Klotho基因在神經(jīng)變性病中的研究進展

徐敏，葉民

1997年日本學者Kuro-O等[1]在進行自發(fā)型高血壓的相關性研究時偶然發(fā)現(xiàn)一種新型基因，經(jīng)過一系列的實驗證實其與衰老有關，缺失這種基因的小鼠會出現(xiàn)壽命縮短、動脈硬化、皮膚肌肉萎縮、認知障礙、運動神經(jīng)元受損等癥狀。之后Kuro-O等[1]便采用古希臘神話中紡織生命之線的女神名字——Klotho(Kl)命名此基因。

小鼠的Kl基因轉錄產物約5.2 kb，長度與人類相似。Kl根據(jù)選擇性剪切產物轉錄為跨膜型和分泌型Kl蛋白，其中分泌型的表達量明顯高于跨膜型?？缒ば蚄l蛋白全長有1 024個氨基酸殘基，包含N末端信號序列、胞外區(qū)域、單跨膜螺旋區(qū)域和短胞內區(qū)域。胞外區(qū)域又分為重復序列Kl1和Kl2。而分泌型Kl蛋白無Kl2、跨膜區(qū)域和細胞內區(qū)域，僅編碼Kl基因N末端一半的區(qū)域，約550個氨基酸。

Kl蛋白具有多種生物學活性，一方面跨膜型Kl蛋白可與成纖維細胞生長因子受體(FGFR)作為FGF23的共受體，介導FGF23的生物學活性[2];另一方面分泌型Kl蛋白有抵抗氧化應激、抑制細胞炎癥和凋亡[3-6]、促進血管發(fā)生[7-8]等作用。近來研究[9]發(fā)現(xiàn)，Kl基因的一種功能性單倍型(Kl-VS)，能改變細胞Kl蛋白的分泌及功能，它由兩個非同義變異體rs9536314(R352V)和rs9527025(C370S)組成，Kl-VS雜合子(Kl-VSHET+)與血清Kl水平升高相關，而Kl-VS純合子則與Kl血清水平降低相關。

以往研究[1]認為Kl基因在腎臟遠曲小管和大腦脈絡叢中的表達最高，其次是腦、甲狀旁腺、胰腺、卵巢、睪丸等，最近的研究[10]發(fā)現(xiàn)，Kl基因敲除小鼠的神經(jīng)變性程度會明顯增加，主要包括膽堿能功能改變、多巴胺能神經(jīng)元和海馬神經(jīng)元減少、浦肯野細胞減少以及氧化應激升高等。關于Kl在CNS中具體發(fā)揮的作用、作用機制無統(tǒng)一定論，Kl與神經(jīng)病學尤其是神經(jīng)變性疾病的關系受到國內外專家學者越來越多的重視，特別是Alzheimer’s病(AD)和帕金森病。因此，本文就目前國內外對Kl與神經(jīng)變性病關系的研究進行總結，希望能使更多的同仁認識到Kl基因的重要性，為治療神經(jīng)變性病提供新的思路。

1 Kl與AD

AD是一種發(fā)生在老年和老年前期、以進行性認知功能障礙為特征的神經(jīng)系統(tǒng)變性疾病。臨床上通常表現(xiàn)為記憶障礙、失語、失用、人格和行為改變等。其病理學上的典型改變?yōu)棣碌矸蹣游镔|(Aβ)在神經(jīng)細胞外沉積形成的神經(jīng)炎性斑和過度磷酸化的tau蛋白在神經(jīng)細胞內聚集形成的神經(jīng)原纖維纏結。

1.1 表現(xiàn)形式Kl基因在大腦皮質和海馬神經(jīng)元中廣泛表達，隨著年齡增長蛋白濃度逐年降低，Kl聯(lián)系著學習和記憶功能，過表達Kl的個體具有認知下降較慢、執(zhí)行功能更好的表現(xiàn)。Massó[11]早前比較過攜帶家族性AD突變基因PS1/M146V、AβPPSwe和tauP301L的3xTg-AD模型小鼠與健康對照小鼠在不同月齡時分泌的Kl蛋白水平，發(fā)現(xiàn)隨著年齡的增長兩種小鼠的Kl蛋白水平在前額葉皮質、大腦皮質、海馬中均有下降，3xTg-AD小鼠下降則更明顯，18個月與6個月相比各區(qū)中分別降低了41%、49%、63%，這再次證明Kl在生物體內隨著年齡增高而減少的現(xiàn)象，且在認知相關區(qū)域下降更明顯。這意味著Kl如果能維持CSF濃度在一個較高水平可能是有助于減緩認知下降的，而這一過程可能與它能對抗Aβ累積后對腦組織造成的負擔有關。

有研究[12]報道，Aβ在腦內積聚可由載脂蛋白E4(APOEε4)等位基因造成，在Kl-VSHET+(即血清Kl水平升高狀態(tài))中，APOE ε4陽性個體的血清Aβ負荷與APOE ε4陰性個體相比未見增高，且在CSF中表現(xiàn)更明顯。Kl-VSHET+可以降低攜帶APOEε4患者的Aβ負荷[13-14]。Belloy等[14]進行薈萃分析總結了這一現(xiàn)象，在攜帶APOEε4的個體中，60～80歲表現(xiàn)為Kl-VSHET+狀態(tài)與降低的Aβ負荷、AD風險有關，從80歲開始Kl-VSHET+的健康對照組轉化為輕度認知功能障礙期或AD的風險會降低。

1.2 病理聯(lián)系 Kl蛋白缺乏時海馬神經(jīng)元會出現(xiàn)突觸減少及神經(jīng)變性的病理表現(xiàn)，海馬透明層中與學習和記憶建立有關的神經(jīng)元單個的大小及突觸小泡個數(shù)雖然正常，但整體突觸數(shù)量顯著下降[15]，并且還伴隨有海馬軸突運輸障礙及神經(jīng)變性增加的現(xiàn)象[16]。不僅如此，Vo等[17]發(fā)現(xiàn)此時海馬神經(jīng)元細胞的形態(tài)是發(fā)生了改變的，表現(xiàn)為樹突棘頭部直徑增大、長度變短。這種異常細胞形態(tài)更容易對刺激做出反應，當體內存在高頻刺激時神經(jīng)元網(wǎng)絡反應會普遍增加，海馬長時程增強容易達到飽和，之后便難以實現(xiàn)編碼記憶所需的突觸電位特異性增強，學習和記憶能力就會受到損害。

而Kl基因表達增加也是可以通過病理改變來協(xié)助學習和記憶的編碼的，事實上，學習和記憶的形成主要是通過刺激N-甲基-D-天冬氨酸受體(NMDAR)亞單位GluN2B實現(xiàn)的，海馬NMDAR參與長時程增強的誘導過程，而長時程增強是長時程記憶的細胞相關因子，因而NMDAR作為長時程記憶建立的重要基礎發(fā)揮著關鍵作用。研究[18]發(fā)現(xiàn)，Kl過表達會使海馬和皮質中突觸后的GluN2B密度翻倍，也會使NMDAR依賴性基因Fos表達增加。這一類觀察對象明顯右背外側前額葉皮質體積更大、認知下降更慢[19]、執(zhí)行功能更好[20]。

1.3 保護機制 Kl蛋白對海馬神經(jīng)元細胞發(fā)揮著強大的保護作用，從機制出發(fā)，它能有效阻止人類淀粉樣蛋白前體蛋白對細胞造成損害，改善轉基因小鼠表現(xiàn)出的學習與記憶功能障礙[21]。其過程復雜，研究發(fā)現(xiàn)它不僅能顯著提高硫氧還蛋白/過氧化物酶氧化還原系統(tǒng)的表達[22]，而且能通過下調Wnt1水平、上調磷酸化環(huán)腺苷酸反應元件結合(pCREB)、核因子紅細胞2-相關因子2和血紅素加氧酶1的mRNA水平，減輕Aβ暴露細胞的凋亡、氧化應激和炎癥反應[3]。

因而不論是在癥狀表現(xiàn)、生理水平還是病理或分子機制上，Kl都表現(xiàn)出與AD的明顯相關性。提高Kl濃度，保護海馬神經(jīng)元，勢必會為AD患者帶去益處。只是其所伴隨的風險還需要繼續(xù)研究。對抗Aβ負荷是其發(fā)揮保護作用的關鍵。這也意味著其過表達對認知正常青年個體沒有提升認知或智力的能力。

2 Kl與帕金森病

帕金森病是一種發(fā)病率僅次于AD的復雜神經(jīng)變性疾病，病理機制涉及到黑質致密區(qū)多巴胺能神經(jīng)元及其他含色素的神經(jīng)元的大量變性和丟失。其臨床表現(xiàn)主要包含兩方面，一為運動功能障礙，包括靜止性震顫、運動遲緩、肌強直及姿勢步態(tài)障礙，另一為非運動癥狀，包括睡眠、認知及嗅覺障礙和疲勞等。

2.1 表現(xiàn)形式 研究[23-24]顯示，Kl基因在紋狀體(SNC)內有廣泛表達，隨著年齡逐漸增長，Kl蛋白功能下降會導致SNC中酪氨酸羥化酶(TH)陽性多巴胺能神經(jīng)元的數(shù)量明顯下降、體積明顯縮小，繼而神經(jīng)元變性失活，多巴胺合成明顯減少。

2.2 病理聯(lián)系 Kosakai等[24]發(fā)現(xiàn)，TH陽性多巴胺能神經(jīng)元數(shù)量下降這一病理特征能被維生素D(VitD)限制攝入所改善。推測相關生理機制可能如下：Kl與FGF23協(xié)作負性調節(jié)VitD生物合成，而VitD可促進TH基因表達[25]，TH作為兒茶酚胺生物合成途徑中的第一限速酶，其表達可調節(jié)兒茶酚胺分泌速率和兒茶酚胺能途徑中神經(jīng)傳遞的有效性[26]，即Kl強效抑制著VitD合成進而限制多巴胺的合成。因而考慮Kl蛋白減少導致活性VitD異常增加造成多巴胺能神經(jīng)元變性這一路徑可能是帕金森病一種新的發(fā)病機制，值得深入研究。然而，Evatt等[27]卻發(fā)現(xiàn)了帕金森病患者中VitD缺乏的普遍性，認為補充VitD可以保護SNC多巴胺能神經(jīng)元[28]。目前許多學者在著力于VitD缺乏與帕金森病的關系研究，其具體機制不明，考慮是過表達的Kl造成的VitD減少，但與帕金森病好發(fā)年齡即主要研究對象不相符。以上兩種矛盾結果是否均與Kl有關，Kl是如何變換其在帕金森病發(fā)病中的角色，如何激發(fā)其在帕金森病中發(fā)揮保護作用，有待進一步深入研究。

2.3 保護機制 進行Kl與帕金森病相關性機制研究時有人發(fā)現(xiàn)Kl蛋白可通過多種通路對抗氧化應激，發(fā)揮保護多巴胺能神經(jīng)通路的作用。Kl過表達可通過信號調節(jié)激酶1信號復合物產生減輕p38 MAPK介導的氧化應激的效果，活性氧敏感信號事件受到影響，多巴胺能神經(jīng)元便不易受到活性氧介導的氧化應激的損害[4]。除此以外，Kl還能增強pCREB信號、cAMP依賴性蛋白激酶A或鈣/鈣調素依賴激酶Ⅱ級聯(lián)信號的激活及磷酸化，對SNC多巴胺能通路發(fā)揮神經(jīng)保護作用[5]；促炎細胞因子的產生及免疫生成樣表型DNA的損傷也會減少[6]。

3 其他

目前除對AD、帕金森病等研究較多外，還有少數(shù)學者針對其他神經(jīng)變性病做出了探索。Zeldich等[29]發(fā)現(xiàn)Kl過表達能保護小鼠運動神經(jīng)元細胞，使肌萎縮側索硬化疾病的開始、進展和存活時間分別延長約6 d、11 d、11 d；而Kl基因缺失小鼠具有與經(jīng)典肌萎縮側索硬化患者相似的病理表現(xiàn)，Anamizu

等[30]觀察到野生型小鼠頸髓腹側灰質神經(jīng)元細胞的密度、平均神經(jīng)元核仁直徑均明顯大于Kl基因缺失小鼠，Kl基因缺失小鼠在脊髓前腳運動神經(jīng)元細胞生成過程中存在明顯障礙；與此同時，細胞質RNA的明顯下降與粗面內質網(wǎng)池的縮小最終造成運動神經(jīng)元細胞功能的失調。Guo等[31]發(fā)現(xiàn)，多系統(tǒng)萎縮患者血清中Kl蛋白濃度也呈下降趨勢，與年齡負相關。Shiozaki等[16]發(fā)現(xiàn)，Kl蛋白對野生型小鼠的浦肯野細胞具有保護作用，Kl基因缺陷小鼠小腦中的浦肯野細胞體有類似于脂褐素型顆粒的異常內含物，軸突顯示出退化跡象，因而脊髓小腦性共濟失調的發(fā)病可能與此有關。

4 共同作用機制

針對Kl在AD、帕金森病的機制研究，不難發(fā)現(xiàn)，對抗氧化應激是Kl蛋白對CNS保護機制中最重要的一項，包括提高硫氧還蛋白/過氧化物酶氧化還原系統(tǒng)的表達、減輕活性氧系統(tǒng)的損害等。然而具體機制研究是個大工程。Abraham團隊一直致力于Kl基因的研究，近兩年在激活Kl基因的表達方面有了明顯進展，他們發(fā)現(xiàn)在Kl基因啟動子區(qū)-300～1 bp范圍內，靶向Kl啟動子區(qū)的單導RNA(sgRNA)存在兩種能夠有效增強Kl基因轉錄的序列，分別為sgRNA 3(序列：5′-GGT GCC TTT CTC CGA CGT CCG-3′；反序列：5′-CGG ACG TCG GAG AAA GGC ACC-3′)及sgRNA 4(序列：5′-GGA AAC GTC CTG CAC GGC TCC-3′；反序列：5′-GGA GCC GTG CAG GAC GTT TCC-3′)[32]。他們還發(fā)現(xiàn)使用針對Kl啟動子-250 bp和Egr1結合位點之一重新設計的鋅指蛋白也可以特別激活Kl基因[33]。這一發(fā)現(xiàn)不僅有助于Kl基因的表達，獲取更多的Kl蛋白，便于研究其在不同疾病中的作用機制，更是為后續(xù)在生物體內特異性激活研究治療途徑奠定了基礎。

5 總結與展望

Kl是一種衰老抑制基因，與人類神經(jīng)系統(tǒng)變性病關系密切。已有的各項研究表明，Kl在AD、帕金森病、肌萎縮側索硬化、多系統(tǒng)萎縮等神經(jīng)變性病中表達均下降，Kl過表達對CNS具有明顯的保護作用。對于AD，Kl竭力對抗Aβ對海馬神經(jīng)元造成的損害，細胞層面上能顯著改善長時程記憶基礎中的NMDAR結構功能和網(wǎng)絡反應敏感性，分子層面上能調節(jié)硫氧還蛋白/過氧化物酶氧化還原系統(tǒng)、pCREB、核因子紅細胞2-相關因子2和血紅素加氧酶1、Wnt1等的表達；對于帕金森病，Kl負性調控VitD合成以保護多巴胺能神經(jīng)元，維持多巴胺的正常合成和分泌，這一過程主要是增強了信號調節(jié)激酶1信號復合物、pCREB、cAMP依賴性蛋白激酶A、鈣/鈣調素依賴激酶Ⅱ等信號的表達；Kl還能保護脊髓前腳運動神經(jīng)元，監(jiān)控細胞形態(tài)和功能完整；其他類似于肌萎縮側索硬化、多系統(tǒng)萎縮的發(fā)病過程似乎都有Kl保護者的身影。除以上作用外，Kl對神經(jīng)變性病保護機制的共同之處也是最重要的一點即是抵抗氧化應激對神經(jīng)細胞造成的損害。

盡管目前大多證據(jù)均顯示著Kl的積極作用，但不足以充分證明它的意義所在。它對大腦功能所發(fā)揮的作用仍布滿迷霧，需要更多的證據(jù)來證明相關性。其與亨廷頓病、路易體癡呆、進行性核上性麻痹等的關系的研究現(xiàn)在一片空白。其具體調節(jié)機制如何，如何激活它在人體內的保護作用，是否存在隱患，許許多多的問題都等待著解決。需要更多更深入的研究來剖析，需要更多的研究者投身其中。

盡管Kl的角色尚未清晰，但我們依然有理由相信，Kl在未來可以為神經(jīng)變性病乃至CNS疾病提供一種有前途的治療方法。