響應(yīng)面優(yōu)化超聲輔助提取芥藍(lán)多酚工藝研究

黃曉梅 謝丹丹 陳 昕 石麗榮 胡杰華 馮晨 曾瑞娟

摘 要：采用超聲輔助法提取芥藍(lán)多酚，并通過(guò)響應(yīng)面法對(duì)提取工藝進(jìn)行優(yōu)化。以液料比、乙醇濃度、超聲溫度和超聲時(shí)間4個(gè)因素進(jìn)行單因素試驗(yàn)，在此基礎(chǔ)上，以芥藍(lán)多酚提取率為響應(yīng)值，應(yīng)用Box-Behnken法進(jìn)行四因素三水平的試驗(yàn)設(shè)計(jì)和優(yōu)化，得到芥藍(lán)多酚最佳的提取工藝條件為液料比38mL/g、乙醇濃度61%、超聲溫度63℃和超聲時(shí)間34min。此時(shí)芥藍(lán)多酚提取率為15.03mg/g，與該模型的預(yù)測(cè)值（15.18mg/g）相比，兩者相對(duì)誤差為0.99%，說(shuō)明該回歸模型得到的提取工藝參數(shù)可靠，準(zhǔn)確性較高，可以利用響應(yīng)面法優(yōu)化芥藍(lán)多酚的提取。研究結(jié)果為芥藍(lán)多酚的提取與開(kāi)發(fā)提供了新的方向。

關(guān)鍵詞：芥藍(lán);多酚;響應(yīng)面;超聲輔助;優(yōu)化

中圖分類(lèi)號(hào) TS255 文獻(xiàn)標(biāo)識(shí)碼 A 文章編號(hào) 1007-7731（2021）23-0030-06

Optimization of Ultrasonic Assisted Extraction of Polyphenols from Chinese Kale Using Response Surface Methodology

HUANG Xiaomei et al.

（Xiamen Ocean Vocational College， Xiamen 361100， China）

Abstract： Ultrasound-assisted extraction of polyphenols from Chinese kale was used in this experiment， and the extraction process was optimized by response surface methodology. Single factor experiments were carried out with four factors： liquid-to-material ratio， ethanol concentration， ultrasonic temperature and ultrasonic time. On this basis， with the extraction rate of Chinese kale polyphenols as response value， Box-Behnken was used to design and optimize the experiment at four factors and three levels. The optimum extraction conditions of Chinese kale polyphenols were obtained as follows： 38 mL/g of liquid-solid ratio， 61% of ethanol concentration， 63℃ of ultrasonic temperature， 34 minutes of ultrasonic time. The extraction yield of Chinese kale was 15.03 mg/g， compared with the best predictive value of the model （15.18mg/g）， the relative error was 0.99%， which indicated that the extraction process parameters obtained by the regression model were reliable and accurate. Response surface methodology could be used to optimize the extraction of polyphenols in Chinese kale， which provided a theoretical basis and a new direction for the extraction and development of polyphenols in Chinese kale.

Key words： Chinese kale; Polyphenols; Response surface methodology; Ultrasonic assisted; Optimization

芥藍(lán)（Brassica alboglabra L.H. Bailey）又被稱(chēng)為綠葉甘藍(lán)、蓋菜，作為甘藍(lán)的一個(gè)變種，是十字花科類(lèi)的重要植物，也是我國(guó)著名的特色蔬菜之一[1-2]。芥藍(lán)甜脆味美，所含有的營(yíng)養(yǎng)價(jià)值和藥用價(jià)值較高。芥藍(lán)中含有的營(yíng)養(yǎng)成分種類(lèi)豐富，如維生素C、纖維素、糖類(lèi)、多酚等，具有消暑解熱、軟化血管、預(yù)防心臟病等多種作用[3-4]。其中多酚是存在于植物的葉片、根、皮、殼和果肉中的一種酚類(lèi)化合物的復(fù)雜次級(jí)代謝產(chǎn)，具有很多生物活性，如抗氧化、抗腫瘤、抑制心血管疾病以及抗骨質(zhì)疏松等，已廣泛應(yīng)用于農(nóng)業(yè)、醫(yī)學(xué)、食品、日化等相關(guān)領(lǐng)域中，發(fā)揮著至關(guān)重要的作用[5]。

本研究以芥藍(lán)為原料，采用超聲波強(qiáng)化輔助提取芥藍(lán)中的多酚，在單因素試驗(yàn)基礎(chǔ)上，研究液料比、乙醇濃度、超聲溫度和超聲時(shí)間等4個(gè)因素對(duì)芥藍(lán)多酚提取率的影響，并結(jié)合響應(yīng)面法進(jìn)行優(yōu)化，得到了最佳的提取工藝條件。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

1.1.1 材料 原料為芥藍(lán)，用蒸餾水將采購(gòu)的芥藍(lán)浸泡洗凈，去除泥沙，晾干后切碎平鋪在50 ℃鼓風(fēng)干燥箱中進(jìn)行烘干，然后取出進(jìn)行粉碎，選擇60目篩，過(guò)篩后保存?zhèn)溆谩?/p>

1.1.2 試劑 福林酚試劑，自制;沒(méi)食子酸，分析純，天津瑞金物化學(xué)品有限公司;食用酒精（乙醇），食品醫(yī)藥級(jí)，河南浩宇食品添加劑有限公司;其他試劑均為分析純。

1.1.3 儀器與設(shè)備 BS224S電子天平;HH-2數(shù)顯恒溫水浴鍋，金壇市新航儀器廠;WKYIII-100微量移液器，上海邦西儀器科技有限公司;KQ-100TDE型高頻數(shù)控超聲波清洗器，昆山超聲儀器有限公司;UV-7504（A）型紫外/可見(jiàn)分光光度計(jì)。

1.2 試驗(yàn)方法

1.2.1 標(biāo)準(zhǔn)曲線的制作 采用福林-酚法[6]，按文獻(xiàn)方法以沒(méi)食子酸為標(biāo)準(zhǔn)品，并在765nm波長(zhǎng)處測(cè)定標(biāo)準(zhǔn)品的吸光度值。將不同體積的0.1mg/mL的沒(méi)食子酸標(biāo)準(zhǔn)溶液分別按0mL、0.2mL、0.4mL、0.6mL、0.8mL、1.0mL、1.2mL和0.5mL的福林-酚試劑加入10mL容量瓶中，充分混合均勻，靜置1min，再加入1.5mL 20%的碳酸鈉溶液后用蒸餾水定容至10mL，然后將容量瓶放置于75℃水浴鍋中反應(yīng)10min后取出，待冷卻后測(cè)量其在765nm波長(zhǎng)處的吸光度值。根據(jù)上述試驗(yàn)數(shù)據(jù)繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線，該標(biāo)準(zhǔn)曲線以沒(méi)食子酸濃度（mg/L）為橫坐標(biāo)，以各個(gè)樣品所測(cè)量的吸光度值為縱坐標(biāo)。

1.2.2 芥藍(lán)多酚的提取工藝 準(zhǔn)確稱(chēng)取1g芥藍(lán)粉末，裝進(jìn)100mL的圓底燒瓶中，加入一定量的乙醇、沸石，裝上回流裝置，然后置于超聲清洗器中進(jìn)行超聲回流提取，提取結(jié)束后過(guò)濾得濾液，移取1mL進(jìn)行稀釋一定倍數(shù)后備用。

1.2.3 多酚含量的測(cè)定 根據(jù)福林-酚法，量取1mL經(jīng)稀釋一定倍數(shù)后的提取液于10mL容量瓶中并定容，再按照標(biāo)準(zhǔn)曲線的測(cè)定方法測(cè)定提取液在765nm波長(zhǎng)處的吸光值。根據(jù)標(biāo)準(zhǔn)曲線和測(cè)得的樣品吸光值計(jì)算出樣品中芥藍(lán)多酚的濃度，通過(guò)回歸方程計(jì)算得到芥藍(lán)多酚的提取率。其計(jì)算公式如下：

多酚提取率（mg/g）=[C×N×VM×103×100] （1）

式中：C為芥藍(lán)多酚質(zhì)量濃度（mg/L）;V為提取液體積（mL）;N為稀釋倍數(shù);M為芥藍(lán)葉質(zhì)量（g）。

1.2.4 單因素試驗(yàn)設(shè)計(jì)

1.2.4.1 液料比 準(zhǔn)確稱(chēng)取1g芥藍(lán)葉粉末，分別加入不同體積的60%乙醇25、30、35、40和45mL，置于60℃的超聲波清洗器中浸提，浸提時(shí)間為35min。浸提結(jié)束后取出冷卻，取其上清液進(jìn)行定容，考察不同液料比對(duì)芥藍(lán)多酚提取率的影響，確定最佳液料比。

1.2.4.2 乙醇濃度 準(zhǔn)確稱(chēng)取1g芥藍(lán)粉末，分別加入不同濃度的乙醇溶液35mL，其濃度分別為50%、55%、60%、65%、70%（體積分?jǐn)?shù)）。然后置于60℃的超聲波清洗器中浸提，浸提時(shí)間為35min。浸提結(jié)束后取出冷卻，取其上清液進(jìn)行定容，考察不同乙醇濃度對(duì)芥藍(lán)多酚提取率的影響，確定最佳乙醇濃度。

1.2.4.3 超聲溫度 準(zhǔn)確稱(chēng)取1g芥藍(lán)葉粉末，加入35mL 60%的乙醇，然后分別在不同溫度的超聲波清洗器中浸提，溫度分別為50℃、55℃、60℃、65℃、和70℃。浸提時(shí)間為35min。浸提結(jié)束后取出冷卻，取其上清液進(jìn)行定容，考察不同超聲溫度對(duì)芥藍(lán)多酚提取率的影響，確定最佳超聲溫度。

1.2.4.4 超聲時(shí)間 準(zhǔn)確稱(chēng)取1g芥藍(lán)葉粉末，加入35mL 60%的乙醇，在60℃的超聲波清洗器中浸提，浸提時(shí)間分別為25、30、35、40和45min，考察不同超聲時(shí)間對(duì)芥藍(lán)多酚的提取率的影響，確定最佳超聲時(shí)間。

1.2.5 響應(yīng)面優(yōu)化試驗(yàn)設(shè)計(jì) 選擇液料比（A）、乙醇濃度（B）、超聲溫度（C）和超聲時(shí)間（D）4個(gè)因素進(jìn)行單因素試驗(yàn)。在此基礎(chǔ)上，以芥藍(lán)多酚的提取率為響應(yīng)值，基于Box-Behnken的設(shè)計(jì)原理進(jìn)行四因素三水平的試驗(yàn)設(shè)計(jì)，并優(yōu)化該試驗(yàn)得到的芥藍(lán)多酚的提取工，具體因素與水平如表1。

2 結(jié)果與分析

2.1 單因素試驗(yàn)

2.1.1 液料比對(duì)芥藍(lán)多酚提取率的影響 由圖1可知，當(dāng)液料比在20～30mL/g，芥藍(lán)多酚的提取率變化較為明顯，液料比不斷增大時(shí)，提取率不斷增加，原因是液料比的增加使芥藍(lán)中的多酚和溶劑之間的濃度差不斷加大[7]，而且原料與溶劑之間的接觸面積不斷增大，因此芥藍(lán)多酚的提取率會(huì)不斷增加。當(dāng)液料比為30mL/g時(shí)，原料與溶劑之間結(jié)合充分達(dá)到飽和，芥藍(lán)多酚提取率得到最大。然而當(dāng)液料比過(guò)大時(shí)，過(guò)量的溶劑會(huì)導(dǎo)致其他物質(zhì)過(guò)度溶出，與多酚競(jìng)爭(zhēng)，導(dǎo)致提取率降低。因此，綜合考慮到降低能耗、成本等方面情況，較為合適的料液比選擇為30mL/g。

2.1.2 乙醇濃度對(duì)芥藍(lán)多酚提取率的影響 由圖2可知，當(dāng)乙醇濃度在50%～60%，隨著其濃度的不斷增大，芥藍(lán)多酚的提取率也明顯逐漸提高。提取率在乙醇濃度為60%時(shí)取得最大值。超過(guò)60%后，芥藍(lán)多酚的提取率隨著乙醇濃度的增加而逐漸降低。這是因?yàn)楫?dāng)乙醇濃度過(guò)低時(shí)，提取劑中有較高比例的水，會(huì)使得糖類(lèi)等水溶性物質(zhì)過(guò)量溶解[8]，從而降低多酚得率。而且乙醇濃度的增大會(huì)降低了溶劑的極性，使得芥藍(lán)顆粒內(nèi)多酚與蛋白質(zhì)、多糖等物質(zhì)間的氫鍵更容易被破壞，從而提高多酚提取率;但當(dāng)乙醇濃度過(guò)高時(shí)，材料的脂溶性物質(zhì)會(huì)過(guò)量溶出[9]，而且因溶劑的極性較弱，會(huì)大大增加芥藍(lán)顆粒中的醇溶性物質(zhì)的競(jìng)爭(zhēng)性溶出，阻礙多酚溶出。較為合適的乙醇濃度選擇60%。

2.1.3 超聲溫度對(duì)芥藍(lán)多酚提取率的影響 由圖3可知，當(dāng)超聲溫度在50～60℃，芥藍(lán)多酚的提取率隨著超聲溫度的升高逐漸提高，超聲溫度為60℃時(shí)，多酚提取率最大。原因是超聲溫度的逐漸升高，慢慢加大了分子的平均動(dòng)能，多酚的溶出與擴(kuò)散加快，使芥藍(lán)多酚提取率不斷提高。而溫度過(guò)高時(shí)多酚類(lèi)物質(zhì)會(huì)發(fā)生氧化[10]，多酚物質(zhì)結(jié)構(gòu)被破壞，并且過(guò)高的溫度會(huì)導(dǎo)致溶劑更容易揮發(fā)，造成損失，以及芥藍(lán)中其他成分更容易過(guò)量溶出，從而使得提取率降低。較為適宜的超聲溫度選擇60℃。

2.1.4 超聲時(shí)間對(duì)芥藍(lán)多酚提取率的影響 由圖4可知，當(dāng)超聲時(shí)間在20～35min，超聲時(shí)間的不斷增加，芥藍(lán)多酚的提取率也逐漸提高，芥藍(lán)多酚提取率在超聲時(shí)間為35min時(shí)達(dá)到最大值。由Fick擴(kuò)散定律可知，在一定范圍內(nèi)，超聲波時(shí)間越長(zhǎng)提取率越高，多酚提取率與超聲時(shí)間成正比[11]。所以當(dāng)超聲時(shí)間的不斷增加時(shí)，芥藍(lán)中的多酚會(huì)逐漸溶出，不斷提高芥藍(lán)多酚的提取率，但當(dāng)超聲時(shí)間過(guò)長(zhǎng)時(shí)，超聲波的空化作用、機(jī)械及剪切效應(yīng)會(huì)使多酚發(fā)生氧化、聚合等副反應(yīng)而被破壞[12]，芥藍(lán)多酚的提取率也不斷降低。較為合適的超聲時(shí)間為35min。

2.2 芥藍(lán)多酚提取的響應(yīng)面優(yōu)化試驗(yàn)結(jié)果

2.2.1 響應(yīng)面設(shè)計(jì)及結(jié)果分析 在單因素試驗(yàn)的基礎(chǔ)上，根據(jù)Box-Benhnken方法設(shè)計(jì)出四因素三水平試驗(yàn)，結(jié)果如表2所示。使用Design Expert 8.05b軟件對(duì)表2的試驗(yàn)數(shù)據(jù)進(jìn)行響應(yīng)面分析，方差結(jié)果如表3所示。

分析根據(jù)Box-Benhnken試驗(yàn)設(shè)計(jì)方法所獲得的29組試驗(yàn)結(jié)果，在液料比（A）、乙醇濃度（B）、超聲溫度（C）和超聲時(shí)間（D）4個(gè)單因素試驗(yàn)的基礎(chǔ)上，得到以芥藍(lán)多酚提取率（Y）為響應(yīng)值的四元二次回歸模型：

Y=14.97+0.54A-0.43B+0.17C-0.087D-0.035AB+0.19AC-0.045AD+0.35BC-0.17BD-0.17CD-0.55A2-0.38B2-0.39C2-0.51D2

用方差分析上述的回歸模型，用以檢驗(yàn)試驗(yàn)所考察的各種因素對(duì)芥藍(lán)多酚提取率的影響，其結(jié)果見(jiàn)表3。然后使用F檢驗(yàn)來(lái)確定響應(yīng)值受回歸方程中各變量影響的顯著性。由表3可知，該回歸模型的F=10.34，P<0.0001，這說(shuō)明該模型極顯著，同時(shí)該方程的相關(guān)系數(shù)R2=0.9118，說(shuō)明該模型的預(yù)測(cè)值與試驗(yàn)值的相關(guān)性較高，擬合度較好，該回歸模型可以用來(lái)預(yù)測(cè)與解釋超過(guò)91%的試驗(yàn)值;該模型的失擬度F=4.18，P=0.0902>0.05，說(shuō)明其擬合度良好，差異不顯著，具有較小的試驗(yàn)誤差;變異系數(shù)（C.v.%=1.71）<5%，說(shuō)明該模型具有較好重復(fù)性。根據(jù)分析F及P值可以得到本試驗(yàn)所考察的芥藍(lán)多酚提取率受4個(gè)因素的影響順序分別為：液料比>超聲溫度>提取時(shí)間>乙醇濃度。其中一次項(xiàng)A，二次項(xiàng)A2、B2、C2、D2影響極顯著（P<0.01），一次項(xiàng)C，交互項(xiàng)BC，有顯著影響（P<0.05）;一次項(xiàng)B、D，交互項(xiàng)AB、AC、AD影響不顯著（P>0.05）;說(shuō)明芥藍(lán)多酚的提取率受各因素的影響不是簡(jiǎn)單的線性關(guān)系。綜合上述試驗(yàn)結(jié)果分析可知，試驗(yàn)所得的回歸模型的準(zhǔn)確度和可靠性較高，可以較好地描述各因素與響應(yīng)面值之間的關(guān)系，可以用來(lái)對(duì)芥藍(lán)多酚的提取率進(jìn)行預(yù)測(cè)和分析。

2.2.2 響應(yīng)曲面圖分析 試驗(yàn)所得的響應(yīng)面曲面圖和等高線圖如圖5～10所示，本試驗(yàn)所考察的芥藍(lán)多酚的提取率受液料比、乙醇濃度、超聲溫度和超聲時(shí)間等4個(gè)因素之間的兩兩交互作用的影響，能從圖中響應(yīng)面曲面的坡度和等高線的疏密來(lái)反映出。結(jié)合三維響應(yīng)曲面與二維等高線可分析出幾個(gè)自變量對(duì)響應(yīng)值的影響情況，等高線中橢圓的離心率越大，響應(yīng)面中圖形的曲線越陡，說(shuō)明其交互作用影響越顯著。

從下列圖中可知響應(yīng)曲面坡度最陡和等高線最密的是BC，也就是說(shuō)乙醇濃度和超聲溫度的交互作用對(duì)芥藍(lán)多酚的影響最為顯著。而AC的響應(yīng)曲面坡度最陡程度次之，等高線最密程度也次之，說(shuō)明對(duì)芥藍(lán)多酚的影響程度次之的是液料比和超聲溫度的交互作用。同理可知，本試驗(yàn)所考察的芥藍(lán)多酚提取率受到各因素之間的交互作用的影響顯著性的順序?yàn)椋築C乙醇濃度和超聲溫度>AC液料比和超聲溫度>CD超聲溫度和超聲時(shí)間>BD乙醇濃度和超聲時(shí)間>AD液料比和超聲時(shí)間>AB液料比和乙醇濃度。

2.3 最佳工藝條件的確定與驗(yàn)證 通過(guò)分析已建立的回歸模型，得到本試驗(yàn)中芥藍(lán)多酚的最佳提取工藝如下：液料比37.94mL/g、乙醇濃度61.01%、超聲溫度62.56℃、超聲時(shí)間33.85min，在此條件下，芥藍(lán)多酚提取率的預(yù)測(cè)值為15.18mg/g。為驗(yàn)證該回歸方程的準(zhǔn)確性，對(duì)得到的最佳工藝進(jìn)行檢驗(yàn)，并且為了試驗(yàn)便利，修正各工藝條件，選取液料比為38mL/g、乙醇濃度為61%、超聲溫度為63℃、超聲時(shí)間為34min，并按修正后條件進(jìn)行3次平行試驗(yàn)，測(cè)得其提取率平均值為15.03mg/g，與該模型的預(yù)測(cè)值（15.18mg/g）相比的相對(duì)誤差只有0.99%，說(shuō)明該回歸模型的準(zhǔn)確性和可信度較高，驗(yàn)證了該模型的有效性。因此，可以利用響應(yīng)面法優(yōu)化芥藍(lán)多酚的提取，這對(duì)于芥藍(lán)多酚的提取與開(kāi)發(fā)提供一定的理論依據(jù)和新的方向。

3 結(jié)論

以芥藍(lán)為原料，考察影響芥藍(lán)多酚的各工藝因素，結(jié)合響應(yīng)面法優(yōu)化試驗(yàn)所得的芥藍(lán)多酚提取工藝，建立了超聲輔助提取芥藍(lán)多酚回歸模型：Y=14.97+0.54A-0.43B+0.17C-0.087D-0.035AB+0.19AC-0.045AD+0.35BC-0.17BD-0.17CD-0.55A2-0.38B2-0.39C2-0.51D2。該回歸模型準(zhǔn)確性和可信度較高，通過(guò)檢驗(yàn)?zāi)Ｐ偷娘@著性，可以得到各因素影響芥藍(lán)多酚提取率的順序如下：液料比>超聲溫度>超聲時(shí)間>乙醇濃度。

在單因素試驗(yàn)的基礎(chǔ)上，結(jié)合響應(yīng)面法優(yōu)化得出超聲輔助提取芥藍(lán)多酚的最佳條件為：液料比38mL/g、乙醇濃度61%、超聲溫度63℃、超聲時(shí)間34min，在此最優(yōu)工藝條件下進(jìn)行平行試驗(yàn)測(cè)得芥藍(lán)多酚提取率的平均值為15.03mg/g，模型的預(yù)測(cè)值（15.18mg/g），兩者相比其相對(duì)誤差為0.99%。表明該模型可以準(zhǔn)確可靠地用于預(yù)測(cè)和分析芥藍(lán)多酚的提取，也為芥藍(lán)多酚的試驗(yàn)研究和資源開(kāi)發(fā)提供了參考依據(jù)。

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（責(zé)編：張宏民）