不同染色條件對COVID-19 Nucleocapsid抗體免疫組化染色的比較

吉佳樂，林 爽，曾 暉，姚馨悅，李 楊，何志承

新型冠狀病毒肺炎(coronavirus disease 2019, COVID-19)是一種由新型冠狀病毒(severe acute respiratory syndrome coronavirus 2, SARS-CoV-2)引發(fā)的強傳染性疾病，其通過呼吸道飛沫、氣溶膠及攜帶病毒的分泌物進行傳播。此外，無癥狀感染者也可能成為傳染源，給全球尤其是老人、有基礎(chǔ)性疾病的患者帶來了嚴重的健康危機。因此，該病的防控和治療至關(guān)重要?；颊咴诟腥綜OVID-19后期，部分組織器官可能會引發(fā)一系列復(fù)雜的生理變化和病理學(xué)癥狀[1]。姚小紅等[2]研究表明：COVID-19病變主要以肺部病變最明顯，免疫組化提示肺泡上皮細胞和巨噬細胞均存在COVID-19抗原表達，其還對腎臟、肝臟、心血管等其他臟器也有影響。免疫組化是病理診斷的重要輔助手段，可以幫助病理醫(yī)師在診斷過程中明確組織中抗原的表達位置及陽性細胞比例，并對其進行定位、定性及定量的研究[3]。因此，免疫組化在臨床病理診斷中不可替代，在COVID-19病理尸檢工作中也發(fā)揮重要作用。由于Nucleocapsid是COVID-19新研發(fā)抗體，暫無相關(guān)文獻報道，試劑盒說明書建議Western blot實驗中一抗稀釋濃度為1 ∶1 000～1 ∶5 000；酶聯(lián)免疫吸附實驗中一抗稀釋濃度為1 ∶5 000～1 ∶10 000；但對免疫組化的稀釋濃度及孵育條件無明確建議。本文現(xiàn)收集8例COVID-19尸檢肺組織標(biāo)本，分別使用全自動免疫組化染色儀和手工免疫組化進行染色，探討其在不同操作條件下的免疫組化染色情況，以便得到定位準(zhǔn)確、背景清晰的染色切片，更好地為COVID-19的病理診斷和臨床治療提供參考。

1 材料與方法

1.1 臨床資料收集2020年3～6月陸軍軍醫(yī)大學(xué)第一附屬醫(yī)院病理科8例COVID-19尸檢石蠟包埋組織，以2.5 μm厚連續(xù)切片15張，85 ℃烤片30 min備用[4]。將COVID-19的Nucleocapsid抗體，分別按1 ∶2 000、1 ∶4 000、1 ∶8 000的比例進行稀釋備用。

1.2 主要試劑及儀器COVID-19的Nucleocapsid(40143-R019)抗體，購自北京義翹神州公司。EDTA修復(fù)液和檸檬酸修復(fù)液(MVS-0100)，均購自福州邁新公司。OptiView DAB IHC Detection Kit和Roche BenchMark全自動免疫組化染色機，購自美國Ventana公司。

1.3 HE染色及免疫組化

1.3.1HE染色 將備好的組織切片進行HE染色，具體流程如下：將切片脫蠟、脫水，蘇木精染色 5 min，1%鹽酸酒精分化數(shù)秒，1%氨水返藍 2 min，水洗后再用伊紅染色 1 min，切片經(jīng)脫水、透明、封固，光鏡下觀察。

1.3.2全自動免疫組化儀染色 將備好的組織切片放入Roche BenchMark XT全自動免疫組化染色儀中，設(shè)定相應(yīng)程序進行染色。程序設(shè)定如下：75 ℃條件下烤片4 min；EZ Prep溶液76 ℃脫蠟4 min；Cell Conditioning Solution(CC1)抗原修復(fù)液99 ℃修復(fù)36 min；抑制劑孵育45 min；加入一抗100 μL，36 ℃孵育32 min；Reaction Buffer Concentrate(10×)緩沖液清洗5 min；二抗37 ℃孵育8 min；DAB顯色8 min，蘇木精II襯染12 min，返藍液返藍4 min，脫水、透明、封固。

1.3.3手工免疫組化染色 組織切片經(jīng)二甲苯-二甲苯-100%乙醇-100%乙醇-95%乙醇-75%乙醇常規(guī)脫蠟、水化、蒸餾水浸泡。采用高溫高壓修復(fù)，用檸檬酸(或EDTA)修復(fù)液修復(fù)2.5 min。自然冷卻后置于3%H2O2中，37 ℃ 10 min，PBS沖洗3 min×3次。加入一抗，4 ℃孵育過夜(或37 ℃孵育1 h )，PBS沖洗3 min×3次；加入二抗，37 ℃孵育30 min，PBS沖洗3 min×3次。DAB顯色，蘇木精復(fù)染3 min，酸化后返藍、脫水、透明、封固。

1.4 透射電鏡掃描和COVID-19核酸檢測將標(biāo)本制備成厚度為100 nm的超薄切片，染色后用透射電子顯微鏡(日立HT7700，電壓 100 kV)觀察超微結(jié)構(gòu)變化。提取的檢測標(biāo)本RNA用RT-PCR試劑盒(8.0131901X024E，廈門艾德生物公司)進行核酸檢測。透射電鏡掃描、核酸檢測與免疫組化檢測，均來自同一例尸檢的肺組織標(biāo)本。

2 結(jié)果

2.1 HE染色HE染色結(jié)果清晰可見肺泡上皮稍增生，肺泡腔內(nèi)可見分泌物及出血，肺泡間隔增寬，纖維組織增生并見少量中性粒細胞浸潤(圖1A)。

2.2 全自動免疫組化染色儀最佳染色條件本科室采用Roch BenchMark全自動免疫組化染色平臺，設(shè)置不同一抗?jié)舛葹? ∶2 000、1 ∶4 000、1 ∶8 000和陰性對照的4個組別。結(jié)果顯示：陰性對照組的組織待檢細胞無陽性信號(圖1B)，提示COVID-19的Nucleocapsid抗體表達有特異性。在不同濃度的一抗中發(fā)現(xiàn)COVID-19的Nucleocapsid 抗體在肺泡Ⅱ型上皮細胞均呈陽性。其中，稀釋比為1 ∶2 000(圖1C)和1 ∶4 000(圖1D)組的非特異性著色較為明顯，稀釋比為1 ∶8 000組陽性細胞染色更加清晰，特異性較高(圖1E)；高倍鏡下視野可清晰觀察到肺泡Ⅱ型上皮細胞呈陽性(圖1F)。以上結(jié)果提示：全自動免疫組化染色儀檢測COVID-19的Nucleocapsid抗體，按稀釋比為1 ∶8 000可取得較好的染色效果。

ABCDEF

2.3 手工免疫組化最佳染色條件在進行手工免疫組化染色時，本組分別設(shè)置了不同的抗原修復(fù)條件、抗體孵育方式及一抗?jié)舛?。結(jié)果顯示采用EDTA對抗原進行修復(fù)后，陽性細胞的著色強度明顯高于檸檬酸修復(fù)，但其特異性較差，陽性著色部位不夠明確。進一步通過不同方式進行一抗孵育，結(jié)果顯示一抗4 ℃孵育過夜的染色效果優(yōu)于37 ℃孵育1 h，其非特異性著色相對較少。在不同一抗?jié)舛炔町惙治鲋邪l(fā)現(xiàn)，組織非特異性著色隨著一抗稀釋比的增加而逐漸降低，但是一抗1 ∶8 000稀釋濃度未見陽性信號。因此，推薦采用1 ∶4 000的一抗稀釋濃度。此外，陰性對照組無陽性信號。根據(jù)不同染色條件結(jié)果顯示：手工免疫組化染色檢測COVID-19的Nucleocapsid抗體時，最佳染色條件為檸檬酸修復(fù)、一抗4 ℃過夜孵育、一抗稀釋比為1 ∶4 000(圖2)。

ABCDEFGH

2.4 透射電鏡掃描和COVID-19核酸檢測將8例COVID-19尸檢組織分別使用電鏡掃描和核酸檢測對免疫組化染色結(jié)果進行驗證，發(fā)現(xiàn)病毒顆粒和PCR檢測病毒陽性(圖3)，提示待檢樣本染色陽性的可靠性。

圖3 透射電鏡掃描和COVID-19核酸檢測：A.透射電鏡掃描顯示肺組織內(nèi)有病毒顆粒；B.COVID-19核酸檢測為COVID-19陽性；紅色是HEX通道，顯示內(nèi)參基因；藍色是ROX通道，顯示COVID-19開放閱讀框1 ab基因的保守區(qū)域；綠色是FAM通道，顯示COVID-19衣殼蛋白基因的保守區(qū)域

3 討論

COVID-19具有高度傳染性，其周期性大暴發(fā)及國際性傳播對全球的公共衛(wèi)生和經(jīng)濟發(fā)展構(gòu)成重大的威脅，有效的防控和治療至關(guān)重要。Bian等[5]研究發(fā)現(xiàn)：患者感染SARS-CoV-2后，將導(dǎo)致多處器官和組織受損傷，并伴明顯的肺部病變。Yao等[6]通過電鏡在肺Ⅱ型上皮細胞內(nèi)發(fā)現(xiàn)直徑為70～100 nm的新型冠狀病毒顆粒，肺部組織切片經(jīng)免疫組化染色后也證實在肺組織中存在SARS-CoV-2病毒。免疫組化是指利用抗原抗體特異性結(jié)合的原理，通過化學(xué)反應(yīng)使標(biāo)記抗體的顯色劑(如熒光素、酶、金屬離子和同位素)顯色，以確定組織細胞內(nèi)的抗原，并對其進行定位、定性及半定量的研究[7]。高質(zhì)量的免疫組化染色效果更有利于結(jié)果的判讀，對推進COVID-19病理機制的研究具有重要意義。免疫組化染色過程中的切片制備、抗原修復(fù)、抗體濃度及孵育條件、顯色等各個環(huán)節(jié)均可能影響最終的結(jié)果，故探索其最優(yōu)染色條件至關(guān)重要。

研究報道[8]，由于COVID-19標(biāo)本的特殊性，固定時間以48 h最佳，病毒標(biāo)本必須間隔1 cm切開，并使用5～10倍固定液充分固定后再進行后續(xù)實驗。此外，在切片制備過程中，要根據(jù)標(biāo)本的類型選擇合適的厚度。本組選用的是肺組織標(biāo)本，切片過薄容易丟失部分抗原信號，過厚容易出現(xiàn)細胞堆積導(dǎo)致染色過深影響判讀，且在高溫高壓抗原修復(fù)時容易掉片，故應(yīng)選擇適宜的厚度(3 μm)進行切片。烤片時溫度不高于70 ℃，同時保持切片干燥，有利于組織和撥片充分粘合。由于前期經(jīng)10%中性福爾馬林固定形成醛鍵，遮蔽抗原決定簇，干擾抗原與抗體的特異性結(jié)合，行免疫組化染色時需進行抗原修復(fù)，使抗原決定簇充分暴露[9]；但修復(fù)方式和修復(fù)液選擇不當(dāng)，均可能出現(xiàn)假陽性或假陰性。劉智等[10]研究證實，高溫高壓修復(fù)優(yōu)于微波抗原修復(fù)，而檸檬酸(pH 6.0)和EDTA(pH 9.0)兩種不同修復(fù)液也會影響免疫組化染色結(jié)果。因此，需要進行預(yù)實驗對COVID-19的Nucleocapsid抗體最佳修復(fù)方式進行摸索。為去除細胞中殘留的雜蛋白、內(nèi)源性酶等，常使用過氧化物酶封閉液破壞酶活性，避免非特異性著色[11]。本實驗結(jié)果提示：相同修復(fù)條件下使用同濃度抗體進行檢測時，全自動免疫組化染色儀的染色效果優(yōu)于手工免疫組化，特異性著色也相對較少，原因可能是Roche BenchMark全自動染色儀采用噴射式清洗技術(shù)，可均勻徹底的清洗切片，使染色背景更干凈，染色結(jié)果更為清晰。此外，抗原抗體特異性結(jié)合達到平衡終點需要一定的溫度、時間和濃度，故探討抗體的孵育時間、溫度和一抗?jié)舛纫仓陵P(guān)重要。研究證明[12]：陽性細胞強度隨一抗孵育溫度升高而增強，但陽性細胞數(shù)量與孵育溫度無直接關(guān)系，溫度過高反而會降低抗原抗體結(jié)合效率。本實驗結(jié)果顯示，一抗4 ℃過夜孵育的染色質(zhì)量優(yōu)于37 ℃ 孵育1 h的染色質(zhì)量，其染色清晰、著色均勻、特異性更高，提示手工免疫組化染色經(jīng)4 ℃孵育更有利于抗原抗體的有效結(jié)合。本實驗還發(fā)現(xiàn)全自動免疫組化染色儀和手工免疫組化染色的抗體特異性，均隨著一抗?jié)舛鹊脑黾佣档停瑑烧咦罴讶旧珴舛确謩e為1 ∶8 000和1 ∶4 000，提示抗原抗體結(jié)合不僅受外界環(huán)境的影響，而且與抗體自身的濃度也顯著相關(guān)，濃度太高或太低，都會影響抗原抗體的結(jié)合反應(yīng)。除一抗?jié)舛韧猓沟南♂尡壤惋@色時間對染色結(jié)果也至關(guān)重要，二抗?jié)舛冗^高或顯示時間過長，均會出現(xiàn)著色較深、非特異性著色增加的現(xiàn)象。因此，對于新抗體一定要摸索出最佳染色條件后再進行實驗，以得到更為優(yōu)化、準(zhǔn)確的結(jié)果。

隨著越來越多新型抗體的出現(xiàn)，免疫組化染色結(jié)果在病理診斷、預(yù)后判斷、指導(dǎo)治療等方面發(fā)揮重要作用。在全球COVID-19暴發(fā)的特殊時期，準(zhǔn)確的組織病理學(xué)診斷結(jié)果將有助于學(xué)者對該病毒感染機制的進一步分析，為后期疫苗和臨床治療藥物的研發(fā)、診治方案優(yōu)化提供科學(xué)依據(jù)。因此，制作一張高質(zhì)量的免疫組化染色切片也將為COVID-19的研究和臨床診斷治療提供必要的參考。