高尿酸血癥對(duì)小鼠短期牙周感染牙槽骨破壞的micro-CT分析

羅詠熙， 黃雪瑩， 冼若婷， 余皖鑫， 梁莉欣， 梁兆佳， 陳紫韻， 侯丹， 余挺

廣州醫(yī)科大學(xué)附屬口腔醫(yī)院·口腔醫(yī)學(xué)重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室·廣州口腔疾病研究所，廣東廣州（510182）

慢性牙周炎是口腔菌群失調(diào)引起的可導(dǎo)致牙周組織破壞的慢性感染性疾病。重度牙周炎的全球患病率達(dá)11.2%，是失牙的主要原因［1］。牙周組織破壞的程度主要取決于宿主易感性，牙周炎易感性可受到多種全身代謝病的影響，如心血管疾病、糖尿病、肥胖、代謝綜合征等［2］。宿主代謝免疫失調(diào)是重大代謝病加重牙周炎的重要機(jī)制［3］。高尿酸血癥（hyperuricemia，HU）是繼“三高”（高血壓、高血糖、高血脂）后的第四高，全球患病率約15%，中國(guó)患病率約13.3%［4］。嘌呤分解代謝過(guò)程中，尿酸（uric acid，UA）生成增多或排出減少均可引起HU。UA 結(jié)晶在關(guān)節(jié)中沉積可引起痛風(fēng)性關(guān)節(jié)炎，在關(guān)節(jié)外組織沉積可引起腎結(jié)石、慢性腎病。而且，HU 是多種重大代謝病包括肥胖、糖尿病、心血管疾病、骨質(zhì)疏松癥的危險(xiǎn)因素［5］。HU 主要通過(guò)上調(diào)系統(tǒng)性炎癥導(dǎo)致多器官（包括骨組織）損害［6］。

近年研究顯示，血液、唾液UA 水平變化與多種口腔硬組織疾病相關(guān)，包括根尖周炎［7］、牙周炎［8］、植體周?。?］、牙根吸收［10］。牙周炎患者的血漿UA 水平較健康對(duì)照組更高［11］。在IgA 腎病患者中，伴重度牙周炎者比伴輕中度牙周炎者的血清UA 水平更高［12］。牙周基礎(chǔ)治療后的血清UA 水平較治療前降低［13］。然而，以往研究關(guān)注的血液尿酸水平變化均處于正常生理范圍，尚缺乏HU 與牙周炎關(guān)聯(lián)的直接證據(jù)［14］。鑒于HU 與牙周炎的動(dòng)物模型均已成熟化，利用復(fù)合模型探索兩種疾病的相關(guān)性具備可行性。本研究擬建立HU 與牙周炎的復(fù)合動(dòng)物模型，并探索HU 與牙周炎是否具有相關(guān)性。

1 材料和方法

1.1 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物

實(shí)驗(yàn)動(dòng)物由廣東省醫(yī)學(xué)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心提供。14只SPF級(jí)KM小鼠（雄性，5周齡，體質(zhì)量28～32 g）購(gòu)入后適應(yīng)性喂養(yǎng)3 d。實(shí)驗(yàn)通過(guò)廣州醫(yī)科大學(xué)動(dòng)物實(shí)驗(yàn)中心倫理委員會(huì)批準(zhǔn)（批號(hào)GY2019-028）。

1.2 模型建立

1.2.1 HU 模型建立 將小鼠隨機(jī)分為兩組，即高尿酸（HU）飼料組和正常對(duì)照（NC）飼料組（n＝7）。HU 組喂以誘導(dǎo)飼料（博泰宏達(dá)生物，北京），配方為標(biāo)準(zhǔn)飼料+添加成分（表1）。添加成分為5%氧嗪酸鉀、2.5%尿酸，添加比例參照以往研究［15］。NC 組喂以無(wú)特殊添加成分的標(biāo)準(zhǔn)飼料（廣東省醫(yī)學(xué)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心）作為對(duì)照。HU 模型通過(guò)血清檢測(cè)UA 濃度進(jìn)行驗(yàn)證。以往研究中，小鼠尿酸濃度升高，與對(duì)照組有統(tǒng)計(jì)學(xué)差異，則可認(rèn)為HU 動(dòng)物模型構(gòu)建成功［16］。飼養(yǎng)環(huán)境為SPF 級(jí)，溫度（20～26）℃，3～4 只一籠飼養(yǎng)，自由飲食。誘導(dǎo)期設(shè)為35 d［15］。記錄基線體質(zhì)量和誘導(dǎo)35 d 體質(zhì)量。

1.2.2 牙周炎模型建立 飼料誘導(dǎo)25 d，進(jìn)入牙周炎誘導(dǎo)期。參照以往研究［17］，腹腔注射4%水合氯醛溶液麻醉（0.1 mL/10 g 體質(zhì)量）下，5-0 絲線（愛(ài)惜康，上海強(qiáng)生）結(jié)扎右側(cè)上頜第二磨牙，誘導(dǎo)牙周炎（P 側(cè)），左側(cè)不結(jié)扎作為對(duì)照（C 側(cè)）。結(jié)扎5 d時(shí)，異氟烷氣麻下檢查絲線穩(wěn)定性，若脫落則進(jìn)行二次結(jié)扎。結(jié)扎10 d 后處死，結(jié)扎期間飼料不變。

1.2.3 模型建立的時(shí)間軸 5 周齡的雄性KM 小鼠適應(yīng)性喂養(yǎng)后，隨機(jī)分為兩個(gè)飼料組，分別用誘導(dǎo)飼料和標(biāo)準(zhǔn)飼料喂養(yǎng)，飼料誘導(dǎo)期為35 d，第25 d結(jié)扎右側(cè)上頜第二磨牙，結(jié)扎期間飼料不變，25 d至35 d 為牙周炎誘導(dǎo)期，35 d 處死小鼠，組織取材。

表1 誘導(dǎo)飼料和標(biāo)準(zhǔn)飼料的各成分質(zhì)量分?jǐn)?shù)Table 1 Ingredients′mass fractions in induced food and standard food

1.3 組織取材

飼料誘導(dǎo)前，尾靜脈采空腹全血80 μL，分離血清，凍存（-20 ℃），用于基線UA 檢測(cè)。誘導(dǎo)期結(jié)束后，心臟穿刺采血用于終點(diǎn)UA 檢測(cè)。35 d 頸椎脫臼處死，分離雙側(cè)上頜骨，用以micro-CT 分析。

1.4 血清UA 濃度檢測(cè)

血清置于室溫解凍，按照尿酸試劑盒（建成生物，南京）說(shuō)明操作。檢測(cè)原理為尿酸酶法，產(chǎn)物檢測(cè)采用酶比色法，酶標(biāo)儀測(cè)定產(chǎn)物水平并換算成尿酸濃度。

1.5 頜骨micro-CT 分析

頜骨使用micro-CT（SkyScan1172，Bruker 公司，比利時(shí)）掃描，掃描參數(shù)為80 kV，100 μA，掃描層厚8 μm，掃描結(jié)束后利用配套軟件進(jìn)行三維圖像重建。用于分析的感興趣區(qū)域（region of interest，ROI），下界為第二磨牙的根分叉頂，上界為其根尖，近中界為右上第一磨牙近中根的近中，遠(yuǎn)中界為右上第三磨牙遠(yuǎn)中根的遠(yuǎn)中。每5 層劃定一次ROI，直至完成。分析得出ROI 區(qū)的總體積、扣除牙根后的骨體積以及骨礦物質(zhì)密度。骨體積分?jǐn)?shù)＝扣除牙根后的骨體積/總體積［18］。

1.6 組織學(xué)分析

頜骨掃描結(jié)束后，于常溫下用10%EDTA 脫鈣2 周，沖水過(guò)夜，組織修整，脫水，石蠟包埋，冠狀面朝下。切片，厚度為5 μm，調(diào)整角度使三顆磨牙冠根在一個(gè)平面上，后行蘇木素-伊紅染色，染色后拍照。定性分析牙周炎癥和牙槽骨吸收。具體可參照以往研究［19］。

1.7 統(tǒng)計(jì)學(xué)分析

采用SPSS 22.0 進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)分析，數(shù)據(jù)均符合正態(tài)分布，用均數(shù)± 標(biāo)準(zhǔn)差表示，用t 檢驗(yàn)進(jìn)行比較。對(duì)UA 濃度與牙槽骨吸收指標(biāo)、體質(zhì)量進(jìn)行Pearson 相關(guān)性分析。P < 0.05 為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié) 果

2.1 HU 模型驗(yàn)證

飼料誘導(dǎo)前，NC組體質(zhì)量（30.66±0.78）g，HU組體質(zhì)量（30.92±0.99）g，差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（t＝-0.538，P＝0.601）；飼料誘導(dǎo)35 d 后，NC 組體質(zhì)量（48.96± 3.46）g，HU 組體質(zhì)量（42.35 ± 4.11）g，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（t＝3.106，P＝0.010）。

飼料誘導(dǎo)前，NC 組血清UA（33.33 ± 5.97）μmol/L，HU 組血清UA（29.40 ± 11.03）μmol/L，差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（t＝0.828，P＝0.424）。飼料誘導(dǎo)35 d 后，HU 組血清UA（112.94±26.82）μmol/L，NC組血清UA（72.21 ± 19.95）μmol/L，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（t＝-3.058，P＝0.011）。

2.2 牙周炎模型驗(yàn)證

HU 小鼠中，C 側(cè)、P 側(cè)骨體積分?jǐn)?shù)為（42.41 ±7.81）%、（29.01 ± 11.09）%，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（t＝-2.421，P＝0.036）；C 側(cè)、P 側(cè)骨礦物質(zhì)密度為（0.74 ± 0.08）g/cm3、（0.53 ± 0.16）g/cm3，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（t＝-2.896，P＝0.016）。NC 小鼠獲得的結(jié)果與HU 小鼠類似，C 側(cè)、P 側(cè)骨體積分?jǐn)?shù)為（50.27 ±10.84）%、（29.56 ± 15.27）%，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（t＝-2.709，P＝0.022）；C 側(cè)、P 側(cè)骨礦物質(zhì)密度為（0.73 ± 0.05）g/cm3、（0.52 ± 0.14）g/cm3，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（t＝-3.409，P＝0.007）。兩飼料組牙周炎側(cè)相對(duì)于對(duì)照側(cè)的牙齦乳頭消失，附著喪失明顯，結(jié)締組織大量炎癥細(xì)胞浸潤(rùn)，骨吸收明顯（圖1、圖2）。

2.3 HU 對(duì)牙槽骨吸收的影響

HU 組、NC 組P 側(cè)骨體積分?jǐn)?shù)為（29.01 ±11.09）%、（29.56 ± 15.27）%，差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（t＝-0.072，P＝0.944）；HU 組、NC 組P 側(cè)骨礦物質(zhì)密度為（0.53±0.16）g/cm3、（0.52±0.14）g/cm3，差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（t＝0.038，P＝0.970）。

2.4 血清UA 濃度與牙槽骨吸收的相關(guān)性

Figure 1 micro-CT topograph of the periodontitis side and control side in the HU group and NC group圖1 HU 組與NC 組中牙周炎側(cè)與對(duì)照側(cè)的micro-CT 形貌圖

Figure 2 HE staining of pathology slides on the periodontitis side and control side in the HU group and NC group ×100圖2 HU 組與NC 組中牙周炎側(cè)與對(duì)照側(cè)的HE 染色組織病理圖 ×100

在進(jìn)行UA 濃度與牙槽骨吸收指標(biāo)的相關(guān)性分析之前，先進(jìn)行了UA 濃度與體質(zhì)量的相關(guān)性分析。結(jié)果顯示，UA 濃度與體質(zhì)量無(wú)相關(guān)性（r＝-0.493，P＝0.103）。HU 組P 側(cè)中，UA 濃度與總體積（r＝0.043，P＝0.935）、扣除牙根后的骨體積（r＝0.098，P＝0.854）、骨體積分?jǐn)?shù)（r＝0.097，P＝0.855）及骨礦物質(zhì)密度（r＝0.299，P＝0.565）均無(wú)相關(guān)性；NC 組P 側(cè)中亦發(fā)現(xiàn)類似結(jié)果，UA 濃度與總體積（r＝-0.188，P＝0.721）、扣除牙根后的骨體積（r＝0.08，P＝0.880）、骨體積分?jǐn)?shù)（r＝0.003，P＝0.996）及骨礦物質(zhì)密度（r＝-0.003，P＝0.996）均無(wú)相關(guān)性。

3 討 論

本研究首次建立HU 與牙周炎的聯(lián)合動(dòng)物模型，結(jié)果顯示兩種模型均建立成功。然而，基于micro-CT 的頜骨大體形態(tài)分析未發(fā)現(xiàn)HU 或UA 水平與牙槽骨吸收有直接關(guān)系。micro-CT 的頜骨形態(tài)分析結(jié)果暫不支持HU 與牙周炎相關(guān)。

建立HU 動(dòng)物模型的方法有敲除尿酸氧化酶基因、補(bǔ)充外源性尿酸、補(bǔ)充尿酸前體物質(zhì)、利用尿酸酶抑制劑（如氧嗪酸鉀）抑制尿酸酶活性以及利用抗尿酸排泄藥物（如乙胺丁醇）抑制腎臟排除尿酸［15］。誘導(dǎo)飼料中含有氧嗪酸鉀和尿酸，不僅抑制尿酸酶的活性，而且外源性補(bǔ)充尿酸，從而使血尿酸升高。臨床上，男性血尿酸濃度高于420 μmol/L，女性高于360 μmol/L，即稱為高尿酸血癥。動(dòng)物方面無(wú)具體標(biāo)準(zhǔn)，UA 升高即可認(rèn)為建模成功。絲線結(jié)扎法是使用廣泛的牙周炎造模方法。絲線結(jié)扎可能會(huì)因?yàn)檠乐軇?chuàng)傷、牙齒松動(dòng)、麻醉并發(fā)癥等系列后果造成小鼠進(jìn)食受到影響，從而造成代謝狀態(tài)的偏移［20］。本研究基于前期大量的牙周炎與肥胖復(fù)合造模經(jīng)驗(yàn)［19］，將飼料誘導(dǎo)的HU 模型與結(jié)扎法誘導(dǎo)的牙周炎模型合并，未觀察到模型合并對(duì)兩種成模結(jié)果的明顯干擾。而且，HU 組的體質(zhì)量增長(zhǎng)情況亦符合KM 小鼠在標(biāo)準(zhǔn)飼料下的正常生長(zhǎng)曲線。

飼料誘導(dǎo)不同于注射法與灌胃法，無(wú)法控制小鼠攝入等熱量飼料。高尿酸飼料與基礎(chǔ)飼料盡管存在成分、熱量的輕微差異，但均屬于國(guó)標(biāo)飼料，這并非造成兩飼料組體質(zhì)量差別的原因。相反，標(biāo)準(zhǔn)飼料的單位熱量稍低，但該組小鼠的體質(zhì)量反而更高，可能因?yàn)檎T導(dǎo)飼料中的特殊添加成分氧嗪酸鉀和尿酸造成小鼠食物攝入量減少［21］。本研究結(jié)果顯示，體質(zhì)量與血清UA 或牙槽骨吸收并無(wú)相關(guān)性，故未參與混雜HU 與牙周炎之間的關(guān)系。可能因?yàn)閮娠暳辖M的體質(zhì)量差異（15.6%）在正常范圍，并未達(dá)到超重或肥胖（> 25%體質(zhì)量增長(zhǎng)［22］）。

基于micro-CT 的頜骨大體形態(tài)分析，本研究尚未發(fā)現(xiàn)HU 或UA 水平與牙周炎的相關(guān)性。Narendra 等［23］也發(fā)現(xiàn)牙周炎及其嚴(yán)重程度不影響UA 水平。但也有一些研究表明，血UA 水平與牙周炎及其嚴(yán)重程度呈正向關(guān)系；例如，牙周炎患者的UA水平較牙周健康高［11］；牙周基礎(chǔ)治療降低牙周炎患者的血清UA 水平［13］。但臨床上UA 水平的升高尚在正常生理范圍內(nèi)，并未達(dá)到HU 的標(biāo)準(zhǔn)。動(dòng)物實(shí)驗(yàn)顯示，肥胖狀態(tài)的牙周炎大鼠的UA 水平較牙周健康組高［8］。在牙周炎大鼠中，高脂飲食組的UA 水平較正常飲食組更高［24］。本研究與上述研究存在差異的原因可能有兩點(diǎn)：①兩飼料組的體質(zhì)量差異在正常范圍，未達(dá)到超重；②UA 濃度變化的程度存在差異。尚有研究顯示，牙周炎患者的唾液UA 水平較牙周健康者更低［25］，可能因?yàn)橥僖号c血液的UA 代謝存在差異。

基于該復(fù)合模型，通過(guò)micro-CT 的頜骨大體形態(tài)分析，未發(fā)現(xiàn)HU 對(duì)牙槽骨吸收的不利效應(yīng)，也未發(fā)現(xiàn)尿酸濃度與牙槽骨吸收的相關(guān)性，可能有幾點(diǎn)原因：①牙周炎模型雖然構(gòu)建成功但觀察時(shí)間不夠長(zhǎng)，在短期內(nèi)HU 對(duì)牙槽骨吸收的潛在不利影響未顯現(xiàn)；②樣本量偏小，個(gè)體差異造成的誤差掩蓋了HU 可能存在的不利作用；③系統(tǒng)和牙周組織免疫的全面評(píng)估可能有利于發(fā)現(xiàn)HU 的細(xì)微影響；④不排除HU 可能無(wú)法直接影響但可通過(guò)共發(fā)病如肥胖對(duì)牙周炎間接施加影響［8］。

綜上所述，本研究成功建立HU 與牙周炎的復(fù)合動(dòng)物模型，為HU 與牙周炎的關(guān)系研究打下基礎(chǔ)。micro-CT 的頜骨大體形態(tài)分析暫不支持HU 與牙周炎的直接關(guān)聯(lián)，未來(lái)尚需更大樣本的動(dòng)態(tài)實(shí)驗(yàn)、多時(shí)間點(diǎn)縱向比較以及多水平指標(biāo)分析（組織學(xué)分析和分子生物學(xué)分析）進(jìn)一步探究HU 與牙周炎的關(guān)系。

【Author contributions】Luo YX processed and analyzed the data and wrote the article. Huang XY, Xian RT, Yu WX, Liang LX, and Chen ZY performed the experiments. Liang ZJ directed the data collection and analysis. Hou D guided the writing of the article. Yu T designed the study. All authors read and approved the final manuscript as submitted.