發(fā)酵毛竹筍制備水溶性膳食纖維工藝優(yōu)化及功能特性研究

吳麗萍，孫虹，朱婷婷，陳佳鈺，蔡永久，胡曉倩

(黃山學院 生命與環(huán)境科學學院，安徽 黃山 245000)

毛竹屬于禾本科、竹亞科、剛竹屬多年生常綠植物[1]，毛竹筍是毛竹根莖上生長的嫩芽，富產(chǎn)于安徽黃山等地。毛竹筍在加工處理過程中產(chǎn)生大量筍尖、筍衣、筍殼等副產(chǎn)物，這些副產(chǎn)物中毛筍殼的膳食纖維(dietary fiber，DF)含量較高，達到30%～45%[2]。但是在實際生產(chǎn)中，毛竹筍殼并未得到合理利用，而被當作廢棄物丟掉，造成了一定的資源浪費與環(huán)境污染。

膳食纖維(DF)是被稱為“第七大營養(yǎng)素”的一種不能被人體消化的多糖[3]，根據(jù)其溶解性的不同，分為水溶性膳食纖維(soluble dietary fiber，SDF)和不溶性膳食纖維(insoluble dietary fiber，IDF)。其中SDF具有改善便秘和調(diào)節(jié)腸道菌群[4]、降血糖、降血脂等功效。資料表明，SDF含量達到10%以上，才被稱為高品質(zhì)膳食纖維[5]，而富含DF的毛竹筍殼僅含SDF 7%左右[6]，因此合理工藝提高水溶性膳食纖維含量才能真正變廢為寶[7]，對推動我國農(nóng)副產(chǎn)品的綜合利用和應用具有重要意義[8]。

微生物發(fā)酵法是制備SDF的新型技術手段[9]，利用微生物產(chǎn)生的復雜酶系作用于農(nóng)副產(chǎn)品底物原料，省略了酶的提取以及純化過程，被廣泛地應用于食品生產(chǎn)和加工過程中[10]。纖維素降解菌可直接用于纖維素降解，降解產(chǎn)物直接作為產(chǎn)能源菌的碳源,形成兩菌共培養(yǎng)的情形[11]，在一定程度上可有效節(jié)約成本，因此在發(fā)酵法制備SDF中應用較多。黑曲霉為絲狀真菌，在適宜發(fā)酵條件下會產(chǎn)生纖維素酶、半纖維素酶等酶系，可將底物大分子纖維素分解為小分子可溶性成分[12]，從而提高SDF含量。毛霉因含有豐富的胞外酶系，包含多種蛋白酶及纖維素酶[13]，可實現(xiàn)多種大分子物質(zhì)的水解與轉化[14]。謝歡等利用黑曲霉發(fā)酵制備豆渣SDF，SDF含量提高了7.19倍；潘進權等[15]利用毛霉發(fā)酵豆渣，顯著提高了豆渣SDF含量。已有的研究報道表明，黑曲霉及毛霉在提高SDF提取率方面效果顯著，但其發(fā)酵毛竹筍下腳料的研究卻鮮見報道。因此，本研究以毛竹筍殼為原料，采用真菌發(fā)酵制備毛竹筍SDF，通過單因素試驗、響應面法優(yōu)化試驗確定發(fā)酵法制備毛竹筍SDF的最佳工藝，并對發(fā)酵前后毛竹筍SDF的表面微觀結構及功能特性進行分析和評價，以期為毛竹筍廢棄物的深度開發(fā)以及SDF的品質(zhì)提升提供理論依據(jù)和技術支撐。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

毛竹筍殼：市售毛竹筍下腳料；黑曲霉GXU003菌株：中國工業(yè)微生物菌種管理保藏中心；毛霉：實驗室分離保藏；馬鈴薯、葡萄糖、瓊脂、(NH4)2SO4、KH2PO4、MgSO4等試劑：均為國產(chǎn)分析純。

1.2 儀器與設備

HH-6型數(shù)顯恒溫水浴鍋 常州國華電器有限公司；800型離心分離機 北京醫(yī)用離心機廠；BS-1E恒溫振蕩培養(yǎng)箱 江蘇宏華儀器廠；MLS-3780-SV型高溫高壓滅菌鍋 松下電器(中國)有限公司上海分公司；JEM-200CX型高分辨透射電鏡 日本JEOL公司。

1.3 方法

1.3.1 菌種培養(yǎng)1.3.1.1 菌種培養(yǎng)基的制備

斜面培養(yǎng)基：采用馬鈴薯葡萄糖瓊脂培養(yǎng)基(PDA)，馬鈴薯300 g、葡萄糖30 g、瓊脂30 g、水1500 mL、pH值自然。

種子培養(yǎng)基：馬鈴薯300 g/L、葡萄糖30 g/L、酵母膏15 g/L、pH值自然、水1500 mL。

毛竹筍發(fā)酵培養(yǎng)基：毛竹筍殼粉末10 g、蒸餾水20 mL、(NH4)2SO42.68、KH2PO42.68、MgSO46.83。

1.3.1.2 種子液的制備

分別將菌株接種于斜面培養(yǎng)基，在28 ℃恒溫培養(yǎng)箱中培養(yǎng)72 h，用無菌水沖淋斜面，制成濃度為108CFU/mL的孢子懸液。將孢子懸液按1 mL/100 mL接種于種子培養(yǎng)基上，150 r/min、28 ℃搖床培養(yǎng)72 h，菌絲體用4層紗布過濾，將種子液的濃度制成108CFU/mL。

1.3.2 毛竹筍發(fā)酵制備SDF工藝流程

毛竹筍發(fā)酵培養(yǎng)基→分別接入10%黑曲霉、毛霉種子液→搖床培養(yǎng)(150 r/min，72 h)→固液分離→上清液→95%乙醇溶液沉淀→離心(3000 r/min，20 min)→干燥→毛竹筍SDF。

1.3.3 SDF提取率的測定

(1)

式中：m1為發(fā)酵毛竹筍得到的SDF質(zhì)量，g；m為發(fā)酵培養(yǎng)基中原毛竹筍的質(zhì)量，g。

1.3.4 纖維素酶活力的測定

纖維素酶活力的測定參照CMC糖化力法[16]，纖維素酶活力單位(unit)的定義：在 37 ℃下，每1 min水解生成 1 g葡萄糖所需的酶量。

1.3.5 發(fā)酵法制備毛竹筍SDF單因素試驗設計

1.3.5.1 菌種對SDF提取率的影響

將毛竹筍渣與水按1∶15(g/mL)混合，分別接種10%黑曲霉或毛霉，按照表1的培養(yǎng)條件搖床培養(yǎng)72 h，測定并計算發(fā)酵后SDF提取率及纖維素酶活力。

表1 不同真菌的培養(yǎng)條件Table 1 The culture conditions of different fungi

1.3.5.2 單因素對SDF提取率的影響

根據(jù)1.3.5.1菌種對SDF提取率的影響結果，選用優(yōu)勢菌種黑曲霉對毛竹筍進行發(fā)酵，研究各因素對毛竹筍SDF提取率的影響。在保證其他條件相同的情況下，分別選擇菌種接種量(2%、6%、10%、14%、18%)、料液比(1∶5、1∶10、1∶15、1∶20、1∶25，g/mL)、發(fā)酵溫度(16，22，28，34，40 ℃)、發(fā)酵時間(0，24，48，72，96，120 h)、發(fā)酵初始pH(3.0，4.0，5.0，6.0，7.0)進行研究，并采用SPSS 18.0對單因素試驗結果進行分析。

1.3.6 響應面試驗設計

以單因素試驗結果為基礎，選擇對SDF提取率影響較大的料液比(A)、接種量(B)、發(fā)酵時間(C)為自變量，根據(jù)Box-Behnken試驗設計原理，將SDF提取率設定為響應值，進行三因素三水平響應面優(yōu)化試驗設計，因素水平表見表2。通過Design Expert 8.0.6對數(shù)據(jù)進行回歸分析，優(yōu)化制取毛竹筍SDF的工藝條件，并預測最優(yōu)工藝參數(shù)。該模型采用最小二乘法擬合二次多項方程：

表2 Box-Behnken試驗設計Table 2 Box-Behnken test design

(2)

式中：Wi為響應值(SDF提取率)，%；β0為常數(shù)；βi為線性系數(shù)；βii為二次項系數(shù)；βij為兩個因素間的交互作用系數(shù)；Xi和Xj為參數(shù)變量(A，B，C)。

1.3.7 發(fā)酵前后毛竹筍SDF理化性質(zhì)的測定

1.3.7.1 持水力的測定

準確稱取發(fā)酵前后毛竹筍SDF各1.0 g(m1)于燒杯中，加入 20 ℃ 的水浸泡60 min后抽濾，將濾紙轉移到質(zhì)量為m2的表面皿中稱得質(zhì)量m3，持水力按式(3)計算：

(3)

1.3.7.2 持油力的測定

準確稱取發(fā)酵前后毛竹筍SDF各2.0 g(m1)的樣品與20 mL花生油放置于50 mL 離心管中，振蕩30 min，使之混合均勻，然后置于離心機內(nèi)以1600 r/min的轉速離心處理25 min，除去上層油液后，甩干稱取的樣品質(zhì)量為m2，持油力按式(4)計算：

(4)

1.3.7.3 膨脹力的測定

準確稱取發(fā)酵前后毛竹筍SDF各0.2 g(m)樣品，置于刻度試管中并記錄其體積V1，加入5.0 mL蒸餾水，混合均勻后在4 ℃條件下放置20 h，記錄樣品吸水后的體積V2，膨脹力按式(5)計算：

(5)

1.3.7.4 溶解性的測定

分別稱取0.5 g發(fā)酵前后毛竹筍SDF于10 mL離心管中，加入5 mL蒸餾水，記為v，攪拌均勻后在室溫下靜置1 h，以3000 r/min離心10 min，收集上清液，在105 ℃烘干至恒重，稱取質(zhì)量m，溶解性按式(6)計算。

(6)

1.3.7.5 膽固醇吸附能力的測定

參考朱玉等[17]的方法進行膽固醇吸附能力的測定。

1.3.8 發(fā)酵前后毛竹筍SDF微觀結構觀察

將發(fā)酵前后毛竹筍SDF經(jīng)干燥處理至質(zhì)量恒定，置于載物臺上，采用表面噴金處理提高其導電性。掃描測試電壓為15 kV，放大倍數(shù)為5000×，通過掃描電鏡觀察毛竹筍SDF發(fā)酵前后的微觀形態(tài)。

1.4 數(shù)據(jù)分析與處理

采用Design-Expert 8.0.6軟件進行響應面分析，運用SPSS 18.0統(tǒng)計分析軟件對數(shù)據(jù)進行單因素方差分析(One-way ANOVA)，并利用Origin 8.0軟件作圖。

2 結果與分析

2.1 單因素結果分析

2.1.1 最佳菌種的確定

不同菌種對SDF提取率及纖維素酶活力的影響見圖1。

圖1 菌種對SDF提取率及纖維素酶活力的影響Fig.1 Effect of strains on the extraction rate of SDF and cellulose activity注：圖中字母代表差異的顯著性(P<0.05)，下同。

由圖1可知，在適宜發(fā)酵條件下，毛霉、黑曲霉在發(fā)酵過程中均能產(chǎn)生纖維素酶，這與胡翠英研究所得到的結果一致。采用黑曲霉發(fā)酵所獲得的SDF提取率為27.12%，纖維素酶活力為2526.3 U/g，均顯著高于毛霉(P<0.05)。纖維素酶活力越高，可使纖維素大分子間的氫鍵斷裂，部分IDF變成SDF，從而使SDF提取率增加[18]。因此，后續(xù)試驗采用黑曲霉作為制取毛竹筍SDF的菌種。

續(xù) 表

2.1.2 黑曲霉接種量對SDF提取率的影響

由圖2可知，黑曲霉接種量對SDF的提取率存在顯著性影響(P<0.05)。SDF提取率隨著黑曲霉接種量的增大呈現(xiàn)先升高后降低的趨勢，在10%時達到最大值(26.50±0.36)%。當黑曲霉接種量不足時，黑曲霉代謝產(chǎn)生的纖維素酶較少，因此SDF提取率較低。而當黑曲霉接種量超過10%時，產(chǎn)生的菌體量增加，造成菌內(nèi)競爭營養(yǎng)物質(zhì)的局面，導致后期菌體生長所需營養(yǎng)不足[19]，從而SDF將被消耗，SDF提取率出現(xiàn)下降趨勢。因此，確定黑曲霉接種量為10%比較適宜。

圖2 黑曲霉接種量對SDF提取率的影響Fig.2 Effect of Aspergillus niger inoculation amount on the extraction rate of SDF

2.1.3 料液比對SDF提取率的影響

料液比對SDF提取率的影響見圖3。

圖3 料液比對SDF提取率的影響Fig.3 Effect of solid-liquid ratio on the extraction rate of SDF

由圖3可知，隨著加水量的增大，SDF提取率呈現(xiàn)先升高后降低的趨勢，在料液比為1∶15(g/mL)時，SDF提取率達到最大，為(26.27±0.25)%。適量提高水的含量即提高溶解氧，可提高黑曲霉菌種的呼吸強度，從而使SDF提取率提高。當料液比較低時，溶液黏度大，溶液中的溶解氧降低，不利于菌絲體的生長。料液比超過1∶15(g/mL)之后SDF提取率反而降低，其原因可能是當培養(yǎng)基中的水分含量過多時，濕度加大，通氣、散熱效果易變差，培養(yǎng)基易結塊成團而抑制微生物產(chǎn)酶[20]，從而降低SDF提取率。因此，較佳的發(fā)酵料液比控制在1∶15(g/mL)比較合適。

2.1.4 發(fā)酵溫度對SDF提取率的影響

發(fā)酵溫度對SDF提取率的影響見圖4。

圖4 發(fā)酵溫度對SDF提取率的影響Fig.4 Effect of fermentation temperature on the extraction rate of SDF

由圖4可知，隨著溫度的升高，SDF提取率呈現(xiàn)先升高后降低的趨勢，在28 ℃達到最大值(25.93±0.25)%。分析原因可能是溫度升高，促進黑曲霉菌種的生長，使其產(chǎn)酶率提高，從而提高了SDF提取率，這與閔鐘熳等的研究結果類似；當溫度高于28 ℃時，SDF提取率呈現(xiàn)下降趨勢，可能是由于溫度升高導致發(fā)酵菌種的活性受到抑制[21]。綜上，發(fā)酵溫度應控制在28 ℃比較適宜。

2.1.5 發(fā)酵初始pH 值對SDF提取率的影響

發(fā)酵初始pH值對SDF提取率的影響見圖5。

圖5 發(fā)酵初始pH 值對SDF提取率的影響Fig.5 Effect of initial pH value of fermentation on the extraction rate of SDF

由圖5可知，當pH小于5.0時，SDF提取率隨著pH值的增大呈現(xiàn)不斷升高的趨勢，pH為5.0時SDF提取率達到最大值(25.40±0.20)%。研究表明，pH值過高或過低不僅會影響菌種生長，還會影響酶本身的空間構象，使酶活力降低，從而使SDF提取率下降。當pH值大于5.0時，偏離最適pH環(huán)境，菌種生長速度減慢，SDF提取率呈現(xiàn)下降趨勢。因此，選擇pH 5.0作為發(fā)酵毛竹筍的適宜pH值，考慮到試驗的高效性及方便性，pH值作為固定值，不作為響應面優(yōu)化的考慮因素。

2.1.6 發(fā)酵時間對SDF提取率的影響

由圖6可知，發(fā)酵時間對于SDF提取率存在顯著性影響。隨著發(fā)酵時間的延長，菌體量逐漸增多，產(chǎn)酶能力增加，SDF提取率隨之升高，在發(fā)酵72 h時，SDF提取率達到(26.23±0.31)%。隨著發(fā)酵時間的延長，黑曲霉發(fā)酵產(chǎn)生的纖維素酶增多，并對毛竹筍殼中的IDF進行降解，將其轉化為SDF，故SDF提取率提高。發(fā)酵72 h后，培養(yǎng)基的基質(zhì)營養(yǎng)消耗過快，無法提供增殖所需的營養(yǎng)物質(zhì)，抑制了菌體的大量增長，SDF分解為小分子糖類，造成產(chǎn)酶能力下降，從而SDF提取率下降。因此，確定較佳的發(fā)酵時間為72 h。

圖6 發(fā)酵時間對SDF提取率的影響Fig.6 Effect of fermentation time on the extraction rate of SDF

2.2 響應面試驗結果分析

2.2.1 回歸模型的建立與分析

綜合單因素試驗結果，為了優(yōu)化發(fā)酵法制取毛竹筍SDF最大提取率，選取料液比(A)、接種量(B)、發(fā)酵時間(C)為自變量，以SDF提取率為指標進行三因素三水平Box-Behnken 響應面試驗設計，試驗結果見表3，方差分析結果見表4。

表3 Box-Behnken試驗結果Table 3 The results of Box-Behnken test

表4 模型回歸方程及方差分析Table 4 The model regression equation and analysis of variance

用Design-Expert軟件對表3中數(shù)據(jù)進行分析，得到3個因素與SDF提取率之間的二次多項回歸模型方程為：Y=26.54+0.98A+0.69B+0.41C+0.50AB-0.15AC-0.12BC-2.93A2-1.41B2-1.21C2。

2.2.2 響應面試驗方差分析

由表4方差分析可知，模型的P<0.0001，呈現(xiàn)出極顯著差異，說明回歸模型對毛竹筍SDF提取率具有很好的預測性。模型決定系數(shù)R2=0.9805>0.95，模型修正決定系數(shù)RAdj2=0.9554，說明回歸模型的可信度高，并且與實際試驗所得數(shù)據(jù)擬合情況較好，呈現(xiàn)高度相關性；失擬項的P=0.2079>0.05，不顯著，說明模型研究以外的因素對毛竹筍SDF提取率的影響較小。單因素A、B以及平方項A2、B2、C2對SDF提取率的影響極顯著(P<0.01)；C影響顯著(P<0.05)，而各因素的交互作用影響不顯著(P>0.05)。由顯著性檢驗F值、P值的大小得出各因素對毛竹筍SDF提取率影響的順序為料液比(A)>接種量(B)>發(fā)酵時間(C)。綜上，可以用該模型回歸方程分析和預測毛竹筍SDF制備工藝的結果，具有一定的實用性[22]。

2.2.3 響應面圖分析

各因素的交互作用顯著情況可根據(jù)曲面圖進行分析，曲面的傾斜程度與顯著性成正相關。響應面圖顯示了料液比、接種量和發(fā)酵時間3個因素之間的交相互作用對SDF提取率的影響，各交互項對毛竹筍SDF提取率的影響見圖7。

圖7 各因素交互作用對毛竹筍SDF提取率影響的響應面圖Fig.7 Response surface diagrams of the influence of the interaction of various factors on the SDF extraction rate of bamboo shoots

由圖7中a，b，c的響應面圖可知，其他因素固定不變時，該因素條件下制取的SDF提取率均先升高后降低，圖在經(jīng)過中心點處取得最大值，趨勢圖呈開口向下的拋物線。根據(jù)響應面圖的陡峭程度可得出料液比對試驗結果影響最大，接種量次之，發(fā)酵時間最小。固定其中一個量不變，考察另外兩個變量的影響情況，曲面傾斜度變化不明顯，即交互作用對試驗結果無顯著影響，這與表4方差分析結果相一致[23]。

2.2.4 最佳工藝條件確定及驗證試驗

以二次線性回歸方程的分析結果為依據(jù)，確定毛竹筍SDF的最佳制備工藝條件為：料液比1∶15.74、接種量10.54%、發(fā)酵時間75.49 h，毛竹筍SDF提取率為26.75%。結合生產(chǎn)實際的可操作性，確定毛竹筍SDF制備的最優(yōu)條件為料液比1∶16、接種量10.5%、發(fā)酵時間75 h。在此條件下進行驗證試驗(n=3)，測得毛竹筍SDF提取率為27.23%，與理論預測值接近，無顯著性差異(P>0.05),說明回歸模型與實際情況呈現(xiàn)較好的擬合度，同時也驗證了響應面試驗分析毛竹筍SDF提取工藝得到的參數(shù)準確可靠，具有一定的實用價值。

2.3 發(fā)酵前后毛竹筍SDF超微結構分析

由圖8可知，發(fā)酵前SDF呈現(xiàn)疏松多孔的空間網(wǎng)狀結構，褶皺較多。黑曲霉發(fā)酵后，SDF分子結構之間變得蓬松且有序，呈現(xiàn)復雜的空間網(wǎng)狀結構，其比表面積相較于發(fā)酵之前有很大程度的增大，這可能是因為黑曲霉發(fā)酵過程中產(chǎn)生大量的纖維素酶、半纖維素酶分解筍中的纖維多糖，分子鏈斷裂，IDF分解成SDF，分子量降低，聚合度減小，比表面積增大。因此，黑曲霉發(fā)酵處理后改變了毛竹筍SDF的表觀結構，而表面微觀結構的變化可能會對其理化性能產(chǎn)生一定影響[24]。

圖8 發(fā)酵前后毛竹筍SDF掃描電鏡圖(5000×)Fig.8 The scanning electron microscope images of bamboo shoots before and after fermentation (5000×)

2.4 發(fā)酵前后毛竹筍SDF功能特性的變化

由表5可知，發(fā)酵后毛竹筍SDF的理化性能較發(fā)酵前均顯著提高(P<0.05)，持水力和持油力分別提高了80.06%和62.88%，膨脹力和溶解性分別提高了75.28%和26.50%。毛竹筍經(jīng)黑曲霉發(fā)酵后，DF組分由于糖苷鍵的斷裂使得大分子物質(zhì)轉變?yōu)樾》肿咏M分，從而使SDF結構變得更為疏松，體積和比表面積增大，親水基團暴露于表面，使得持水力、持油力、膨脹力提高。黑曲霉發(fā)酵后毛竹筍SDF的溶解性達到了7.16 g/g，比發(fā)酵前相同條件下(pH 7.0，28 ℃)提高了26.50%。人體小腸(pH 7.0)是膽固醇主要的消化吸收場所[25]，因此在模擬小腸的中性環(huán)境(pH 7.0)條件下對發(fā)酵前后毛竹筍SDF吸附膽固醇的能力進行比較。結果表明，經(jīng)黑曲霉發(fā)酵后毛竹筍SDF對膽固醇的吸附能力達到1.98 mg/g，比發(fā)酵前提高了115.22%，顯著高于發(fā)酵前的膽固醇吸附能力，可作為功能性食品配料延緩體內(nèi)攝入過多膽固醇。

表5 發(fā)酵前后毛竹筍SDF功能特性的變化Table 5 The changes of functional properties of SDF from bamboo shoots before and after fermentation

3 結論

利用黑曲霉和毛霉發(fā)酵毛竹筍，對比其對纖維素酶活力和SDF提取率的影響，確定黑曲霉作為發(fā)酵毛竹筍的最佳菌種。通過單因素試驗分析和響應面優(yōu)化，以SDF提取率為指標，確定毛竹筍SDF制取的最優(yōu)條件為：料液比1∶16、接種量10.5%、發(fā)酵時間75 h，在此條件下測得毛竹筍SDF提取率為27.23%，比發(fā)酵前提高了20.21%。采用模型回歸方程擬合分析及驗證試驗，證實該模型顯著并且具有較高的相關性。掃描電鏡結果顯示：黑曲霉發(fā)酵后毛竹筍SDF呈現(xiàn)復雜的空間網(wǎng)狀結構，且蓬松有序，比表面積明顯增大。理化特性結果顯示：發(fā)酵后毛竹筍SDF具有較高的持水力、持油力、膨脹力，具備良好的溶解性能以及吸附膽固醇能力。因此，黑曲霉發(fā)酵制取的毛竹筍SDF符合高品質(zhì)膳食纖維的要求，具有一定的應用前景。