• <tr id="yyy80"></tr>
  • <sup id="yyy80"></sup>
  • <tfoot id="yyy80"><noscript id="yyy80"></noscript></tfoot>
  • 99热精品在线国产_美女午夜性视频免费_国产精品国产高清国产av_av欧美777_自拍偷自拍亚洲精品老妇_亚洲熟女精品中文字幕_www日本黄色视频网_国产精品野战在线观看 ?

    4種中草藥單體對嗜熱四膜蟲生長和凋亡的影響

    2021-12-22 05:56:56潘厚軍康佳磊張德鋒常藕琴王亞軍蔣俊賢石存斌
    南方水產科學 2021年6期
    關鍵詞:蘆薈青蒿素黃素

    潘厚軍,康佳磊,張德鋒,常藕琴,任 燕,王亞軍,蔣俊賢,王 琳,石存斌

    (中國水產科學研究院珠江水產研究所/農業(yè)農村部漁用藥物創(chuàng)制重點實驗室/廣東省水產動物免疫技術重點實驗室,廣東 廣州 510380)

    長期以來寄生蟲疾病給魚類養(yǎng)殖造成了巨大的經濟損失,且難以得到有效控制。寄生蟲侵襲魚體,不但引起魚類生長發(fā)育緩慢,抵抗力下降,苗種大量寄生時還可直接引起大量死亡,造成較大的經濟損失[1]。其中纖毛類寄生蟲對魚類苗種危害尤為嚴重,例如多子小瓜蟲 (Ichthyophthirius multifiliis) 感染,死亡率可高達90%,甚至造成“全軍覆滅”。由于寄生蟲具有依賴于宿主才能完成其生活史的特性,其離體培養(yǎng)非常困難,這是寄生蟲藥物篩選的技術瓶頸[1]。

    嗜熱四膜蟲 (Tetrahymena thermophila) 是一種單細胞真核生物,在分類地位上隸屬于原生動物門、纖毛綱,因其可在實驗室條件下純培養(yǎng)、具有成熟的分子操作技術和清晰的遺傳背景而成為一種被廣泛研究的模式生物[2-4]。采用嗜熱四膜蟲,不僅在細胞和分子生物學方面獲得重要成果,在藥物研發(fā)方面也取得了重要進展,已有部分學者分析了多種藥物對嗜熱四膜蟲生長繁殖、氧化應激、基因表達等方面的影響[5-10],為嗜熱四膜蟲作為模式生物、篩選抗蟲藥物奠定了前期研究基礎。

    研究發(fā)現,在魚類養(yǎng)殖過程中,中草藥及其有效成分如青蒿 (Artemisia annua)[11]、大黃 (Rheum palmatum)[12]、黃連 (Coptis chinensis)[13]等的使用不僅可以預防寄生蟲病害[14-15],還可以提升魚體的免疫力[16]和抗氧化性能[17],是控制魚類寄生蟲病藥物篩選的寶庫。中草藥單體是從中草藥的根、莖、葉等部位中提取并高度純化的物質,其化學成分明確,作用機理可循[18-19],是良好的替抗藥物的候選。本研究以康奈爾大學惠贈的嗜熱四膜蟲Cu428.2株為實驗對象,研究青蒿素、大黃素、蘆薈大黃素、小檗堿 (又名黃連素) 4種中草藥單體對Cu428.2蟲株增殖、氧化應激指標活性以及細胞凋亡的影響,以期建立利用嗜熱四膜蟲篩選抗魚纖毛類寄生蟲中草藥的方法。

    1 材料與方法

    1.1 嗜熱四膜蟲蟲株、培養(yǎng)基及試劑

    嗜熱四膜蟲Cu428.2株由美國康奈爾大學惠贈;Neff培養(yǎng)基配方為多價蛋白胨2.5 g,酵母提取物 2.5 g,D-無水葡萄糖 5.0 g,9.0 g·L-1三氯化鐵 (FeCl3) 儲存液1.0 mL,蒸餾水1 L,121 ℃滅菌30 min,常溫保存;總超氧化物歧化酶 (Superoxide dismutase, SOD)、過氧化氫酶 (Catalase,CAT)、丙二醛 (Malonyldialdehyde, MDA) 檢測試劑盒購于南京建成生物工程研究所,Hoechst 33258染色試劑盒為上海碧云天生物技術有限公司出品。

    1.2 儀器與設備

    Elipse Ti數碼倒置熒光顯微鏡 (日本Nikon公司);IC 1000 (Countstar) 細胞計數儀(上海瑞鈺生物科技公司);ZWY-200D恒溫培養(yǎng)振蕩器(上海智誠分析儀器制造有限公司);3K-15高速冷凍離心機 (德國Sigma公司);Infinite M200 Pro多功能酶標儀(瑞士Tecan公司);電子天平(上海舜宇恒平科學儀器有限公司)。

    1.3 中草藥單體

    4種中草藥單體詳見表1。分別稱取中草藥單體100 mg,加入10 mL助溶劑二甲基亞砜(DMSO,細胞培養(yǎng)級別,Sigma-Aldrich公司),即刻加入無菌水 90 mL,配成含 1.0 mg·mL-1(1.0 g·L-1) 藥液的母液,DMSO體積分數為10% (0.1 mL·mL-1),4 ℃保存?zhèn)溆?。使用時加適量培養(yǎng)液稀釋至所需濃度。

    表1 實驗的4種中草藥單體Table 1 Four kinds of Chinese herbal monomers used in experiment

    1.4 嗜熱四膜蟲的活化培養(yǎng)

    取室溫保存的嗜熱四膜蟲,以5%接種于10 mL Neff培養(yǎng)基中,28 ℃靜置培養(yǎng)24~48 h,至對數生長期,再按照培養(yǎng)基總體積的2% (1.0 mL)接種于 49 mL Neff培養(yǎng)基中,28 ℃ 100 r·min-1培養(yǎng)24 h至對數生長初期。

    1.5 Hoechst 33 258檢測細胞凋亡

    取對數生長期的嗜熱四膜蟲按終密度5.5×104個·mL-1接種于50 mL反應體系的Neff培養(yǎng)液中。設置對照組 (DMSO 20 mg·L-1) 和中草藥單體實驗組 (質量濃度分別為 2.0、20、200 mg·L-1),于 28 ℃、100 r·min-1搖床培養(yǎng) 48 h 后,10 000 r·min-1離心5 min收集細胞,棄上清。加沉淀2~3倍體積的Hoechst 33258染色液,室溫避光培養(yǎng)20 min,2 000 r·min-1離心5 min棄染液。用磷酸鹽緩沖溶液 (PBS, pH 7.4) 洗2次,取20 μL細胞懸液滴在載玻片上,加入抗熒光淬滅封片液,并蓋上潔凈的蓋玻片。熒光顯微鏡紫外光下觀察細胞凋亡形態(tài)。

    1.6 細胞計數與細胞活力測定

    1.6.1 藥物暴露 對數生長期的嗜熱四膜蟲按終密度 5.5×104個·mL-1接種于50 mL 反應體系的Neff培養(yǎng)液中,加入死亡率介于0~100% (需經預實驗)、按常用對數間距0.2設置6個質量濃度(5.0、8.0、12.5、20、32、50 mg·L-1) 的受試藥物及10% DMSO溶劑組,每個濃度組設置3個平行,并設置空白對照 (僅培養(yǎng)基) 及不加藥物對照(有培養(yǎng)基、嗜熱四膜蟲,不加藥物),于28 ℃、100 r·min-1的搖床中培養(yǎng)暴露處理24 h,進行細胞計數和CCK-8法細胞活力測定。

    1.6.2 細胞計數 取待測的嗜熱四膜蟲試液,用75%乙醇以1∶1固定,取20 μL加入Countstar計數板,使用Countstar細胞計數儀測定細胞數量,實驗重復3次,計算平均值 (±SD)。以中草藥單體質量濃度 (mg·L-1) 為橫坐標,嗜熱四膜蟲密度(104個·mL-1) 為縱坐標,繪制嗜熱四膜蟲密度在不同濃度單體作用下的折線圖。同時采用SPSS 20.0軟件計算藥物對嗜熱四膜蟲生長的半抑制濃度(IC50)和95%置信區(qū)間 (95% CI)。

    1.6.3 CCK-8細胞活力 取藥物處理后的嗜熱四膜蟲試液,加入96孔板,每孔加入10 μL的CCK-8試劑混勻,28 ℃培養(yǎng)4 h,使用酶標儀450 nm處測定吸光度 (A)。CCK-8活力計算公式為:細胞活力 (T/C, %)=[(A實驗-A空白)]/[(A對照-A空白)]×100%。每個濃度設6個復孔,實驗重復3次,計算平均值(±SD)。

    參考1.6.2 的方法,以中草藥單體質量濃度(mg·L-1) 為橫坐標,CCK-8 細胞活力 (T/C, %) 為縱坐標,繪制細胞活力在單體作用下的折線圖,同時采用SPSS 20.0軟件計算藥物對嗜熱四膜蟲生長的IC50和 95% CI。

    1.7 氧化應激指標測試

    根據1.6中 IC50的結果,設置50 mL (Neff培養(yǎng)基+中草藥單體) 試液體系,質量濃度按等對數間距,4個藥物均設置1.25、3.2、5.0、8.0、12.5、20.0、32.0、50 mg·L-1的試液,每個濃度分別設置3個平行,另設置DMSO對照組。移取對數生長期的嗜熱四膜蟲,按5%的比例至各實驗體系中,28 ℃、100 r·min-1搖床培養(yǎng),即置于有藥物的試液中處理4 h,10 000 r·min-1離心10 min,去上清,留沉淀提取嗜熱四膜蟲細胞,使用PBS洗2遍,在冰上勻漿。4 ℃、3 500 r·min-1離心10 min,將上清液吸出,分裝入凍存管 -80 ℃保存?zhèn)溆谩J褂媚暇┙ǔ缮锕境銎返腟OD、CAT、MDA檢測試劑盒,測定不同濃度中草藥單體作用下的酶活力,具體測試方法參照試劑盒說明。

    以藥物質量濃度 (mg·L-1) 為橫坐標,酶活力(U·mg-1) 為縱坐標,繪制嗜熱四膜蟲的3種酶活力在中草藥單體作用下的柱形圖。采用 SPSS 20.0軟件進行統(tǒng)計處理分析,組間比較采用單因素方差分析 (One-way ANOVA),以P<0.05為差異有統(tǒng)計學意義,分析4種中草藥單體對SOD、CAT、MDA的影響。

    2 結果

    2.1 中草藥單體對嗜熱四膜蟲凋亡的影響

    不同濃度的4種中草藥單體 (青蒿素、大黃素、蘆薈大黃素、小檗堿) 對嗜熱四膜蟲處理24 h后,經過Hoechst 33258 染色,結果見圖1。隨著藥物濃度的增加,產生強熒光的著色細胞增多,4種中草藥單體藥物高濃度處理組 (20~200 mg·L-1) 比對照組的細胞著色明顯增加,大量嗜熱四膜蟲的細胞核呈濃染致密、明亮鮮艷的顆粒狀熒光。2.0 mg·L-1處理組,除青蒿素外,3種藥物的凋亡細胞亦比對照組顯著增加,其中青蒿素2.0 mg·L-1處理組凋亡細胞比對照組少。

    圖1 4種中草藥單體對嗜熱四膜蟲Cu428.2凋亡的影響 (Hoechst 33258試劑染色)A. 青蒿素;B. 大黃素;C. 蘆薈大黃素;D. 小檗堿;1、2、3、4示藥物質量濃度分別為0、2.0、20、200 mg·L-1。Figure 1 Effect of four kinds of Chinese herbal monomers on apoptotic morphology of T. thermophila Cu428.2 (stained by Hoechst 33258)A. Artemisinin; B. Emodin; C. Aloe-emodin; D. Berberine; 1, 2, 3 and 4 show the monomer concentration as 0, 2.0, 20, 200 mg·L-1; respectively.

    2.2 中草藥單體對嗜熱四膜蟲種群增長和細胞活力的影響

    將4種中草藥單體稀釋成不同濃度,分別處理嗜熱四膜蟲,細胞計數法測得的嗜熱四膜蟲活細胞密度和CCK-8法測得的細胞活力結果見圖2,2種方法計算的IC50結果見表2。CCK-8法與活細胞計數法結果較為一致,隨著3種中草藥單體 (大黃素、蘆薈大黃素、小檗堿) 濃度的增加,采用計數法測量的活細胞密度、CCK-8法測量的細胞活力均降低;而青蒿素在低質量濃度 (5.0 mg·L-1) 增加,質量濃度≥8.0 mg·L-1降低。

    表2 活細胞計數法、CCK-8法測得的4種中草藥單體對嗜熱四膜蟲的半抑制濃度Table 2 50% inhibitory concentration (IC50) of four kinds of Chinese herbal monomers to T. thermophila Cu428.2 determined by living cell counting method and CCK-8 test

    圖2 不同濃度的4種單體作用下嗜熱四膜蟲Cu428.2株的活細胞密度和CCK-8細胞活力a. 活細胞密度;b. CCK-8細胞活力。Figure 2 Cell Density and CCK-8 Cell viability of T. thermophila Cu428.2 at different concentrations of four kinds of Chinese herbal monomersa. Living cell density; b. CCK-8 cell viability.

    IC50結果為:采用細胞計數法,抑制作用由強到弱依次為蘆薈大黃素>大黃素>青蒿素>小檗堿;采用CCK-8法,亦為蘆薈大黃素>大黃素>青蒿素>小檗堿;而數值大小略有不同。結果表明,2種方法測得的數據趨勢一致而數值有一定差別。結合2種方法評估中草藥單體對嗜熱四膜蟲的作用較好。

    2.3 中草藥單體對嗜熱四膜蟲酶活力的影響

    嗜熱四膜蟲經中草藥單體處理4 h后,SOD、CAT、MDA酶活力測定結果見圖3。結果表明,在1.25~50 mg·L-1的藥物濃度范圍內,隨著藥物濃度的增加,SOD活性先升高后降低;而CAT有升高趨勢,MDA有降低趨勢。表明該4種中草藥單體對此3種酶活力指標的影響具有一致性,而具體在某一濃度下對某種酶的活力影響有所不同。

    圖3 嗜熱四膜蟲Cu428.2在4種中草藥單體分別處理后超氧化物歧化酶、過氧化氫酶、丙二醛活力*. 與對照組差異顯著 (P<0.05);**. 與對照組差異極顯著 (P<0.01)。Figure 3 SOD, CAT and MDA activity of T. thermophila Cu428.2 after treatment of four kinds of Chinese herbal monomers*. The difference is significant with the control group (P<0.05); **. The difference is extraordinary significant with the control group (P<0.01).

    3 討論

    隨著水產養(yǎng)殖中大量化學藥物的使用,水體環(huán)境污染愈發(fā)嚴重,也增強了寄生蟲的抗藥性。開發(fā)綠色環(huán)保、無污染、無抗性的中草藥防治魚類養(yǎng)殖中的病害刻不容緩。中草藥單體成分明確、效應明顯,是今后中草藥應用的方向之一。青蒿素、大黃素、蘆薈大黃素和小檗堿均是中草藥單體物質,前人的研究顯示其有抗蟲效應,如青蒿素對瘧原蟲[20-21]、血吸蟲[21]和球蟲[21]有效,大黃素對瘧原蟲[22]、蘆薈大黃素對利什曼原蟲[23]和瘧原蟲[24]有效,小檗堿除對利什曼原蟲[25]有效外還對多種原蟲和蠕蟲有效[15]。本研究同時分析4種單體對嗜熱四膜蟲的效應,結果表明,青蒿素、蘆薈大黃素、小檗堿、大黃素等4種中草藥單體對嗜熱四膜蟲增殖的影響有劑量效應關系,在一定濃度下可致嗜熱四膜蟲凋亡,具有抑制生長的作用,與鉤吻堿(Koumine,斷腸草里提取的一種生物堿)[9]對嗜熱四膜蟲的效應有類似之處。有意思的是,青蒿素在低濃度時有促進生長的作用,可能在低濃度時其作為培養(yǎng)基營養(yǎng)成分起了主要作用,這與柴小翠等[26]報道的低濃度竹節(jié)參 (Panax japonicus) 能促進生長的分析相似。

    本研究主要采用Hoechst染色、細胞計數法和CCK-8法3種不同的方式進行實驗,以探究4種中草藥單體對嗜熱四膜蟲的抑制生長效應。Hoechst染料具特異性強、熒光性能強、實驗方式快捷的優(yōu)點,試劑穿過細胞膜與DNA相結合進行染色,當細胞發(fā)生凋亡時,染色質固縮,在熒光顯微鏡下觀察,凋亡細胞的細胞核呈濃染致密的顆粒狀熒光,或呈碎塊狀致密濃染,發(fā)出強烈藍色熒光,與背景形成鮮明對比。凋亡細胞與活細胞對比明顯,從而可以直觀地分析藥物在一定濃度范圍是否有凋亡作用。嗜熱四膜蟲的計數方法以往是固定后采用血細胞計數板,人為誤差較大且較煩瑣,本研究采用Countstar細胞計數儀,成像后采用電腦直觀計算細胞數量,可減少人為誤差,且快捷方便。CCK-8法是一種WST-8在電子耦合試劑存在的情況下,被線粒體內的脫氫酶還原生成高度水溶性的黃色甲瓚產物 (Formazan dye),生成的甲瓚物顏色深淺與活細胞數量成正比,因而可以采用酶標儀定量分析,是一種靈敏度較高、重復性好的細胞活性檢測方法,適合在分析藥物對細胞增殖影響、細胞活性檢測等實驗中應用[27]。CCK-8法步驟較為簡單,相對于細胞計數法更客觀、穩(wěn)定性更強,是一種較為理想的測試藥物對嗜熱四膜蟲影響的研究方法。本研究采用3種不同的實驗方法,對4種中草藥單體處理后嗜熱四膜蟲的影響進行評估,在Hoechst熒光染色形態(tài)觀察的基礎上進行細胞計數和CCK-8實驗,獲得中草藥單體的IC50數據,準確可行。本研究表明,在中草藥單體作用下,嗜熱四膜蟲隨著藥物濃度的變化,用細胞計數法和CCK-8實驗分別獲得的活細胞數和細胞活力呈現相同的趨勢;獲得的IC50具有一致性,但數據有所區(qū)別。筆者認為,CCK-8法更為客觀,必要時結合細胞計數法分析則更為可靠。

    為探究嗜熱四膜蟲凋亡的機理,本研究分析了中草藥單體對嗜熱四膜蟲氧化應激的影響。已有研究表明,這4種中草藥單體對動物抗氧化作用有顯著影響[28-31]。SOD、CAT和MDA是生物體和細胞內3種重要的氧化應激指標,其中SOD和CAT是生物體內極其重要的抗氧化酶,能清除超氧陰離子自由基 (),具有非常大的破壞作用,能夠引起細胞死亡和器官衰老,SOD被認為是防衛(wèi)傷害的第一步,它可以將轉化為毒性較低的H2O2[32];而CAT可進一步將H2O2轉化為H2O和O2,保護細胞免受損傷[33]。MDA是生物體或細胞內一種脂質氧化的產物,反映脂質氧化的水平[34]。本研究的4種中草藥單體對嗜熱四膜蟲SOD活性的影響,相較于對照組,基本為先升高后降低的趨勢,與潘厚軍等[7]報道的苯甲酸鈉、廖苑辰等[35]研究的氧化石墨烯對嗜熱四膜蟲SOD的影響均為低濃度促進、高濃度抑制的結果相似,具有劑量效應關系,原因亦為低濃度刺激了嗜熱四膜蟲致SOD活力增強,而高濃度使細胞產生毒害致自由基清除能力下降;本研究與在鉤吻堿[9]和百草枯[36]作用下嗜熱四膜蟲SOD活性均升高的結果有所差異,可能是因為嗜熱四膜蟲對不同藥物在不同濃度下的氧化應激適應性有所差異所致。本實驗中草藥作用后,CAT含量有升高趨勢,與有機紫外防曬劑[37]、抗菌劑三氯生[38]對嗜熱四膜蟲CAT的影響一致,而與抗菌劑三氯卡班[38]不同。單體作用于嗜熱四膜蟲后,嗜熱四膜蟲的MDA水平降低,其中蘆薈大黃素的效果尤為明顯,表明蘆薈大黃素能顯著降低嗜熱四膜蟲的脂質水平,這與張瑩瑩等[39]報道的蘆薈大黃素降低小鼠非酒精性脂肪肝模型的血清MDA水平結果一致。

    本研究表明,中草藥單體可引起纖毛類寄生蟲的替代模式生物——嗜熱四膜蟲凋亡,對嗜熱四膜蟲增殖和凋亡的影響具有劑量效應關系。為解決寄生蟲離體培養(yǎng)困難而致抗蟲中草藥篩選的瓶頸問題,本研究探討了體外應用嗜熱嗜熱四膜蟲的途徑。中草藥在魚類寄生蟲的防控實踐中是否有效,仍有待進行魚體臨床試驗。本研究結果為抗魚寄生蟲中草藥大通量篩選的體外技術提供了可能途徑。

    4 結論

    采用Hoechst 33258染色在熒光顯微鏡下觀察,濃度為20~200 mg·L-1的青蒿素、大黃素、蘆薈大黃素、小檗堿等4種中草藥單體可引起嗜熱四膜蟲凋亡;中草藥單體對嗜熱四膜蟲Cu428.2株的增殖具有抑制效應,采用CCK-8法與活細胞計數法測得的IC50較為一致;在單體濃度為1.25~50.0 mg·L-1,隨著藥物濃度的升高,CAT有升高趨勢,而MDA活性有降低趨勢,SOD先升高后降低。研究結果可為應用嗜熱四膜蟲篩選抗寄生蟲中草藥平臺技術的建立提供方法。

    猜你喜歡
    蘆薈青蒿素黃素
    我的植物朋友——蘆薈
    我愛蘆薈
    小讀者(2021年6期)2021-07-22 01:50:02
    穿越時光的黃素石樓
    海峽姐妹(2019年8期)2019-09-03 01:01:02
    感悟生命
    當藥黃素抗抑郁作用研究
    當藥黃素對H2O2誘導PC12細胞損傷的保護作用
    漆黃素固體分散體的制備
    中成藥(2017年12期)2018-01-19 02:06:32
    切莫盲信所謂的“青蒿素食品”
    華人時刊(2016年1期)2016-04-05 05:56:23
    一種新型的倍半萜內酯
    ——青蒿素
    一個青蒿素品牌的崛起
    中國品牌(2015年11期)2015-12-01 06:20:49
    性插视频无遮挡在线免费观看| 我要搜黄色片| 六月丁香七月| 免费黄网站久久成人精品| 国产又色又爽无遮挡免| 日韩人妻高清精品专区| 久久久久久国产a免费观看| 一本久久精品| 99热这里只有精品一区| 久久久久国产网址| 哪个播放器可以免费观看大片| 淫秽高清视频在线观看| 日韩 亚洲 欧美在线| 99热这里只有是精品50| 亚洲国产高清在线一区二区三| 热99在线观看视频| 国产亚洲一区二区精品| 日韩制服骚丝袜av| 99久久无色码亚洲精品果冻| 亚洲av电影不卡..在线观看| 国产毛片a区久久久久| 91午夜精品亚洲一区二区三区| 精品午夜福利在线看| 国产精品久久视频播放| 直男gayav资源| 久久久久久久久久成人| 男女啪啪激烈高潮av片| 在线免费观看不下载黄p国产| 国产精品蜜桃在线观看| 一个人看视频在线观看www免费| 国产精品国产三级专区第一集| 男女边吃奶边做爰视频| 1024手机看黄色片| 久久精品熟女亚洲av麻豆精品 | 一级av片app| 色尼玛亚洲综合影院| 欧美不卡视频在线免费观看| 在线观看一区二区三区| 69av精品久久久久久| 久热久热在线精品观看| 人妻制服诱惑在线中文字幕| 日产精品乱码卡一卡2卡三| 成人无遮挡网站| 亚洲人与动物交配视频| 久久这里有精品视频免费| 纵有疾风起免费观看全集完整版 | 久久久久久久久久黄片| 亚洲综合精品二区| av在线老鸭窝| 人妻夜夜爽99麻豆av| 97超视频在线观看视频| 午夜视频国产福利| av天堂中文字幕网| 欧美bdsm另类| 两个人视频免费观看高清| 免费看日本二区| 成人美女网站在线观看视频| 亚洲中文字幕一区二区三区有码在线看| 国产伦精品一区二区三区视频9| 精品免费久久久久久久清纯| 久热久热在线精品观看| 精品酒店卫生间| 少妇被粗大猛烈的视频| 嫩草影院新地址| 麻豆av噜噜一区二区三区| 久久久欧美国产精品| 欧美精品一区二区大全| 国产精品人妻久久久影院| 最近手机中文字幕大全| 国产日韩欧美在线精品| 麻豆久久精品国产亚洲av| 日韩欧美三级三区| 亚洲欧美清纯卡通| 狂野欧美激情性xxxx在线观看| av.在线天堂| 亚洲综合色惰| 午夜免费激情av| 午夜久久久久精精品| 三级经典国产精品| 婷婷六月久久综合丁香| av国产久精品久网站免费入址| 99热这里只有精品一区| 国产高清不卡午夜福利| 日韩制服骚丝袜av| 久久久精品大字幕| 美女脱内裤让男人舔精品视频| 九九久久精品国产亚洲av麻豆| 久久99热这里只频精品6学生 | 秋霞伦理黄片| 国产高清三级在线| 国产av一区在线观看免费| 一级爰片在线观看| 国产 一区 欧美 日韩| 国产精品人妻久久久久久| 国内精品一区二区在线观看| 精品国产露脸久久av麻豆 | 亚洲人成网站在线播| 中文字幕久久专区| 亚洲性久久影院| 国产精品1区2区在线观看.| 日韩人妻高清精品专区| 久久99热这里只有精品18| 天堂网av新在线| 身体一侧抽搐| 日本猛色少妇xxxxx猛交久久| 国产精品美女特级片免费视频播放器| 亚洲欧美成人精品一区二区| 97人妻精品一区二区三区麻豆| av视频在线观看入口| 亚洲国产精品久久男人天堂| 国产一级毛片七仙女欲春2| 99在线人妻在线中文字幕| 熟女人妻精品中文字幕| 高清视频免费观看一区二区 | 校园人妻丝袜中文字幕| 亚洲国产精品国产精品| 麻豆久久精品国产亚洲av| 97在线视频观看| 亚洲,欧美,日韩| 伦理电影大哥的女人| 99久久精品热视频| 亚洲欧美日韩高清专用| 国产亚洲精品av在线| 97人妻精品一区二区三区麻豆| 日日摸夜夜添夜夜爱| 久久久久久久国产电影| 亚洲电影在线观看av| 国产黄a三级三级三级人| 在线免费观看不下载黄p国产| 久久久久免费精品人妻一区二区| 中文天堂在线官网| 性插视频无遮挡在线免费观看| 91精品国产九色| 99久久九九国产精品国产免费| 搡女人真爽免费视频火全软件| 午夜老司机福利剧场| 夜夜爽夜夜爽视频| 国产亚洲5aaaaa淫片| 一夜夜www| 亚洲人成网站在线播| 亚洲国产高清在线一区二区三| 国产成人精品婷婷| 国产麻豆成人av免费视频| 中文字幕av在线有码专区| 免费看a级黄色片| 欧美zozozo另类| 亚洲国产精品国产精品| 两个人的视频大全免费| 亚洲欧美精品综合久久99| 久久久久久久久中文| 深夜a级毛片| 91精品伊人久久大香线蕉| 国产亚洲av片在线观看秒播厂 | 少妇高潮的动态图| 五月玫瑰六月丁香| 人妻系列 视频| 不卡视频在线观看欧美| 国产成人免费观看mmmm| 在线免费观看不下载黄p国产| 内射极品少妇av片p| 热99在线观看视频| 午夜爱爱视频在线播放| 色吧在线观看| 日韩亚洲欧美综合| 国产精品99久久久久久久久| 九九久久精品国产亚洲av麻豆| 国产精品熟女久久久久浪| 中文字幕av在线有码专区| 国产午夜精品久久久久久一区二区三区| 一夜夜www| 国产在视频线在精品| 国产伦理片在线播放av一区| 精品久久久久久电影网 | 2022亚洲国产成人精品| 视频中文字幕在线观看| av在线老鸭窝| 成人三级黄色视频| 99久久精品国产国产毛片| 亚洲人成网站在线观看播放| 国产一区二区在线观看日韩| 国产精品乱码一区二三区的特点| 亚洲精品亚洲一区二区| 91久久精品国产一区二区成人| 国产色爽女视频免费观看| 欧美又色又爽又黄视频| 午夜福利在线观看吧| 国产色婷婷99| 2021天堂中文幕一二区在线观| 亚洲国产精品成人综合色| 久久人妻av系列| 少妇高潮的动态图| 精品熟女少妇av免费看| 成年女人永久免费观看视频| 国产单亲对白刺激| 听说在线观看完整版免费高清| 狂野欧美白嫩少妇大欣赏| 成人高潮视频无遮挡免费网站| 日韩精品有码人妻一区| 久久精品夜色国产| 色网站视频免费| 长腿黑丝高跟| 成年av动漫网址| 国产免费一级a男人的天堂| 美女xxoo啪啪120秒动态图| 色尼玛亚洲综合影院| 日本免费一区二区三区高清不卡| 毛片一级片免费看久久久久| 国产午夜精品一二区理论片| 亚洲av成人精品一二三区| 精品久久久久久久末码| 国产精品人妻久久久久久| 国产亚洲5aaaaa淫片| 中文精品一卡2卡3卡4更新| 亚洲国产精品sss在线观看| 少妇的逼好多水| 最后的刺客免费高清国语| 最近2019中文字幕mv第一页| 国产欧美另类精品又又久久亚洲欧美| 亚洲欧美日韩卡通动漫| 日本黄色片子视频| 成人欧美大片| 精品一区二区三区人妻视频| 亚洲av.av天堂| 日本免费a在线| 人妻系列 视频| 成人午夜精彩视频在线观看| 永久网站在线| 中国国产av一级| 国产 一区精品| 九九热线精品视视频播放| 午夜老司机福利剧场| 一卡2卡三卡四卡精品乱码亚洲| 国产伦在线观看视频一区| 日产精品乱码卡一卡2卡三| 男女国产视频网站| 国产精品熟女久久久久浪| 国产av一区在线观看免费| 久久久久免费精品人妻一区二区| 亚洲激情五月婷婷啪啪| 国产高清视频在线观看网站| 久久久久九九精品影院| 亚洲国产精品久久男人天堂| 久久久久免费精品人妻一区二区| 日韩国内少妇激情av| 亚洲av中文av极速乱| 亚洲一级一片aⅴ在线观看| 国产高清视频在线观看网站| 97热精品久久久久久| 久久久色成人| 国产视频内射| 麻豆一二三区av精品| 国产亚洲最大av| 免费在线观看成人毛片| 国内精品美女久久久久久| 免费大片18禁| 乱码一卡2卡4卡精品| 2021天堂中文幕一二区在线观| 男人的好看免费观看在线视频| 18+在线观看网站| 婷婷六月久久综合丁香| 国产精品一二三区在线看| 老司机影院毛片| 综合色av麻豆| 男女那种视频在线观看| 欧美日韩在线观看h| 在现免费观看毛片| 国产白丝娇喘喷水9色精品| 亚洲内射少妇av| 一卡2卡三卡四卡精品乱码亚洲| 日韩人妻高清精品专区| 久久久久久久久久成人| av国产免费在线观看| 国内精品宾馆在线| 少妇熟女aⅴ在线视频| 国产爱豆传媒在线观看| 精品久久国产蜜桃| 国产av一区在线观看免费| 免费看a级黄色片| 插阴视频在线观看视频| 国产毛片a区久久久久| 久久99热6这里只有精品| 一个人看的www免费观看视频| 狂野欧美激情性xxxx在线观看| 亚洲天堂国产精品一区在线| 久久精品国产自在天天线| 99在线视频只有这里精品首页| 一个人看视频在线观看www免费| 国产伦精品一区二区三区视频9| 秋霞在线观看毛片| 91久久精品电影网| 国产在视频线精品| 久久鲁丝午夜福利片| av又黄又爽大尺度在线免费看 | 国产成人a区在线观看| 日本五十路高清| 最后的刺客免费高清国语| 一个人看视频在线观看www免费| 亚洲自偷自拍三级| 天天一区二区日本电影三级| 国产成年人精品一区二区| 女的被弄到高潮叫床怎么办| 亚洲激情五月婷婷啪啪| 2021少妇久久久久久久久久久| 少妇熟女aⅴ在线视频| 国产亚洲5aaaaa淫片| 免费观看性生交大片5| 好男人在线观看高清免费视频| 黄色欧美视频在线观看| 嘟嘟电影网在线观看| 国产亚洲av嫩草精品影院| 亚洲真实伦在线观看| 成人特级av手机在线观看| 韩国av在线不卡| 在线播放无遮挡| 欧美又色又爽又黄视频| 舔av片在线| 国产真实乱freesex| 青春草视频在线免费观看| 久久久亚洲精品成人影院| 亚洲av成人av| 亚洲欧美精品综合久久99| 日韩一本色道免费dvd| 搡老妇女老女人老熟妇| 一级爰片在线观看| 99热网站在线观看| 午夜福利成人在线免费观看| 亚洲av熟女| 夜夜爽夜夜爽视频| 国产精品人妻久久久影院| 99热这里只有精品一区| 国产av在哪里看| 能在线免费观看的黄片| 日韩av不卡免费在线播放| 亚洲综合精品二区| 人人妻人人澡人人爽人人夜夜 | 亚洲av电影在线观看一区二区三区 | 卡戴珊不雅视频在线播放| 亚州av有码| 男人和女人高潮做爰伦理| 亚洲三级黄色毛片| 日韩一本色道免费dvd| 日本免费a在线| 欧美成人午夜免费资源| 成年女人看的毛片在线观看| 国产一区二区亚洲精品在线观看| 久久久国产成人精品二区| 成人高潮视频无遮挡免费网站| 亚洲欧美成人综合另类久久久 | 亚洲欧美一区二区三区国产| 国产精品久久电影中文字幕| 国产老妇女一区| 七月丁香在线播放| 精品欧美国产一区二区三| 亚洲性久久影院| 又粗又硬又长又爽又黄的视频| 天堂影院成人在线观看| 亚洲成人精品中文字幕电影| 男人狂女人下面高潮的视频| 亚洲成人精品中文字幕电影| h日本视频在线播放| 欧美性猛交黑人性爽| 久久精品熟女亚洲av麻豆精品 | 亚洲美女视频黄频| 色综合亚洲欧美另类图片| 国产乱来视频区| 国产高潮美女av| 性色avwww在线观看| 日韩国内少妇激情av| 九色成人免费人妻av| 老女人水多毛片| 午夜a级毛片| 嘟嘟电影网在线观看| 亚洲av成人精品一二三区| 国产成年人精品一区二区| 国产久久久一区二区三区| 国产精品国产三级专区第一集| 国产麻豆成人av免费视频| 国产免费一级a男人的天堂| 性色avwww在线观看| 白带黄色成豆腐渣| 丝袜美腿在线中文| 国产精品国产高清国产av| 国产黄色小视频在线观看| 日韩欧美在线乱码| 黑人高潮一二区| 天堂影院成人在线观看| 99在线视频只有这里精品首页| 麻豆久久精品国产亚洲av| 在现免费观看毛片| 边亲边吃奶的免费视频| 99久国产av精品国产电影| 美女脱内裤让男人舔精品视频| 亚洲精品影视一区二区三区av| 少妇熟女aⅴ在线视频| 亚洲av一区综合| 日日摸夜夜添夜夜添av毛片| 偷拍熟女少妇极品色| 中国美白少妇内射xxxbb| 淫秽高清视频在线观看| 天堂av国产一区二区熟女人妻| 国产av不卡久久| 国产精品麻豆人妻色哟哟久久 | 久久午夜福利片| h日本视频在线播放| 丝袜美腿在线中文| 国产亚洲精品av在线| 中文欧美无线码| 99热这里只有是精品在线观看| 久久久午夜欧美精品| 啦啦啦啦在线视频资源| 精品人妻视频免费看| 久久精品国产99精品国产亚洲性色| 日韩欧美精品v在线| 建设人人有责人人尽责人人享有的 | 国产午夜精品久久久久久一区二区三区| 国产探花极品一区二区| 少妇猛男粗大的猛烈进出视频 | 亚洲成av人片在线播放无| 国国产精品蜜臀av免费| 秋霞伦理黄片| 久久久久久久久大av| 欧美丝袜亚洲另类| 国产亚洲5aaaaa淫片| 亚洲精品国产av成人精品| 日日摸夜夜添夜夜添av毛片| 美女xxoo啪啪120秒动态图| 特级一级黄色大片| 女人十人毛片免费观看3o分钟| 网址你懂的国产日韩在线| 一二三四中文在线观看免费高清| 久久久久久久久久久免费av| 亚洲国产最新在线播放| 欧美日韩一区二区视频在线观看视频在线 | 国产不卡一卡二| 久久草成人影院| 97人妻精品一区二区三区麻豆| 久久精品国产99精品国产亚洲性色| 国产真实伦视频高清在线观看| 成人二区视频| 欧美日韩精品成人综合77777| 亚洲国产成人一精品久久久| 国产伦精品一区二区三区视频9| 欧美成人午夜免费资源| 成年女人看的毛片在线观看| videossex国产| 最近中文字幕2019免费版| 能在线免费看毛片的网站| 美女脱内裤让男人舔精品视频| 亚洲最大成人手机在线| 日本免费一区二区三区高清不卡| 国产美女午夜福利| 国产三级在线视频| 老司机福利观看| 国产不卡一卡二| 久久精品国产亚洲av天美| 亚洲综合色惰| 九九在线视频观看精品| 精品欧美国产一区二区三| 国产乱人视频| 国产精品蜜桃在线观看| 草草在线视频免费看| 国产在视频线在精品| 长腿黑丝高跟| 日日摸夜夜添夜夜添av毛片| 亚洲五月天丁香| av天堂中文字幕网| 久久6这里有精品| 欧美日本视频| 国产伦精品一区二区三区视频9| 国产成人免费观看mmmm| 国产精品福利在线免费观看| 亚洲图色成人| 哪个播放器可以免费观看大片| 国产淫片久久久久久久久| 波野结衣二区三区在线| 乱人视频在线观看| 精品人妻一区二区三区麻豆| 深夜a级毛片| 国产中年淑女户外野战色| 国产免费福利视频在线观看| 我要搜黄色片| 可以在线观看毛片的网站| www日本黄色视频网| 春色校园在线视频观看| 老司机影院毛片| 日日摸夜夜添夜夜爱| 麻豆成人av视频| 色综合站精品国产| 国产又黄又爽又无遮挡在线| 成人三级黄色视频| 亚洲欧美清纯卡通| 韩国高清视频一区二区三区| 99视频精品全部免费 在线| 中国国产av一级| 中国美白少妇内射xxxbb| 午夜亚洲福利在线播放| 国产精品99久久久久久久久| 国产一区二区在线av高清观看| 亚洲av中文字字幕乱码综合| 高清av免费在线| 亚洲在线自拍视频| or卡值多少钱| 少妇的逼水好多| 欧美性猛交黑人性爽| 国产精品人妻久久久久久| 蜜桃亚洲精品一区二区三区| 只有这里有精品99| 国产精品蜜桃在线观看| 日日撸夜夜添| 国产成人精品一,二区| av又黄又爽大尺度在线免费看 | 欧美日本视频| 校园人妻丝袜中文字幕| 亚洲欧美日韩东京热| or卡值多少钱| 亚洲性久久影院| 欧美又色又爽又黄视频| 国产高清有码在线观看视频| 简卡轻食公司| 亚洲av中文av极速乱| 午夜免费激情av| .国产精品久久| 免费观看人在逋| 久久久久久久久中文| 舔av片在线| 亚洲最大成人中文| 两个人视频免费观看高清| 国产老妇女一区| 午夜老司机福利剧场| 1000部很黄的大片| 麻豆精品久久久久久蜜桃| 国产精品福利在线免费观看| 亚洲欧美精品综合久久99| 亚洲精品日韩av片在线观看| 国产精品永久免费网站| 日韩三级伦理在线观看| 99热精品在线国产| 亚洲精品乱久久久久久| 黄色欧美视频在线观看| 乱人视频在线观看| 白带黄色成豆腐渣| 午夜免费激情av| 精品熟女少妇av免费看| 狂野欧美白嫩少妇大欣赏| 亚洲精品乱码久久久久久按摩| 狂野欧美白嫩少妇大欣赏| 欧美日韩在线观看h| 极品教师在线视频| 深夜a级毛片| 国产av一区在线观看免费| 有码 亚洲区| 一个人看的www免费观看视频| 久99久视频精品免费| 亚洲精品久久久久久婷婷小说 | 在线观看美女被高潮喷水网站| av卡一久久| 国产亚洲精品av在线| 国产成人福利小说| 成人美女网站在线观看视频| 国产一区二区三区av在线| 欧美丝袜亚洲另类| 久久99蜜桃精品久久| 久久精品夜色国产| 波多野结衣高清无吗| 欧美色视频一区免费| 国产成人精品久久久久久| 18禁裸乳无遮挡免费网站照片| 欧美+日韩+精品| 青春草亚洲视频在线观看| 欧美日韩国产亚洲二区| 日韩强制内射视频| 91精品一卡2卡3卡4卡| 国产成人精品婷婷| 一卡2卡三卡四卡精品乱码亚洲| 少妇人妻一区二区三区视频| 午夜激情福利司机影院| 亚洲中文字幕一区二区三区有码在线看| 六月丁香七月| 免费看光身美女| 九色成人免费人妻av| 亚洲人成网站在线观看播放| or卡值多少钱| 国产精品.久久久| 国产真实乱freesex| 日韩欧美精品v在线| 一级av片app| 日韩三级伦理在线观看| 精品久久久噜噜| 一级二级三级毛片免费看| 一个人看的www免费观看视频| 亚洲最大成人手机在线| 国产爱豆传媒在线观看| 麻豆乱淫一区二区| 亚洲欧美日韩无卡精品| 高清毛片免费看| 一本—道久久a久久精品蜜桃钙片 精品乱码久久久久久99久播 | 天天一区二区日本电影三级| 精品久久久久久久末码| 久久久久久九九精品二区国产| 又爽又黄无遮挡网站| www日本黄色视频网| 老女人水多毛片| 变态另类丝袜制服| 日韩成人伦理影院| 毛片一级片免费看久久久久| 欧美精品一区二区大全| 免费看日本二区| 三级毛片av免费| 亚洲电影在线观看av| 桃色一区二区三区在线观看| 男女下面进入的视频免费午夜| 午夜精品一区二区三区免费看| 乱人视频在线观看| 人妻制服诱惑在线中文字幕| 亚洲av免费高清在线观看|