草魚源乳酸菌的分離鑒定及其生物學(xué)特性研究

王 楠 ，尹紀(jì)元，王英英，李瑩瑩，吳斯宇，石存斌，李家豪，曹際振，王 慶

（1. 上海海洋大學(xué)/水產(chǎn)科學(xué)國(guó)家級(jí)實(shí)驗(yàn)教學(xué)示范中心，上海 201306； 2. 中國(guó)水產(chǎn)科學(xué)研究院珠江水產(chǎn)研究所/農(nóng)業(yè)農(nóng)村部漁藥創(chuàng)制重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室/廣東省水產(chǎn)動(dòng)物免疫技術(shù)重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，廣東 廣州 510380）

水產(chǎn)養(yǎng)殖業(yè)是我國(guó)農(nóng)業(yè)經(jīng)濟(jì)的重要組成部分[1]。2019年我國(guó)漁業(yè)生產(chǎn)總值高達(dá)12 934.49億元，草魚作為最重要的淡水養(yǎng)殖品種之一，約占我國(guó)淡水魚總產(chǎn)量的20%[2]。草魚呼腸孤病毒 (Grass carp reovirus, GCRV) 引起的草魚出血病 (Grass carp hemorrhagic disease, GCHD)[3]和嗜水氣單胞菌 (Aeromonas hydrophila)、維氏氣單胞菌 (A. veronii) 等導(dǎo)致的細(xì)菌性敗血癥[4]是目前草魚養(yǎng)殖的主要病害，給我國(guó)草魚養(yǎng)殖業(yè)帶來(lái)了巨大的經(jīng)濟(jì)損失[5]。疫苗雖能有效控制水產(chǎn)病害發(fā)生，且具有安全無(wú)污染的優(yōu)點(diǎn)[6-7]，但草魚用疫苗卻只有草魚出血病滅活疫苗[8]和嗜水氣單胞菌敗血癥疫苗[9]。由于嗜水氣單胞菌血清型復(fù)雜，疫苗免疫不能完全解決草魚細(xì)菌性病害的防控問(wèn)題[10]?？股睾突瘜W(xué)藥物的使用短期有效，但是水產(chǎn)品藥物殘留和病原菌耐藥性問(wèn)題日益嚴(yán)重[11-12]。在水產(chǎn)病害防控過(guò)程中獲得確保水產(chǎn)品質(zhì)量安全、環(huán)境友好且操作簡(jiǎn)便、易于應(yīng)用的綠色漁藥，是促進(jìn)我國(guó)水產(chǎn)養(yǎng)殖健康發(fā)展的當(dāng)務(wù)之急。

乳酸菌等益生菌是一類存在于動(dòng)物黏膜系統(tǒng)中的共生細(xì)菌[13]，對(duì)酸堿膽鹽具有一定的耐受性，能夠很好地適應(yīng)動(dòng)物胃腸道環(huán)境[14]。該菌還能夠分解乳糖等多糖，提高飼料利用率[15]，改善水質(zhì)[16]；其代謝產(chǎn)生的乳酸、細(xì)菌素等物質(zhì)具有維持機(jī)體腸道功能和微生態(tài)平衡[17]、抑制病原微生物生長(zhǎng)[18]、提高魚體特異性和非特異性免疫[19]等作用，因此乳酸菌具有通過(guò)生態(tài)防控減少水產(chǎn)病害發(fā)生，減少或替代抗生素和化學(xué)藥品在水產(chǎn)養(yǎng)殖中使用的潛質(zhì)[20]。

為了獲得魚源益生菌，本研究從健康草魚黏膜系統(tǒng)分離乳酸菌，進(jìn)行形態(tài)學(xué)觀察和種屬鑒定，對(duì)其理化特性、益生能力進(jìn)行評(píng)價(jià)，以期為水產(chǎn)養(yǎng)殖病害生態(tài)防控制劑的研究和應(yīng)用提供候選菌株。

1 材料與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)材料

維氏氣單胞菌、舒伯特氣單胞菌 (A. schubertii)、嗜水氣單胞菌 (A. hydrophila)、遲緩愛德華氏菌 (Edwardsiella tarda)、銅綠假單胞菌 (Pseudomonas aeruginosa) 等病原菌由中國(guó)水產(chǎn)科學(xué)研究院珠江水產(chǎn)研究所水產(chǎn)病害與免疫研究室分離保存，乳酸乳球菌NZ9000 (L. lactis NZ9000)、植物乳桿菌標(biāo)準(zhǔn)株ATCC8014 (L. plantarum ATCC8014) 購(gòu)自廣州勤卓生物科技有限公司。MRS肉湯培養(yǎng)基購(gòu)于北京陸橋技術(shù)有限責(zé)任公司。過(guò)氧化氫 (H2O2)溶液、微生物生化鑒定管等生化試劑均購(gòu)于廣東環(huán)凱微生物科技公司。商品乳酸菌購(gòu)于泉州譽(yù)邦商貿(mào)有限公司。

1.2 草魚源乳酸菌的分離純化

將健康草魚處死后剪取腸道中段，用滅菌PBS溶液除凈腸內(nèi)容物后剪碎腸組織進(jìn)行組織勻漿。取適量勻漿液用滅菌PBS溶液倍比稀釋后涂布于MRS固體培養(yǎng)基上，置于30 ℃恒溫培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。挑取菌落呈白色、邊緣光滑、中間隆起的小菌落接種在MRS液體培養(yǎng)基中擴(kuò)大培養(yǎng)后劃線培養(yǎng)，重復(fù)3次以上，直至菌落形態(tài)完全一致。

1.3 分離菌株形態(tài)學(xué)觀察

1.3.1 菌體形態(tài)觀察 取對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期的菌液于載玻片上酒精燈固定，以結(jié)晶紫初染1 min，水洗，碘液媒染1 min，水洗，95%乙醇脫色20～30 s，水洗，番紅復(fù)染1 min，水洗。置于顯微鏡下觀察分離菌株染色情況和菌體形態(tài)。

1.3.2 菌落形態(tài)觀察 將分離菌株在無(wú)抗MRS固體培養(yǎng)基上三區(qū)劃線，置于30 ℃恒溫培養(yǎng)箱中靜置培養(yǎng)，觀察菌落顏色、大小、邊緣整齊度等特性。

1.4 種屬鑒定試驗(yàn)

1.4.1 初步鑒定 將活化的分離菌株3 000 r·min-1離心5 min后盡棄上清，加入3% H2O2溶液，觀察是否有氣泡產(chǎn)生；挑取菌體至氧化酶試紙表面，觀察菌體顏色變化；取0.05 mL菌液接種于硝酸鹽還原生化反應(yīng)管中30 ℃恒溫培養(yǎng)24 h后，依次滴加硝酸鹽還原甲液、乙液，觀察顏色變化。

1.4.2 生化反應(yīng)分析 將活化的分離菌株在30 ℃培養(yǎng)箱中培養(yǎng)24 h，按照《伯杰氏細(xì)菌鑒定手冊(cè)》[21]，確定其生化反應(yīng)特征。

1.4.3 16S rRNA 鑒定 按照天根基因組DNA提取試劑盒說(shuō)明書提取分離乳酸菌基因組DNA，以16S rRNA通用引物 (27F: 5'-AGAGTTTGATCCTGGCTCAG-3', 1492R: 5'-TACGGCTACCTTGT-TACGACTT-3') 進(jìn)行PCR擴(kuò)增。PCR反應(yīng)條件為：98 ℃預(yù)變性 3 min；98 ℃變性10 s，53 ℃退火10 s，72 ℃延伸30 s，30個(gè)循環(huán)；72 ℃延伸2 min。將PCR產(chǎn)物進(jìn)行瓊脂糖凝膠電泳后測(cè)序分析[22]。

1.5 生長(zhǎng)曲線測(cè)定

將活化的乳酸菌分離株稀釋至相同濃度，按3%比例接種至MRS肉湯中，37 ℃培養(yǎng)并持續(xù)測(cè)定菌液濃度至生長(zhǎng)平臺(tái)期，繪制分離菌株的生長(zhǎng)曲線。選擇分離乳酸菌中發(fā)酵性能最好的菌株進(jìn)行后續(xù)評(píng)價(jià)。

1.6 環(huán)境耐受性評(píng)價(jià)

1.6.1 溫度耐受性評(píng)價(jià) 將分離乳酸菌Y190430按1%接種于MRS肉湯培養(yǎng)基中，分別于20、25、30、37、42 和45 ℃培養(yǎng)，測(cè)量分離菌株在不同溫度條件下的生長(zhǎng)速率。

1.6.2 酸堿耐受性評(píng)價(jià) 將分離菌株Y190430、標(biāo)準(zhǔn)菌株ATCC8014及商品乳酸菌菌液培養(yǎng)至光密度 (OD600) 為 0.08～0.10，以1%分別接種于pH 為 2.0、2.5、3.0、4.0、5.0、5.6、6.0、7.0、8.0、8.5和9.0的MRS肉湯培養(yǎng)基中，最適溫度條件下靜置培養(yǎng)并繪制生長(zhǎng)曲線。

1.6.3 滲透壓耐受性評(píng)價(jià) 將分離菌株Y190430、標(biāo)準(zhǔn)菌株ATCC8014及商品乳酸菌菌液培養(yǎng)至OD600為 0.08～0.10，以1%分別接種在NaCl質(zhì)量分?jǐn)?shù)為0.9%、2%、4%、6%和8%的MRS肉湯培養(yǎng)基中，最適溫度條件下靜置培養(yǎng)并繪制生長(zhǎng)曲線。

1.7 抗生素敏感性試驗(yàn)

采用藥敏紙片法分析分離的乳酸菌抗生素敏感性。吸取200 μL 37 ℃靜置培養(yǎng)12 h，OD600為2.50的分離株菌液涂布于MRS固體培養(yǎng)基上，待干后，分別將青霉素、氨芐西林、多西環(huán)素、四環(huán)素、氯霉素、氟苯尼考、紅霉素和林可霉素的抗生素紙片貼在培養(yǎng)基表面，每組設(shè)置4個(gè)重復(fù)。37 ℃靜置培養(yǎng)過(guò)夜，測(cè)量并記錄抑菌圈直徑。

1.8 益生效果評(píng)價(jià)

1.8.1 產(chǎn)酸性能測(cè)定 將活化的乳酸菌分離株稀釋至相同濃度，按3%比例接種至MRS肉湯中37 ℃培養(yǎng)，持續(xù)監(jiān)測(cè)菌液pH變化，并繪制乳酸菌產(chǎn)酸速率曲線，同時(shí)與植物乳桿菌標(biāo)準(zhǔn)株ATCC8014、商品乳酸菌的產(chǎn)酸性能進(jìn)行比較。

1.8.2 抑菌能力分析 采用打孔平板對(duì)峙法[23]測(cè)定分離菌Y190430對(duì)草魚常見病原菌的拮抗活性，以維氏氣單胞菌、舒伯特氣單胞菌、嗜水氣單胞菌、遲緩愛德華氏菌、銅綠假單胞菌、乳酸乳球菌NZ9000作為指示菌，以植物乳桿菌標(biāo)準(zhǔn)株ATCC8014株和商品乳酸菌作為參考，分別吸取200 μL病原菌菌液均勻涂布到MRS平板上，再用無(wú)菌打孔器 (直徑6 mm) 均勻打3個(gè)孔，每個(gè)瓊脂孔添加60 μL乳酸菌，每組設(shè)置3個(gè)重復(fù)，生理鹽水作為空白對(duì)照，置于37 ℃培養(yǎng)24 h，測(cè)量并記錄抑菌圈直徑，同時(shí)與植物乳桿菌標(biāo)準(zhǔn)株和商品乳酸菌的抑菌性能進(jìn)行比較。

1.9 安全性試驗(yàn)

將分離乳酸菌Y190430和植物乳桿菌標(biāo)準(zhǔn)株ATCC8014以生理鹽水稀釋至終濃度為1×109CFU·mL-1，將平均體質(zhì)量為140.0 g的草魚隨機(jī)分成3組，每組20尾，試驗(yàn)組每天灌胃分離菌200 μL·尾-1，連續(xù)灌胃21 d；對(duì)照組分別每天灌胃植物乳桿菌標(biāo)準(zhǔn)株和PBS 200 μL·尾-1，連續(xù)灌胃21 d，持續(xù)觀察各組草魚精神狀態(tài)和攝食量，并測(cè)量各組草魚體質(zhì)量。

1.10 統(tǒng)計(jì)學(xué)分析

使用SPSS 23.0 統(tǒng)計(jì)軟件對(duì)重復(fù)測(cè)量數(shù)據(jù)進(jìn)行One-way ANOVA方差分析，P＜0.05 表示差異顯著，P＜0.01表示差異極顯著。

2 結(jié)果

2.1 菌株的初步鑒定

通過(guò)反復(fù)劃線純化，從魚體腸道共分離純化得到8株分離菌株，依次編號(hào)為C13、C14、C15、C16、C17、C18、C20、C35，分離菌株在固體培養(yǎng)基中培養(yǎng)后菌落形態(tài)高度一致，菌落呈圓形、白色、表面光滑、邊緣整齊、不透明的小菌落 (圖1-a，表1)。革蘭氏染色結(jié)果為菌體呈短桿狀、兩端鈍圓、染色呈陽(yáng)性 (圖1-b)。

表1 分離菌株的菌落形態(tài)特征Table 1 Colony morphological characteristics of isolated strains

圖1 分離菌株的菌落形態(tài)特征 (a) 及革蘭氏染色 (b)Figure 1 Colony morphological characteristics (a) and gram staining (b) of isolated strains

2.2 魚源乳酸菌的種屬鑒定

分離純化菌株的過(guò)氧化氫酶、氧化酶和硝酸鹽還原反應(yīng)結(jié)果均為陰性，初步判定分離菌株為乳酸菌，并按照《伯杰氏細(xì)菌鑒定手冊(cè)》[21]中細(xì)菌生理生化指標(biāo)對(duì)分離菌株進(jìn)行生化鑒定 (表2)，鑒定結(jié)果表明8株分離乳酸菌均為植物乳桿菌。同時(shí)，通過(guò)16S rRNA PCR對(duì)分離菌株進(jìn)行鑒定，瓊脂糖凝膠電泳分析結(jié)果表明離菌株均在1 500 bp位置有特異性擴(kuò)增條帶 (圖2)。對(duì)PCR產(chǎn)物進(jìn)行測(cè)序分析，16S rRNA測(cè)序比對(duì)結(jié)果表明8株分離菌與植物乳桿菌的相似性均為100%，系統(tǒng)發(fā)育樹見圖3。

圖2 分離菌株的16S rRNA序列的PCR擴(kuò)增結(jié)果Figure 2 PCR amplification results of 16S rRNA sequence of isolated strainsM. DL2 000 Marker; 1. C13; 2. C14; 3. C15; 4. C16; 5. C17;6. C18; 7. C20; 8. C35.

圖3 基于分離菌株16S rRNA序列的系統(tǒng)發(fā)育樹Figure 3 Phylogenetic tree based on 16S rRNA sequences of isolated strains

表2 分離菌株的生理生化特征Table 2 Physiological and biochemical characteristics of isolated strains

2.3 生長(zhǎng)曲線

通過(guò)生長(zhǎng)曲線的測(cè)定對(duì)分離乳酸菌的發(fā)酵性能進(jìn)行評(píng)價(jià)，結(jié)果見圖4。大約在接種后第2小時(shí)菌株進(jìn)入對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期，在接種后第8小時(shí)進(jìn)入平臺(tái)期，其中分離菌株C13具有較好的生長(zhǎng)速率和最好的發(fā)酵濃度及發(fā)酵性能，到達(dá)平臺(tái)期的OD600約為2.257，暫命名為L(zhǎng). plantarum Y190430。

圖4 分離菌株的發(fā)酵生長(zhǎng)曲線Figure 4 Fermentation growth curve of isolated strains

2.4 環(huán)境壓力耐受能力

2.4.1 溫度耐受性 將乳酸菌Y190430分別在20、25、30、37、42和45 ℃條件下進(jìn)行培養(yǎng)，檢測(cè)分離乳酸菌不同溫度條件下的生長(zhǎng)情況(圖5-a )結(jié)果表明分離菌株Y190430在不同溫度條件下均能生長(zhǎng)。在37 ℃溫度條件下分離菌株Y190430生長(zhǎng)速率較快，且平臺(tái)期的菌液濃度最大，OD600為2.257；在42 ℃條件下分離菌株Y190430能夠生長(zhǎng)，發(fā)酵最高OD600為1.328；在45 ℃條件下分離菌株Y190430不再生長(zhǎng)。

2.4.2 酸堿耐受性 將乳酸菌Y190430分別接種在不同pH培養(yǎng)基中，37 ℃條件下培養(yǎng)。分離乳酸菌Y190430能夠耐受的最小pH為3.0，最適生長(zhǎng)pH為5.6，pH 2.0環(huán)境中分離菌株Y190430停止生長(zhǎng)，環(huán)境pH高于7.0時(shí)分離菌株Y190430的生長(zhǎng)速率降低，但是仍可生長(zhǎng)(圖5-b)。分離株Y190430與標(biāo)準(zhǔn)株ATCC8014相比較，在pH為2.0、3.0、4.0時(shí)的生長(zhǎng)速率差異顯著 (P＜0.01)；分離株Y190430與商品株相比較，在pH為2.0、3.0、4.0、5.0、6.0、8.0和9.0時(shí)的生長(zhǎng)速率差異顯著 (P＜0.05，表3)，說(shuō)明分離菌株Y190430具有更強(qiáng)的酸堿耐受性。

表3 分離菌株Y190430對(duì)酸堿的耐受性Table 3 Acid base tolerance of Y190430 strain ±SD

表3 分離菌株Y190430對(duì)酸堿的耐受性Table 3 Acid base tolerance of Y190430 strain ±SD

注：A. 植物乳桿菌Y190430與植物乳桿菌ATCC8014相比較具有顯著性差異；B. Y190340與商品株相比較具有顯著性差異。Note: A. Significant difference between L. plantarum Y190430 and L. plantarum ATCC8014; B. Significant difference between L. plantarum Y190430 and commercial lactobacillus.

商品乳酸菌Commercial lactobacillus 2.0 2.50±0.08AB 1.10±0.03 1.70±0.05 3.0 3.50±0.05AB 2.90±0.02 3.20±0.05 4.0 7.30±0.04AB 5.90±0.04 7.00±0.07 5.0 8.30±0.02AB 8.10±0.07 8.10±0.07 5.6 8.90±0.24 8.80±0.02 8.80±0.07 6.0 8.80±0.04AB 8.50±0.04 8.60±0.07 7.0 8.50±0.02A 8.30±0.02 8.40±0.08 8.0 8.20±0.04B 8.10±0.07 8.00±0.07 9.0 8.00±0.04AB 7.50±0.02 7.70±0.02培養(yǎng)pH Incubation pH菌落總數(shù) CFU/(logCFU·mL-1)植物乳桿菌Y190430 L. plantarum Y190430植物乳桿菌ATCC8014 L. plantarum ATCC8014

2.4.3 滲透壓耐受性 將乳酸菌Y190430分別接種在不同NaCl質(zhì)量分?jǐn)?shù)的MRS液體培養(yǎng)基中，37 ℃條件下培養(yǎng)。分離菌株Y190430對(duì)高滲環(huán)境具有一定耐受性，在8% NaCl培養(yǎng)環(huán)境中，雖然發(fā)酵能力減弱，但是仍可生長(zhǎng) (圖5-c)。在不同滲透壓條件下的適應(yīng)性，分離株Y190430與標(biāo)準(zhǔn)株ATCC8014之間無(wú)顯著性差異 (P＞0.05)。在0.9%、2% NaCl培養(yǎng)環(huán)境中，分離株Y190430與商品株之間存在顯著性差異 (P＜0.05，表4)。

表4 分離菌株Y190430對(duì)滲透壓的耐受性Table 4 Osmotic pressure tolerance of Y190430 strain ±SD

表4 分離菌株Y190430對(duì)滲透壓的耐受性Table 4 Osmotic pressure tolerance of Y190430 strain ±SD

注：B表示植物乳桿菌Y190430與商品株相比具有顯著性差異(P＜0.05)。Note: B represents significant difference between L. plantarum Y190430 and commercial lactobacillus (P＜0.05).

氯化鈉質(zhì)量分?jǐn)?shù)NaCl mass fraction/%菌落總數(shù) CFU/(log CFU·mL-1)植物乳桿菌Y190430 L. plantarum Y190430植物乳桿菌ATCC8014 L. plantarum ATCC8014商品乳酸菌Commercial lactobacillus 0.9 8.90±0.08B 8.80±0.08 8.50±0.16 2.0 8.70±0.16B 8.50±0.16 7.90±0.16 4.0 7.10±0.16 6.90±0.08 6.90±0.16 6.0 6.50±0.08 6.70±0.16 6.40±0.16 8.0 5.10±0.24 5.00±0.16 4.70±0.20

圖5 分離菌株Y190430的環(huán)境耐受性分析結(jié)果a. 溫度耐受性；b. 酸堿耐受性；c. 滲透壓耐受性。Figure 5 Environmental tolerance analysis results of Y190430 straina. Temperature tolerance; b. Acid base tolerance;c. Osmotic pressure tolerance.

2.5 抗生素敏感性

用多種抗生素的微生物藥敏片對(duì)植物乳桿菌Y190430的抗生素敏感性進(jìn)行評(píng)價(jià)。抑菌直徑與標(biāo)準(zhǔn)抑菌直徑比較結(jié)果表明，分離的植物乳桿菌對(duì)氨芐西林、多西環(huán)素、四環(huán)素、氟苯尼考、氯霉素、紅霉素和林可霉素等常見抗生素敏感；對(duì)青霉素較敏感 (表 5)。

2.6 益生性能評(píng)價(jià)

2.6.1 產(chǎn)酸性能 乳酸菌可以通過(guò)分泌乳酸等有機(jī)酸，調(diào)節(jié)環(huán)境pH、抑制病原微生物。因此乳酸菌的產(chǎn)酸能力可以間接評(píng)價(jià)其益生效果。測(cè)定分離菌株Y190430的產(chǎn)酸速率曲線，同時(shí)以植物乳桿菌標(biāo)準(zhǔn)菌株ATCC8014以及商品乳酸菌作為參考。接種后0 h分離菌株Y190430、標(biāo)準(zhǔn)菌株ATCC8014和商品菌株的pH均為5.85；接種后2 h分離菌株Y190430、標(biāo)準(zhǔn)菌株ATCC8014和商品菌株的pH分別為5.54、5.60、5.72；接種后8 h分離菌株Y190430、標(biāo)準(zhǔn)菌株ATCC8014和商品菌株的pH分別為4.07、4.20、4.52；分離菌株Y190430、標(biāo)準(zhǔn)菌株ATCC8014和商品菌株發(fā)酵液能夠達(dá)到的最小pH分別為3.55、3.56、3.80(圖6)。相較于標(biāo)準(zhǔn)株ATCC8014，分離菌株Y190430在接種后8～12 h，培養(yǎng)基pH值差異顯著(P＜0.05)，12 h后無(wú)顯著差異 (P＞0.05)；與商品株相比較，在接種2 h后，培養(yǎng)基pH差異極顯著 (P＜0.01)，表明分離株Y190430具有更高的產(chǎn)酸速率。2.6.2 抑菌能力 分離獲得的草魚源植物乳桿菌對(duì)水產(chǎn)養(yǎng)殖中的常見致病菌均具有一定抑制作用(表6)。與標(biāo)準(zhǔn)株ATCC8014相比較，分離株Y190430對(duì)嗜水氣單胞菌、遲緩愛德華氏菌、銅綠假單胞菌和維氏氣單胞菌的抑菌效果更強(qiáng)，具有顯著性差異 (P＜0.05)。與商品株相比較，分離株Y190430對(duì)遲緩愛德華氏菌、銅綠假單胞菌和維氏氣單胞菌的抑菌效果更強(qiáng)，具有顯著性差異 (P＜0.05)。分離株Y190430對(duì)植物乳桿菌、乳酸乳球菌等益生菌不產(chǎn)生抑制作用。

圖6 分離株Y190430的產(chǎn)酸性能a. 與標(biāo)準(zhǔn)株相比較具有顯著性差異；b. 與商品株相比較具有顯著性差異；ab. 與標(biāo)準(zhǔn)株、商品株相比較均具有顯著性差異。Figure 6 Ability to produce acid of Y190430 straina. Compared with standard strain, there is a significant difference;b. Compared with commercial lactobacillus, there is a significant difference; ab. Compared with standard strain and commercial lactobacillus, there is a significant difference.

2.7 安全性評(píng)價(jià)

安全性試驗(yàn)中以分離菌株連續(xù)21 d口服灌胃草魚，試驗(yàn)期間草魚無(wú)一死亡，相較于對(duì)照組，試驗(yàn)組草魚攝食、游動(dòng)未見異常。試驗(yàn)期間，PBS對(duì)照組草魚平均體質(zhì)量由141.3 g生長(zhǎng)至147.0 g，標(biāo)準(zhǔn)株對(duì)照組草魚平均體質(zhì)量由139.1 g生長(zhǎng)至146.1 g，分離株試驗(yàn)組草魚平均體質(zhì)量由139.6 g生長(zhǎng)至146.6 g。相較于兩組對(duì)照組，草魚體質(zhì)量增重在試驗(yàn)期間均無(wú)顯著差異 (P＞0.05)。結(jié)果表明口服分離菌株草魚安全性較好，對(duì)其生長(zhǎng)未產(chǎn)生顯著影響。

3 討論

據(jù)《2020中國(guó)水生動(dòng)物衛(wèi)生狀況報(bào)告》，2019年我國(guó)養(yǎng)殖草魚因各種病害造成的測(cè)算經(jīng)濟(jì)損失約25.8億元[24]，嚴(yán)重危害了我國(guó)草魚養(yǎng)殖業(yè)的健康發(fā)展?？股氐人幬镫m然有效但在使用時(shí)存在諸多問(wèn)題[25-26]。乳酸菌等益生菌是健康魚類黏膜系統(tǒng)內(nèi)天然共生的一類益生菌，可通過(guò)維持或調(diào)節(jié)宿主腸道微生物平衡，改善宿主健康和生長(zhǎng)性能[27]，研究發(fā)現(xiàn)在虹鱒 (Oncorhynchus mykiss)[28]、凡納濱對(duì)蝦 (Litopenaeus vannamei)[29]和海參 (Apostichopus japonicus)[30]等水產(chǎn)動(dòng)物的日糧中添加乳酸菌能促進(jìn)生長(zhǎng)、提高抗病力，并可以與腸道內(nèi)有害菌產(chǎn)生競(jìng)爭(zhēng)，確保腸道健康[31]。本研究從健康草魚腸黏膜系統(tǒng)中篩選獲得8株乳酸乳桿菌，經(jīng)鑒定均為植物乳桿菌。植物乳桿菌在水產(chǎn)健康養(yǎng)殖中的應(yīng)用早有報(bào)道，Man和Xiang[32]發(fā)現(xiàn)植物乳桿菌與其他乳酸菌相比較產(chǎn)酸性能更強(qiáng)，能更好地穩(wěn)定微環(huán)境pH；其代謝產(chǎn)生的乳酸菌素是一種生物防腐劑，可以抑制池塘底部餌料和糞便腐爛，降低水體中氨氮和亞硝酸鹽含量；王水泉等[33]研究發(fā)現(xiàn)植物乳桿菌分解和利用植物多糖的能力更強(qiáng)，能夠更好地提高飼料利用率、凈化水質(zhì)；劉佳琪等[34]構(gòu)建表達(dá)IPNV VP2蛋白的重組虹鱒源植物乳桿菌，口服飼喂虹鱒后能夠顯著提高其抗感染能力。

發(fā)酵能力是評(píng)價(jià)生物工程菌的重要指標(biāo)之一，快速增殖的乳酸菌在腸道環(huán)境中更容易獲得競(jìng)爭(zhēng)優(yōu)勢(shì)，與其他細(xì)菌競(jìng)爭(zhēng)黏膜真皮層的黏附位點(diǎn)[35-36]和營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)[37]，進(jìn)而競(jìng)爭(zhēng)性抑制微環(huán)境中的病原微生物[38]。本研究對(duì)8株分離乳酸菌生長(zhǎng)曲線進(jìn)行測(cè)定，結(jié)果顯示植物乳桿菌Y190430的生長(zhǎng)速率較快，發(fā)酵濃度最高，具有作為生物工程菌的應(yīng)用潛力。此外，由于環(huán)境中的pH、溫度和鹽度對(duì)細(xì)菌繁殖生長(zhǎng)具有抑制作用，因此乳酸菌在消化道中的發(fā)酵效果也與菌株對(duì)pH、溫度和鹽度等環(huán)境因素的耐受能力有關(guān)。有研究表明有胃魚類的胃內(nèi)pH最低能達(dá)2[39]，鯉科等無(wú)胃魚類的消化道內(nèi)pH近中性[40]，本研究酸堿耐受試驗(yàn)表明植物乳桿菌Y190430能夠耐受的環(huán)境最小pH為3.0，因此可以直接在無(wú)胃魚類健康養(yǎng)殖中進(jìn)行應(yīng)用，而在有胃魚類病害防控應(yīng)用中則需要通過(guò)與殼聚糖等生物高分子混合，提高菌劑在胃內(nèi)的成活率[41]。分離株Y190430的最適培養(yǎng)溫度為37 ℃，在20 ℃生長(zhǎng)速率雖有所下降，但仍可正常生長(zhǎng)；由于魚類為變溫動(dòng)物，草魚等淡水魚類的最適養(yǎng)殖溫度為20～30 ℃[42]，本研究分離株在20 ℃條件下仍可保持較好的生長(zhǎng)性能，因此適合在淡水養(yǎng)殖中應(yīng)用。此外，在飼料加工和生物技術(shù)操作過(guò)程中常會(huì)在一定范圍內(nèi)提高培養(yǎng)或加工溫度，本研究分離乳酸菌可以耐受42 ℃，對(duì)高溫環(huán)境具有一定耐受性，具有作為生物工程菌進(jìn)行生物工程操作和改造的潛質(zhì)。

乳酸菌是公認(rèn)的益生菌，具有改善消化道微環(huán)境、提高宿主免疫力、抑制病原微生物等作用，研究表明乳酸菌廣泛分布在動(dòng)物腸道中，維持消化道微生物群落穩(wěn)定[43]、抑制腸道內(nèi)致病菌的生長(zhǎng)繁殖，與人類[44]和水產(chǎn)養(yǎng)殖動(dòng)物[35]的健康密切相關(guān)。乳酸菌能通過(guò)產(chǎn)生乳酸[45]、細(xì)菌素、H2O2及小分子肽類等[46]代謝產(chǎn)物對(duì)腸道致病菌產(chǎn)生抑菌或殺菌作用，Cai 等[47]證實(shí)乳酸菌分泌產(chǎn)生的乳酸是其抑菌的重要物質(zhì)基礎(chǔ)。本研究對(duì)植物乳桿菌Y190430的產(chǎn)酸性能進(jìn)行評(píng)價(jià)，與植物乳桿菌標(biāo)準(zhǔn)株ATCC8014相比較，分離菌株Y190430具有更好的產(chǎn)酸速率。為了進(jìn)一步評(píng)價(jià)分離乳酸菌對(duì)病原菌的抑制能力，及其對(duì)其他益生菌菌株的影響，本研究發(fā)現(xiàn)從健康草魚黏膜系統(tǒng)分離獲得的草魚源植物乳桿菌Y190430對(duì)嗜水氣單胞菌、維氏氣單胞菌等幾種能夠引起草魚發(fā)病的條件病原菌均有一定的抑制作用；對(duì)植物乳桿菌ATCC8014和乳酸乳球菌NZ9000無(wú)抑制作用。與植物乳桿菌標(biāo)準(zhǔn)株ATCC8014相比較，分離株Y190430對(duì)嗜水氣單胞菌、銅綠假單胞菌和維氏氣單胞菌的抑菌作用更顯著，表明該菌株對(duì)能夠針對(duì)性抑制導(dǎo)致草魚病害的主要病原菌，具有作為草魚病害生態(tài)防控制劑的潛質(zhì)。

益生菌的安全性是其能否在生產(chǎn)中應(yīng)用的重要前提。益生菌使用不當(dāng)會(huì)引起宿主出現(xiàn)病理變化，有研究表明枯草芽孢桿菌 (Bacillus subtilis) 可引起斑節(jié)對(duì)蝦 (Penaeus monodon) 細(xì)菌性白斑綜合征[48]；蠟樣芽孢桿菌 (B. cereus) 可引起刺參“腐皮綜合征”和凡納濱對(duì)蝦白斑綜合征[49-50]。閆肅等[51]研究發(fā)現(xiàn)，部分乳酸菌具有溶血活性，也能夠?qū)λ拗鳟a(chǎn)生一定傷害。為評(píng)價(jià)分離菌株Y190430的安全性，本研究將1×109CFU·mL-1分離乳酸菌Y190430菌液以200 μL·尾-1連續(xù)21 d口服灌胃草魚，試驗(yàn)期間草魚無(wú)一死亡，與對(duì)照組相比較，試驗(yàn)組草魚攝食、游動(dòng)等行為無(wú)顯著異常，且生長(zhǎng)速度更快，但與對(duì)照組相比無(wú)顯著性差異 (P＞0.05)。

抗菌藥物在保證人類和動(dòng)物健康的同時(shí)，也帶來(lái)了嚴(yán)重的耐藥問(wèn)題。水產(chǎn)養(yǎng)殖動(dòng)物主要細(xì)菌性病原的耐藥現(xiàn)象普遍存在[52]。益生菌如果攜帶抗生素耐藥性基因，在使用過(guò)程中很可能通過(guò)轉(zhuǎn)化、轉(zhuǎn)座等方式轉(zhuǎn)移到環(huán)境微生物中，使環(huán)境中的病原微生物獲得抗生素耐藥性[53]，對(duì)人類健康和生態(tài)環(huán)境造成潛在威脅。恩諾沙星、氟苯尼考、多西環(huán)素和磺胺甲唑是目前用于水產(chǎn)養(yǎng)殖動(dòng)物細(xì)菌性疾病防治的主要藥物[54]。乳酸菌可能涉及青霉素類[55]、氨基糖苷類[56]和四環(huán)素類[57]的耐藥基因及其耐藥基因可轉(zhuǎn)移的風(fēng)險(xiǎn)。本研究評(píng)價(jià)了分離菌株Y190430對(duì)氨芐西林等常見抗生素的敏感性，結(jié)果表明植物乳桿菌Y190430對(duì)氟苯尼考、恩諾沙星和多西環(huán)素等常見抗生素的敏感性佳，在應(yīng)用中既能有效規(guī)避耐藥轉(zhuǎn)移對(duì)人和環(huán)境造成的潛在危害，又能為科學(xué)用藥提供指導(dǎo)意見。

4 結(jié)論

本研究從健康草魚消化道黏膜中分離獲得8株乳酸菌，經(jīng)16S rRNA鑒定和生化反應(yīng)鑒定此8株乳酸菌均為植物乳桿菌，通過(guò)比較生長(zhǎng)速率，篩選獲得發(fā)酵性能最好的菌株Y190430。該分離菌株具有較好的環(huán)境耐受性和抗生素敏感性，具有作為生物工程菌開發(fā)和應(yīng)用的潛質(zhì)。此外該分離菌株還具有很好的產(chǎn)酸性能和常見水產(chǎn)病原微生物拮抗作用，可作為水產(chǎn)病害生態(tài)防控的候選菌株。后期將對(duì)分離菌株體內(nèi)抑菌能力和抗病毒能力展開進(jìn)一步研究，以期能夠更好地作為益生菌制劑應(yīng)用于水產(chǎn)動(dòng)物病害的生態(tài)防控。