HE染色；C.切片分別室溫自然晾干1、2、4、8和16 min，入冷甲醇固定1 min，水洗后行進(jìn)行性HE染色；D.切片后冷風(fēng)吹干20 s后入冷甲醇固定1 min，水洗后行進(jìn)行性HE染色。冷凍組織切片后置于10%中性福爾馬林固定24～48 h，常規(guī)脫水、透明、浸蠟，包埋，4 μm厚切片，并行HE染色。

1.4 結(jié)果評(píng)估對(duì)切片整體、組織結(jié)構(gòu)、細(xì)胞形態(tài)、胞核染色質(zhì)及核質(zhì)比進(jìn)行評(píng)估。

2 結(jié)果

人為冰晶組冷凍切片經(jīng)4種方法處理后，HE切片中產(chǎn)生的冰晶無(wú)法消除(圖1、2)，冰對(duì)組織HE切片仍可見(jiàn)冰晶。

實(shí)驗(yàn)組新鮮組織冷凍切片后立即置于冷甲醇中固定(A和B法)，組織細(xì)胞均發(fā)生不同程度收縮，胞核深染，核質(zhì)比改變，間質(zhì)纖維收縮，特別是細(xì)胞稀疏、含水分多及間質(zhì)疏松的組織改變較明顯。乳腺導(dǎo)管細(xì)胞收縮明顯、重疊。肺泡間隔縮小、結(jié)構(gòu)變形。腦組織細(xì)胞間產(chǎn)生空洞、胞核深染扭曲。細(xì)胞豐富、含水分較少及間質(zhì)緊致的組織則改變不明顯。卵巢及甲狀腺胞核收縮，部分腺泡上皮細(xì)胞緊密，腺泡及腺泡間結(jié)構(gòu)尚佳。肝細(xì)胞核稍收縮，血管周?chē)伴g質(zhì)收縮。淋巴結(jié)淋巴細(xì)胞胞核略收縮、染色質(zhì)清晰。

實(shí)驗(yàn)組冷凍切片經(jīng)C法(自然晾干1、2、4、8和16 min)處理，晾干1、2 min冷凍切片細(xì)胞核結(jié)構(gòu)清晰，染色質(zhì)明顯，細(xì)胞形態(tài)正常，組織結(jié)構(gòu)未發(fā)生變形(圖3、4)；而晾干4、8、16 min冷凍切片細(xì)胞發(fā)生腫脹，核膜及染色質(zhì)淡染、模糊。實(shí)驗(yàn)組冷凍切片經(jīng)D法處理與C法室溫晾干4 min結(jié)果相似。

①②③④

3 討論

冷凍切片制片質(zhì)量不佳是術(shù)中快速病理診斷發(fā)生延遲和誤診的重要原因，如切片厚、脫水透明不佳、冰晶等[2-4]。冷凍切片的制作是新鮮組織不經(jīng)脫水、透明等處理，快速冷凍到一定硬度后進(jìn)行切片染色的過(guò)程。每一步驟均可對(duì)冷凍切片質(zhì)量產(chǎn)生影響，包括標(biāo)本送檢、取材(≤3 mm)、冷凍的溫度和速度、固定液選擇和固定時(shí)間等[1]，其中冰晶現(xiàn)象是臨床及科研工作中備受關(guān)注的問(wèn)題。

未固定的新鮮組織冷凍溫度下降緩慢，組織細(xì)胞的水分便會(huì)形成粗大冰晶，擠壓周?chē)募?xì)胞或間質(zhì)成分，影響組織細(xì)胞的形態(tài)結(jié)構(gòu)。筆者在實(shí)踐工作中也觀察到某些組織類(lèi)型的冷凍切片迅速固定后出現(xiàn)類(lèi)似冰晶現(xiàn)象，而在冰對(duì)組織石蠟切片中無(wú)此現(xiàn)象。馮家成等[5]報(bào)道腦組織冷凍切片立即置于固定液，切片呈網(wǎng)格狀，經(jīng)室溫放置2 min或電熱吹風(fēng)30 s后固定組織切片網(wǎng)格消失。傳統(tǒng)的觀念認(rèn)為及時(shí)固定是冷凍切片制作的第一要素，而作者觀察組織冷凍切片即刻固定后，均發(fā)生不同程度的細(xì)胞和間質(zhì)的收縮，特別在細(xì)胞稀疏、含水分多及間質(zhì)疏松的組織中更易發(fā)生細(xì)胞緊密重疊、細(xì)胞核變形，疏松結(jié)締組織收縮牽拉導(dǎo)致腺體及導(dǎo)管的扭曲和腺腔消失等；而在細(xì)胞豐富、含水分較少及間質(zhì)緊致的組織中類(lèi)冰晶現(xiàn)象較少見(jiàn)?！杜R床技術(shù)操作規(guī)范·病理學(xué)分冊(cè)》中提到冷凍切片貼附于載玻片后需稍干才置于固定液中，但無(wú)確切的干燥時(shí)間可供參考。本實(shí)驗(yàn)將冷凍切片分別于室溫干燥1、2、4、8和16 min置于冷甲醇中固定，發(fā)現(xiàn)室溫干燥1、2 min后，冷凍切片的類(lèi)冰晶現(xiàn)象得到改善，組織細(xì)胞的形態(tài)結(jié)構(gòu)接近于石蠟切片，而冷凍切片經(jīng)4、8、16 min室溫干燥后細(xì)胞均腫脹、變性且耗時(shí)過(guò)長(zhǎng)，無(wú)法滿足術(shù)中冷凍快速、準(zhǔn)確的要求。

術(shù)中快速病理診斷具有時(shí)限性(從取材到發(fā)出報(bào)告<30 min)，干燥時(shí)間過(guò)長(zhǎng)會(huì)延緩報(bào)告發(fā)出，影響臨床醫(yī)師及時(shí)為患者提供下一步治療。因電熱風(fēng)干燥處理會(huì)導(dǎo)致細(xì)胞的收縮、形態(tài)結(jié)構(gòu)的改變，應(yīng)考慮用冷風(fēng)加速冷凍切片的干燥速度。然而在冷風(fēng)干燥20 s后，冷凍切片出現(xiàn)細(xì)胞胞質(zhì)腫脹、胞核淡染、間質(zhì)增寬等變性表現(xiàn)。文獻(xiàn)報(bào)道[6]組織應(yīng)即刻固定，否則細(xì)胞不可避免的存在一定程度的破壞。本實(shí)驗(yàn)嘗試將冷凍切片即刻固定于冷甲醇1 min后，再使用冷風(fēng)干燥20 s，發(fā)現(xiàn)其并不能改善類(lèi)冰晶現(xiàn)象。

為了觀察冷凍切片中的真冰晶是否可通過(guò)室溫或者冷風(fēng)干燥的方式消除，本實(shí)驗(yàn)將新鮮組織浸泡于生理鹽水15 min，使大量水分子進(jìn)入組織，人為地造成冷凍切片冰晶效果。其冷凍切片的大量冰晶經(jīng)室溫干燥1、2、4、8、16 min及冷風(fēng)干燥20 s后，仍可見(jiàn)大量空洞、間質(zhì)及細(xì)胞擠壓的現(xiàn)象，結(jié)果提示組織在發(fā)生冰晶后難以恢復(fù)其正常的結(jié)構(gòu)及細(xì)胞形態(tài)。

新鮮組織經(jīng)過(guò)急速冷凍，如貼片后即刻放入固定液，組織中細(xì)胞及結(jié)締組織仍保持收縮狀態(tài)，特別是細(xì)胞稀疏、含水分多及間質(zhì)疏松的組織收縮程度更明顯。通過(guò)熱脹冷縮的原理，本實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)冷凍切片在室溫干燥1、2 min時(shí)，收縮狀態(tài)的組織細(xì)胞逐漸恢復(fù)正常形態(tài)結(jié)構(gòu)，減少或避免了細(xì)胞形態(tài)扭曲、胞核變形和組織結(jié)構(gòu)的變化，更好地體現(xiàn)組織細(xì)胞的生活狀態(tài)，有利于病理醫(yī)師發(fā)出準(zhǔn)確的術(shù)中快速病理診斷報(bào)告。