特發(fā)性膜性腎病79例臨床病理特征及預(yù)后分析

邱明珠，付曉宇，曾也婷，劉慶宏，齊興峰，李 敏，余英豪，曲利娟，鄭智勇

膜性腎病是導(dǎo)致成人腎病綜合征(nephrotic syndrome, NS)的常見病理類型[1]，根據(jù)病因分類：特發(fā)性膜性腎病(idiopathic membranous nephropathy, IMN)占70%～80%，其余為繼發(fā)性膜性腎病(secondary membranous nephropathy, SMN)及不典型膜性腎病(atypical membranous nephropathy, AMN)[2]。IMN的病程具有異質(zhì)性，當(dāng)前的研究重點是早期發(fā)現(xiàn)預(yù)后不良患者并給予積極治療。近年，關(guān)于IMN疾病進展預(yù)測指標(biāo)報道較多[3-8]，但缺乏早期階段具有預(yù)測價值的病理指標(biāo)。本文著重探討IMN的臨床病理學(xué)特征，分析其與預(yù)后的關(guān)系及臨床意義。

1 材料與方法

1.1 材料收集2014年6月～2017年9月中國人民解放軍聯(lián)勤保障部隊第900醫(yī)院病理科腎穿刺標(biāo)本中確診的79例IMN，對照組SMN 29例(狼瘡性腎炎Ⅴ型20例，乙型肝炎病毒相關(guān)性腎炎膜性腎病型9例)，正常對照組15例(外傷性腎切除標(biāo)本正常腎組織)。腎小球數(shù)目≥8個，均有完整的臨床資料，包括患者性別、年齡、發(fā)病至腎穿刺時的病程、臨床診斷、血壓、24 h尿蛋白、鏡下血尿、血清白蛋白(sALB)、血清肌酐(sCr)、尿素氮(BUN)、血清學(xué)IgG及估計腎小球濾過率(estimated glomerular filtration rate, eGFR)。本實驗經(jīng)解放軍聯(lián)勤保障部隊第900醫(yī)院倫理委員會批準(zhǔn)，患者均知情同意。

1.2 方法標(biāo)本均行HE、PAS、PASM-Masson染色，免疫組化檢測指標(biāo)有PLA2R、IgG、IgG1、IgG2、IgG3、IgG4、IgA、IgM、C3d、C4d、C1q、HBsAg、HBcAg，采用透射電鏡(transmission electron microscopy, TEM)觀察(HITACHI，型號HT7700)；隨機抽取5例PLA2R/IgG4的多角形蛋白塊(polygonal protein blocks co-expressed by PLA2R/IgG4, PPBCPI)行鼠抗IgG4/兔抗WT1免疫組化雙標(biāo)檢測?？贵w：PLA2R(SIGMA公司)、IgG(DAKO公司)、IgG2(EPITMICS公司)、IgG3(Abcam公司)、IgG4(福州邁新公司)、IgG1、WT1(北京中杉金橋公司)；免疫組化EliVision試劑盒和免疫組化雙標(biāo)試劑盒(KIT-8801/8802)，均購自福州邁新公司。

1.3 病理診斷標(biāo)準(zhǔn)按2016年ISN/RPS增生性腎小球腎炎病理分型[9]及Ehrenreich-Churg膜性腎病分期標(biāo)準(zhǔn)診斷。腎小管萎縮/間質(zhì)纖維化(tubulointerstitial lesions, TIL)按病變范圍評分：≤5%為0分、6%～25%為1分、26%～50%為2分、>50%為3分。本組IMN定義為：腎小球基膜上免疫復(fù)合物IgG呈細(xì)顆粒狀沉積伴基膜增厚，排除繼發(fā)性因素，如系統(tǒng)性紅斑狼瘡、慢性感染、惡性腫瘤或藥物等。PPBCPI陽性定義：出現(xiàn)于腎小球小葉間的多突起蛋白塊，并同時表達(dá)PLA2R與IgG4；PPBCPI數(shù)量≥1個判為陽性。根據(jù)是否存在PPBCPI，將IMN分為：PPBCPI陽性的IMN為PPBCPI-IMN組，而PPBCPI陰性者為非PPBCPI-IMN組。

1.4 病理評分標(biāo)準(zhǔn)免疫組化PPBCPI評分：腎小球中PPBCPI陽性的平均數(shù)目，無為0分，1～5個為1分，6～10個為2分，>10個為3分。TEM足細(xì)胞病變評分：(1)根據(jù)預(yù)實驗觀察結(jié)果，設(shè)定病變明顯的四項指標(biāo)為線粒體腫脹、空泡變性、脂滴及細(xì)胞膜破損；無病變?yōu)殛幮裕胁∽優(yōu)殛栃浴?2)自噬溶酶體計數(shù)[10]：按每個病例5～10個足細(xì)胞自噬溶酶體的平均數(shù)目計數(shù)。

1.5 療效及隨訪本組臨床治療方案：糖皮質(zhì)激素+免疫抑制劑+對癥治療，根據(jù)2012年改善全球腎臟病預(yù)后組織(KDIGO)指南進行判斷。(1)完全緩解：24 h尿蛋白<0.3 g，sALB>35 g/L及sCr正常(<133.0 μmol/L)。(2)部分緩解：24 h尿蛋白0.3～3.5 g，sCr水平穩(wěn)定(波動范圍<15%)。(3)無效：治療后未達(dá)上述指標(biāo)。(4)復(fù)發(fā)：完全或部分緩解至少1個月后，24 h尿蛋白>3.5 g。腎活檢后按月記錄隨訪時間，通過門診、電話等方式進行追蹤隨訪，以eGFR降低>30%或進入終末期腎臟疾病(end-stage renal disease, ESRD)或患者死亡為終點，隨訪截至2020年9月5日。

2 結(jié)果

2.1 IMN與SMN免疫病理對比79例IMN免疫病理表現(xiàn)為腎小球毛細(xì)血管襻臟層上皮下免疫復(fù)合物呈細(xì)顆粒沉積伴基膜增厚，而29例SMN還伴系膜區(qū)免疫沉積及系膜細(xì)胞、內(nèi)皮細(xì)胞增生等。IMN組血管襻上PLA2R、IgG4的陽性率均高于SMN組(93.67%vs22.41%、69.62%vs27.59%)，而血管襻IgG1、系膜區(qū)IgA及C1q陽性率均低于SMN組(59.49%vs86.21%、16.46%vs48.28%、45.57%vs92.31%)，差異均有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05)。兩組間IgG、IgG2、IgG3、IgM、C3d、C4d的陽性率，差異均無統(tǒng)計學(xué)意義(P>0.05)。正常對照組除了腎小球系膜區(qū)有少量IgM和C3d沉積外，無IgG、IgA、C4d、C1q等沉積，無血管襻陽性。

2.2 PPBCPI免疫病理特點與足細(xì)胞的關(guān)系PASM-Masson染顯示，55例IMN(69.62%)腎組織除了免疫復(fù)合物沉積于增厚的腎小球基膜外，腎小球小葉之間可見少量紅染的PPBCPI(圖1)。PLA2R標(biāo)記PPBCPI呈強陽性，腎小球毛細(xì)血管襻弱陽性(圖2)。IgG亞型標(biāo)記腎小球小葉間的PPBCPI陽性，血管襻為弱陽性，如IgG1(圖3)及IgG4(圖4)，而IgM、IgA、C3d、C4d及C1q標(biāo)記該物質(zhì)均陰性。SMN組及正常對照組無PPBCPI特征。79例IMN分為55例PPBCPI-IMN(69.62%)和24例非PPBCPI-IMN(30.38%) 。55例PPBCPI-IMN組中的PPBCPI不同程度表達(dá)IgG及亞型，IgG4的陽性率與陽性強度最高(表1)。

①②③④⑤⑥⑦⑧⑨⑩

表1 PPBCPI-IMN中PPBCPI免疫表型

PPBCPI-IMN免疫組化雙染(IgG4/WT-1)顯示，疏松的PPBCPI(IgG4陽性紅色)位于腎小球小葉間，不與足細(xì)胞(WT-1核陽性)直接相連；部分足細(xì)胞胞質(zhì)呈IgG4弱陽性(圖5、6)。

2.3 TEM觀察足細(xì)胞病變TEM檢查顯示，79例IMN中53例標(biāo)本可見腎小球(3～6個)，其中34例PPBCPI-IMN，19例非PPBCPI-IMN。兩組TEM下均可見足突融合及微絨毛變性；PPBCPI-IMN的足細(xì)胞線粒體腫脹(圖7)、空泡變性、脂滴及細(xì)胞膜破損(圖8)的病變陽性率明顯高于非PPBCPI-IMN(圖9)，差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05，表2)。兩組間自噬溶酶體數(shù)量的比較，差異無統(tǒng)計學(xué)意義(P>0.05，表2)。正常對照組15例，均無足突融合、線粒體腫脹、空泡變性、脂滴、細(xì)胞膜破損等病變(圖10)。

表2 PPBCPI-IMN與非PPBCPI-IMN的足細(xì)胞病變比較

2.4 IMN臨床資料的基線特征79例IMN患者，男性56例(70.89%)，女性23例(29.11%)，平均年齡52歲；膜性早期組53例，中晚期組26例，TIL平均0.52分。PPBCPI-IMN組Ⅰ期39例(70.91%)，非PPBCPI-IMN組Ⅰ期14例(58.33%)。PPBCPI-IMN與非PPBCPI-IMN 組間主要臨床病理資料統(tǒng)計分析顯示，PPBCPI-IMN組NS的發(fā)生率高于非PPBCPI-IMN(90.91%vs70.83%)，差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05，表3)；而其他指標(biāo)無統(tǒng)計學(xué)差異。

表3 IMN臨床資料的基線特征

2.5 生存分析79例IMN中有2例失訪，其余77例隨訪12～75個月，截至2020年9月5日，25例IMN出現(xiàn)腎功能不全且eGFR降低>30%，其中2例進入ESRD，4例肺栓塞死亡。IMN患者3、5年腎臟無瘤生存率(即不出現(xiàn)eGFR降低>30%或ESRD或死亡)分別為90.91%與72.73%(圖11)。比較PPBCPI-IMN與非PPBCPI-IMN兩組的療效，前者的治療緩解率低于后者(55.8%vs82.6%)，差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P=0.036)。腎臟生存分析顯示，PPBCPI-IMN疾病進展的風(fēng)險高于非PPBCPI-IMN(Log-rank：P=0.002，圖12)。79例IMN肺栓塞的發(fā)生率為5.06%；PPBCPI-IMN組肺栓塞的發(fā)生率為7.27%(4例)，非PPBCPI-IMN組肺栓塞的發(fā)生率為0，差異無統(tǒng)計學(xué)意義(P=0.308)。

圖11 IMN腎臟無瘤生存率(Kaplan-Meier曲線)

圖12 PPBCPI-IMN與非PPBCPI-IMN的生存分析(Kaplan-Meier曲線)

2.6 IMN多因素分析多因素Cox比例風(fēng)險回歸預(yù)后分析顯示，本組中獨立影響IMN疾病進展的變量：病理分期(HR=5.257，P=0.043)、eGFR(HR=0.855，P=0.002)、PPBCPI(HR=1.516，P=0.009，表4)。PPBCPI預(yù)測腎臟進展的ROC曲線面積為0.675(P=0.021)，敏感度為95.0%，特異性為40.0%(P=0.021，圖13)。

表4 IMN腎臟的多因素Cox風(fēng)險分析

圖13 PPBCPI預(yù)測腎臟進展的ROC曲線

3 討論

近年，足細(xì)胞自身抗原PLA2R、1型血小板反應(yīng)蛋白7A域(thrombospondin type-1 domain-containing7A, THSD7A)的發(fā)現(xiàn)與深入分析，對確診IMN起關(guān)鍵作用[11-12]。多數(shù)研究顯示，IMN中PLA2R占70%以上，而THSD7A占3%～5%，還有其他一些新抗原[13]。PLA2R聯(lián)合IgG4高特異性(96.4%)識別IMN，PLA2R與IgG4在腎小球毛細(xì)血管襻上共表達(dá)是IMN的免疫病理診斷依據(jù)[14-17]。IMN的病程具有異質(zhì)性，約1/3的患者可自發(fā)緩解，約1/3的患者10年后可進展為ESRD。單克隆抗體(如利妥昔單抗)被推薦用于IMN的治療，特別對于易發(fā)展為ESRD的高?；颊?，美國腎臟病學(xué)會推薦進行一線治療[18]，對臨床醫(yī)師盡早發(fā)現(xiàn)高?；颊咛岢隽烁叩囊?。

本實驗發(fā)現(xiàn)IMN除了腎小球毛細(xì)血管襻上PLA2R與IgG4共表達(dá)外，69.62%的病例于腎小球小葉間還存在PPBCPI免疫病理特征，查閱文獻未見類似報道，本文為首次報道。本實驗免疫組化雙染結(jié)果顯示，PPBCPI-IMN的足細(xì)胞胞質(zhì)和PPBCPI均呈IgG4陽性，其中足細(xì)胞胞質(zhì)表達(dá)較弱，PPBCPI表達(dá)較強；推測PPBCPI物質(zhì)可能是IMN自身抗體攻擊損傷足細(xì)胞胞體及足突后，退變、脫落、融合形成的蛋白團塊。PPBCPI免疫表型顯示PLA2R、IgG及其亞型不同程度陽性，顯示其共表達(dá)的特點；而IgA、IgM、C3d、C4d和C1q均陰性，提示無激活補體系統(tǒng)。Meyer-Schwesinger等[19]在IMN轉(zhuǎn)基因小鼠中發(fā)現(xiàn)足細(xì)胞損傷；本實驗TEM顯示PPBCPI-IMN足細(xì)胞的線粒體腫脹、空泡變性、脂滴及細(xì)胞膜破損陽性率高于非PPBCPI-IMN，差異具有統(tǒng)計學(xué)意義。PPBCPI-IMN與非PPBCPI-IMN之間存在足細(xì)胞超微結(jié)構(gòu)病變的差異，可能是特異性抗體與足細(xì)胞結(jié)合后引起的細(xì)胞膜和細(xì)胞器損害不同所致，而其機制有待進一步分析。

臨床病理資料分析顯示，PPBCPI-IMN組的NS出現(xiàn)率高于非PPBCPI-IMN組(90.91%vs70.83%)，差異有統(tǒng)計學(xué)意義。NS是IMN主要的臨床表現(xiàn)，也是導(dǎo)致腎功能損害的重要因素。因此，出現(xiàn)NS往往提示其預(yù)后不良。對于IMN具有NS且易發(fā)展為ESRD的高?；颊?，美國腎臟病學(xué)會推薦利妥昔單抗作為一線治療，但我國此應(yīng)用尚處于起步階段，本組未采用該治療方案，具有PPBCPI特征的IMN患者對其治療反應(yīng)有待進一步分析。此外，IMN組肺栓塞的發(fā)生率為5.06%，與文獻報道相近[20]。

本組77例IMN隨訪12～75個月，其3、5年腎臟無進展生存率分別為90.91%、72.73%，與文獻報道相近。PPBCPI-IMN組的治療緩解率低于非PPBCPI-IMN組(55.8%vs82.6%)，差異有統(tǒng)計學(xué)意義。兩組腎臟無進展生存率比較，PPBCPI-IMN疾病進展的風(fēng)險高于非PPBCPI-IMN(Log-rank：P=0.002)。一些研究認(rèn)為，持續(xù)性高蛋白尿、血清PLA2R抗體滴度高、eGFR降低、病理分期晚以及嚴(yán)重的TIL等是IMN的獨立危險因子[5-10]，但早期階段具有預(yù)測價值的病理指標(biāo)缺乏。本實驗多因素分析顯示PPBCPI為IMN疾病進展的獨立影響變量，其ROC曲線下面積為0.675，敏感性為95.0%，特異性為40.0%。PPBCPI-IMN組中以早期病例為主(70.91%)，即出現(xiàn)PPBCPI的IMN病例大多數(shù)為疾病早期階段，提示PPBCPI可作為IMN早期階段的獨立預(yù)后指標(biāo)。本實驗ROC曲線特異性較低，存在一定的局限性，有待大樣本數(shù)據(jù)或多中心研究進一步證實。

綜上所述，IMN部分患者腎小球小葉間存在PPBCPI免疫病理特征，大多數(shù)為早期病例，多因素分析顯示其為IMN疾病進展的獨立影響變量。因此，PPBCPI可作為IMN疾病早期階段的獨立預(yù)后指標(biāo)。具有PPBCPI病理特征的IMN患者其腎臟疾病進展風(fēng)險較高，可采取積極的治療方案或者單克隆抗體治療。