Klotho基因在神經(jīng)變性病中的研究進(jìn)展

徐敏，葉民

1997年日本學(xué)者Kuro-O等[1]在進(jìn)行自發(fā)型高血壓的相關(guān)性研究時(shí)偶然發(fā)現(xiàn)一種新型基因，經(jīng)過一系列的實(shí)驗(yàn)證實(shí)其與衰老有關(guān)，缺失這種基因的小鼠會(huì)出現(xiàn)壽命縮短、動(dòng)脈硬化、皮膚肌肉萎縮、認(rèn)知障礙、運(yùn)動(dòng)神經(jīng)元受損等癥狀。之后Kuro-O等[1]便采用古希臘神話中紡織生命之線的女神名字——Klotho(Kl)命名此基因。

小鼠的Kl基因轉(zhuǎn)錄產(chǎn)物約5.2 kb，長(zhǎng)度與人類相似。Kl根據(jù)選擇性剪切產(chǎn)物轉(zhuǎn)錄為跨膜型和分泌型Kl蛋白，其中分泌型的表達(dá)量明顯高于跨膜型?？缒ば蚄l蛋白全長(zhǎng)有1 024個(gè)氨基酸殘基，包含N末端信號(hào)序列、胞外區(qū)域、單跨膜螺旋區(qū)域和短胞內(nèi)區(qū)域。胞外區(qū)域又分為重復(fù)序列Kl1和Kl2。而分泌型Kl蛋白無Kl2、跨膜區(qū)域和細(xì)胞內(nèi)區(qū)域，僅編碼Kl基因N末端一半的區(qū)域，約550個(gè)氨基酸。

Kl蛋白具有多種生物學(xué)活性，一方面跨膜型Kl蛋白可與成纖維細(xì)胞生長(zhǎng)因子受體(FGFR)作為FGF23的共受體，介導(dǎo)FGF23的生物學(xué)活性[2];另一方面分泌型Kl蛋白有抵抗氧化應(yīng)激、抑制細(xì)胞炎癥和凋亡[3-6]、促進(jìn)血管發(fā)生[7-8]等作用。近來研究[9]發(fā)現(xiàn)，Kl基因的一種功能性單倍型(Kl-VS)，能改變細(xì)胞Kl蛋白的分泌及功能，它由兩個(gè)非同義變異體rs9536314(R352V)和rs9527025(C370S)組成，Kl-VS雜合子(Kl-VSHET+)與血清Kl水平升高相關(guān)，而Kl-VS純合子則與Kl血清水平降低相關(guān)。

以往研究[1]認(rèn)為Kl基因在腎臟遠(yuǎn)曲小管和大腦脈絡(luò)叢中的表達(dá)最高，其次是腦、甲狀旁腺、胰腺、卵巢、睪丸等，最近的研究[10]發(fā)現(xiàn)，Kl基因敲除小鼠的神經(jīng)變性程度會(huì)明顯增加，主要包括膽堿能功能改變、多巴胺能神經(jīng)元和海馬神經(jīng)元減少、浦肯野細(xì)胞減少以及氧化應(yīng)激升高等。關(guān)于Kl在CNS中具體發(fā)揮的作用、作用機(jī)制無統(tǒng)一定論，Kl與神經(jīng)病學(xué)尤其是神經(jīng)變性疾病的關(guān)系受到國(guó)內(nèi)外專家學(xué)者越來越多的重視，特別是Alzheimer’s病(AD)和帕金森病。因此，本文就目前國(guó)內(nèi)外對(duì)Kl與神經(jīng)變性病關(guān)系的研究進(jìn)行總結(jié)，希望能使更多的同仁認(rèn)識(shí)到Kl基因的重要性，為治療神經(jīng)變性病提供新的思路。

1 Kl與AD

AD是一種發(fā)生在老年和老年前期、以進(jìn)行性認(rèn)知功能障礙為特征的神經(jīng)系統(tǒng)變性疾病。臨床上通常表現(xiàn)為記憶障礙、失語、失用、人格和行為改變等。其病理學(xué)上的典型改變?yōu)棣碌矸蹣游镔|(zhì)(Aβ)在神經(jīng)細(xì)胞外沉積形成的神經(jīng)炎性斑和過度磷酸化的tau蛋白在神經(jīng)細(xì)胞內(nèi)聚集形成的神經(jīng)原纖維纏結(jié)。

1.1 表現(xiàn)形式Kl基因在大腦皮質(zhì)和海馬神經(jīng)元中廣泛表達(dá)，隨著年齡增長(zhǎng)蛋白濃度逐年降低，Kl聯(lián)系著學(xué)習(xí)和記憶功能，過表達(dá)Kl的個(gè)體具有認(rèn)知下降較慢、執(zhí)行功能更好的表現(xiàn)。Massó[11]早前比較過攜帶家族性AD突變基因PS1/M146V、AβPPSwe和tauP301L的3xTg-AD模型小鼠與健康對(duì)照小鼠在不同月齡時(shí)分泌的Kl蛋白水平，發(fā)現(xiàn)隨著年齡的增長(zhǎng)兩種小鼠的Kl蛋白水平在前額葉皮質(zhì)、大腦皮質(zhì)、海馬中均有下降，3xTg-AD小鼠下降則更明顯，18個(gè)月與6個(gè)月相比各區(qū)中分別降低了41%、49%、63%，這再次證明Kl在生物體內(nèi)隨著年齡增高而減少的現(xiàn)象，且在認(rèn)知相關(guān)區(qū)域下降更明顯。這意味著Kl如果能維持CSF濃度在一個(gè)較高水平可能是有助于減緩認(rèn)知下降的，而這一過程可能與它能對(duì)抗Aβ累積后對(duì)腦組織造成的負(fù)擔(dān)有關(guān)。

有研究[12]報(bào)道，Aβ在腦內(nèi)積聚可由載脂蛋白E4(APOEε4)等位基因造成，在Kl-VSHET+(即血清Kl水平升高狀態(tài))中，APOE ε4陽性個(gè)體的血清Aβ負(fù)荷與APOE ε4陰性個(gè)體相比未見增高，且在CSF中表現(xiàn)更明顯。Kl-VSHET+可以降低攜帶APOEε4患者的Aβ負(fù)荷[13-14]。Belloy等[14]進(jìn)行薈萃分析總結(jié)了這一現(xiàn)象，在攜帶APOEε4的個(gè)體中，60～80歲表現(xiàn)為Kl-VSHET+狀態(tài)與降低的Aβ負(fù)荷、AD風(fēng)險(xiǎn)有關(guān)，從80歲開始Kl-VSHET+的健康對(duì)照組轉(zhuǎn)化為輕度認(rèn)知功能障礙期或AD的風(fēng)險(xiǎn)會(huì)降低。

1.2 病理聯(lián)系 Kl蛋白缺乏時(shí)海馬神經(jīng)元會(huì)出現(xiàn)突觸減少及神經(jīng)變性的病理表現(xiàn)，海馬透明層中與學(xué)習(xí)和記憶建立有關(guān)的神經(jīng)元單個(gè)的大小及突觸小泡個(gè)數(shù)雖然正常，但整體突觸數(shù)量顯著下降[15]，并且還伴隨有海馬軸突運(yùn)輸障礙及神經(jīng)變性增加的現(xiàn)象[16]。不僅如此，Vo等[17]發(fā)現(xiàn)此時(shí)海馬神經(jīng)元細(xì)胞的形態(tài)是發(fā)生了改變的，表現(xiàn)為樹突棘頭部直徑增大、長(zhǎng)度變短。這種異常細(xì)胞形態(tài)更容易對(duì)刺激做出反應(yīng)，當(dāng)體內(nèi)存在高頻刺激時(shí)神經(jīng)元網(wǎng)絡(luò)反應(yīng)會(huì)普遍增加，海馬長(zhǎng)時(shí)程增強(qiáng)容易達(dá)到飽和，之后便難以實(shí)現(xiàn)編碼記憶所需的突觸電位特異性增強(qiáng)，學(xué)習(xí)和記憶能力就會(huì)受到損害。

而Kl基因表達(dá)增加也是可以通過病理改變來協(xié)助學(xué)習(xí)和記憶的編碼的，事實(shí)上，學(xué)習(xí)和記憶的形成主要是通過刺激N-甲基-D-天冬氨酸受體(NMDAR)亞單位GluN2B實(shí)現(xiàn)的，海馬NMDAR參與長(zhǎng)時(shí)程增強(qiáng)的誘導(dǎo)過程，而長(zhǎng)時(shí)程增強(qiáng)是長(zhǎng)時(shí)程記憶的細(xì)胞相關(guān)因子，因而NMDAR作為長(zhǎng)時(shí)程記憶建立的重要基礎(chǔ)發(fā)揮著關(guān)鍵作用。研究[18]發(fā)現(xiàn)，Kl過表達(dá)會(huì)使海馬和皮質(zhì)中突觸后的GluN2B密度翻倍，也會(huì)使NMDAR依賴性基因Fos表達(dá)增加。這一類觀察對(duì)象明顯右背外側(cè)前額葉皮質(zhì)體積更大、認(rèn)知下降更慢[19]、執(zhí)行功能更好[20]。

1.3 保護(hù)機(jī)制 Kl蛋白對(duì)海馬神經(jīng)元細(xì)胞發(fā)揮著強(qiáng)大的保護(hù)作用，從機(jī)制出發(fā)，它能有效阻止人類淀粉樣蛋白前體蛋白對(duì)細(xì)胞造成損害，改善轉(zhuǎn)基因小鼠表現(xiàn)出的學(xué)習(xí)與記憶功能障礙[21]。其過程復(fù)雜，研究發(fā)現(xiàn)它不僅能顯著提高硫氧還蛋白/過氧化物酶氧化還原系統(tǒng)的表達(dá)[22]，而且能通過下調(diào)Wnt1水平、上調(diào)磷酸化環(huán)腺苷酸反應(yīng)元件結(jié)合(pCREB)、核因子紅細(xì)胞2-相關(guān)因子2和血紅素加氧酶1的mRNA水平，減輕Aβ暴露細(xì)胞的凋亡、氧化應(yīng)激和炎癥反應(yīng)[3]。

因而不論是在癥狀表現(xiàn)、生理水平還是病理或分子機(jī)制上，Kl都表現(xiàn)出與AD的明顯相關(guān)性。提高Kl濃度，保護(hù)海馬神經(jīng)元，勢(shì)必會(huì)為AD患者帶去益處。只是其所伴隨的風(fēng)險(xiǎn)還需要繼續(xù)研究。對(duì)抗Aβ負(fù)荷是其發(fā)揮保護(hù)作用的關(guān)鍵。這也意味著其過表達(dá)對(duì)認(rèn)知正常青年個(gè)體沒有提升認(rèn)知或智力的能力。

2 Kl與帕金森病

帕金森病是一種發(fā)病率僅次于AD的復(fù)雜神經(jīng)變性疾病，病理機(jī)制涉及到黑質(zhì)致密區(qū)多巴胺能神經(jīng)元及其他含色素的神經(jīng)元的大量變性和丟失。其臨床表現(xiàn)主要包含兩方面，一為運(yùn)動(dòng)功能障礙，包括靜止性震顫、運(yùn)動(dòng)遲緩、肌強(qiáng)直及姿勢(shì)步態(tài)障礙，另一為非運(yùn)動(dòng)癥狀，包括睡眠、認(rèn)知及嗅覺障礙和疲勞等。

2.1 表現(xiàn)形式 研究[23-24]顯示，Kl基因在紋狀體(SNC)內(nèi)有廣泛表達(dá)，隨著年齡逐漸增長(zhǎng)，Kl蛋白功能下降會(huì)導(dǎo)致SNC中酪氨酸羥化酶(TH)陽性多巴胺能神經(jīng)元的數(shù)量明顯下降、體積明顯縮小，繼而神經(jīng)元變性失活，多巴胺合成明顯減少。

2.2 病理聯(lián)系 Kosakai等[24]發(fā)現(xiàn)，TH陽性多巴胺能神經(jīng)元數(shù)量下降這一病理特征能被維生素D(VitD)限制攝入所改善。推測(cè)相關(guān)生理機(jī)制可能如下：Kl與FGF23協(xié)作負(fù)性調(diào)節(jié)VitD生物合成，而VitD可促進(jìn)TH基因表達(dá)[25]，TH作為兒茶酚胺生物合成途徑中的第一限速酶，其表達(dá)可調(diào)節(jié)兒茶酚胺分泌速率和兒茶酚胺能途徑中神經(jīng)傳遞的有效性[26]，即Kl強(qiáng)效抑制著VitD合成進(jìn)而限制多巴胺的合成。因而考慮Kl蛋白減少導(dǎo)致活性VitD異常增加造成多巴胺能神經(jīng)元變性這一路徑可能是帕金森病一種新的發(fā)病機(jī)制，值得深入研究。然而，Evatt等[27]卻發(fā)現(xiàn)了帕金森病患者中VitD缺乏的普遍性，認(rèn)為補(bǔ)充VitD可以保護(hù)SNC多巴胺能神經(jīng)元[28]。目前許多學(xué)者在著力于VitD缺乏與帕金森病的關(guān)系研究，其具體機(jī)制不明，考慮是過表達(dá)的Kl造成的VitD減少，但與帕金森病好發(fā)年齡即主要研究對(duì)象不相符。以上兩種矛盾結(jié)果是否均與Kl有關(guān)，Kl是如何變換其在帕金森病發(fā)病中的角色，如何激發(fā)其在帕金森病中發(fā)揮保護(hù)作用，有待進(jìn)一步深入研究。

2.3 保護(hù)機(jī)制 進(jìn)行Kl與帕金森病相關(guān)性機(jī)制研究時(shí)有人發(fā)現(xiàn)Kl蛋白可通過多種通路對(duì)抗氧化應(yīng)激，發(fā)揮保護(hù)多巴胺能神經(jīng)通路的作用。Kl過表達(dá)可通過信號(hào)調(diào)節(jié)激酶1信號(hào)復(fù)合物產(chǎn)生減輕p38 MAPK介導(dǎo)的氧化應(yīng)激的效果，活性氧敏感信號(hào)事件受到影響，多巴胺能神經(jīng)元便不易受到活性氧介導(dǎo)的氧化應(yīng)激的損害[4]。除此以外，Kl還能增強(qiáng)pCREB信號(hào)、cAMP依賴性蛋白激酶A或鈣/鈣調(diào)素依賴激酶Ⅱ級(jí)聯(lián)信號(hào)的激活及磷酸化，對(duì)SNC多巴胺能通路發(fā)揮神經(jīng)保護(hù)作用[5]；促炎細(xì)胞因子的產(chǎn)生及免疫生成樣表型DNA的損傷也會(huì)減少[6]。

3 其他

目前除對(duì)AD、帕金森病等研究較多外，還有少數(shù)學(xué)者針對(duì)其他神經(jīng)變性病做出了探索。Zeldich等[29]發(fā)現(xiàn)Kl過表達(dá)能保護(hù)小鼠運(yùn)動(dòng)神經(jīng)元細(xì)胞，使肌萎縮側(cè)索硬化疾病的開始、進(jìn)展和存活時(shí)間分別延長(zhǎng)約6 d、11 d、11 d；而Kl基因缺失小鼠具有與經(jīng)典肌萎縮側(cè)索硬化患者相似的病理表現(xiàn)，Anamizu

等[30]觀察到野生型小鼠頸髓腹側(cè)灰質(zhì)神經(jīng)元細(xì)胞的密度、平均神經(jīng)元核仁直徑均明顯大于Kl基因缺失小鼠，Kl基因缺失小鼠在脊髓前腳運(yùn)動(dòng)神經(jīng)元細(xì)胞生成過程中存在明顯障礙；與此同時(shí)，細(xì)胞質(zhì)RNA的明顯下降與粗面內(nèi)質(zhì)網(wǎng)池的縮小最終造成運(yùn)動(dòng)神經(jīng)元細(xì)胞功能的失調(diào)。Guo等[31]發(fā)現(xiàn)，多系統(tǒng)萎縮患者血清中Kl蛋白濃度也呈下降趨勢(shì)，與年齡負(fù)相關(guān)。Shiozaki等[16]發(fā)現(xiàn)，Kl蛋白對(duì)野生型小鼠的浦肯野細(xì)胞具有保護(hù)作用，Kl基因缺陷小鼠小腦中的浦肯野細(xì)胞體有類似于脂褐素型顆粒的異常內(nèi)含物，軸突顯示出退化跡象，因而脊髓小腦性共濟(jì)失調(diào)的發(fā)病可能與此有關(guān)。

4 共同作用機(jī)制

針對(duì)Kl在AD、帕金森病的機(jī)制研究，不難發(fā)現(xiàn)，對(duì)抗氧化應(yīng)激是Kl蛋白對(duì)CNS保護(hù)機(jī)制中最重要的一項(xiàng)，包括提高硫氧還蛋白/過氧化物酶氧化還原系統(tǒng)的表達(dá)、減輕活性氧系統(tǒng)的損害等。然而具體機(jī)制研究是個(gè)大工程。Abraham團(tuán)隊(duì)一直致力于Kl基因的研究，近兩年在激活Kl基因的表達(dá)方面有了明顯進(jìn)展，他們發(fā)現(xiàn)在Kl基因啟動(dòng)子區(qū)-300～1 bp范圍內(nèi)，靶向Kl啟動(dòng)子區(qū)的單導(dǎo)RNA(sgRNA)存在兩種能夠有效增強(qiáng)Kl基因轉(zhuǎn)錄的序列，分別為sgRNA 3(序列：5′-GGT GCC TTT CTC CGA CGT CCG-3′；反序列：5′-CGG ACG TCG GAG AAA GGC ACC-3′)及sgRNA 4(序列：5′-GGA AAC GTC CTG CAC GGC TCC-3′；反序列：5′-GGA GCC GTG CAG GAC GTT TCC-3′)[32]。他們還發(fā)現(xiàn)使用針對(duì)Kl啟動(dòng)子-250 bp和Egr1結(jié)合位點(diǎn)之一重新設(shè)計(jì)的鋅指蛋白也可以特別激活Kl基因[33]。這一發(fā)現(xiàn)不僅有助于Kl基因的表達(dá)，獲取更多的Kl蛋白，便于研究其在不同疾病中的作用機(jī)制，更是為后續(xù)在生物體內(nèi)特異性激活研究治療途徑奠定了基礎(chǔ)。

5 總結(jié)與展望

Kl是一種衰老抑制基因，與人類神經(jīng)系統(tǒng)變性病關(guān)系密切。已有的各項(xiàng)研究表明，Kl在AD、帕金森病、肌萎縮側(cè)索硬化、多系統(tǒng)萎縮等神經(jīng)變性病中表達(dá)均下降，Kl過表達(dá)對(duì)CNS具有明顯的保護(hù)作用。對(duì)于AD，Kl竭力對(duì)抗Aβ對(duì)海馬神經(jīng)元造成的損害，細(xì)胞層面上能顯著改善長(zhǎng)時(shí)程記憶基礎(chǔ)中的NMDAR結(jié)構(gòu)功能和網(wǎng)絡(luò)反應(yīng)敏感性，分子層面上能調(diào)節(jié)硫氧還蛋白/過氧化物酶氧化還原系統(tǒng)、pCREB、核因子紅細(xì)胞2-相關(guān)因子2和血紅素加氧酶1、Wnt1等的表達(dá)；對(duì)于帕金森病，Kl負(fù)性調(diào)控VitD合成以保護(hù)多巴胺能神經(jīng)元，維持多巴胺的正常合成和分泌，這一過程主要是增強(qiáng)了信號(hào)調(diào)節(jié)激酶1信號(hào)復(fù)合物、pCREB、cAMP依賴性蛋白激酶A、鈣/鈣調(diào)素依賴激酶Ⅱ等信號(hào)的表達(dá)；Kl還能保護(hù)脊髓前腳運(yùn)動(dòng)神經(jīng)元，監(jiān)控細(xì)胞形態(tài)和功能完整；其他類似于肌萎縮側(cè)索硬化、多系統(tǒng)萎縮的發(fā)病過程似乎都有Kl保護(hù)者的身影。除以上作用外，Kl對(duì)神經(jīng)變性病保護(hù)機(jī)制的共同之處也是最重要的一點(diǎn)即是抵抗氧化應(yīng)激對(duì)神經(jīng)細(xì)胞造成的損害。

盡管目前大多證據(jù)均顯示著Kl的積極作用，但不足以充分證明它的意義所在。它對(duì)大腦功能所發(fā)揮的作用仍布滿迷霧，需要更多的證據(jù)來證明相關(guān)性。其與亨廷頓病、路易體癡呆、進(jìn)行性核上性麻痹等的關(guān)系的研究現(xiàn)在一片空白。其具體調(diào)節(jié)機(jī)制如何，如何激活它在人體內(nèi)的保護(hù)作用，是否存在隱患，許許多多的問題都等待著解決。需要更多更深入的研究來剖析，需要更多的研究者投身其中。

盡管Kl的角色尚未清晰，但我們依然有理由相信，Kl在未來可以為神經(jīng)變性病乃至CNS疾病提供一種有前途的治療方法。