成家飛,徐 藝,顧培青,朱 磊,曹婷婷,張 露,李 萍,孫 心,馮 皖,沈 洪
(南京中醫(yī)藥大學(xué)附屬醫(yī)院,江蘇 南京 210000)
腸纖維化是炎癥性腸病的嚴(yán)重并發(fā)癥之一,超過40%的克羅恩病患者和約5%的潰瘍性結(jié)腸炎患者會發(fā)生腸纖維化[1]。目前,相對于炎癥性腸病腸道炎癥方面研究的突飛猛進(jìn),抗炎治療取得的長足進(jìn)步,抗腸纖維化治療進(jìn)展緩慢。中醫(yī)認(rèn)為炎癥性腸病多因濕熱之邪壅滯腸道,與氣血相搏結(jié),腸絡(luò)受損,氣凝血滯,血瘀阻絡(luò),發(fā)為腹瀉、腹痛,甚至腸瘺,其病機(jī)關(guān)鍵是濕熱瘀阻。從病情發(fā)展看,多經(jīng)歷“由實而虛”“由氣入血及絡(luò)”的動態(tài)變化。炎癥性腸病腸纖維化的基本病理改變是細(xì)胞外基質(zhì)(ECM)尤其是膠原的過度沉積,與絡(luò)病學(xué)說中濕熱阻絡(luò)類似,故可將其歸屬中醫(yī)“絡(luò)病”范疇。中醫(yī)藥已成為治療炎癥性腸病的重要方法之一,對防治炎癥性腸病腸纖維化有獨特的優(yōu)勢,但其作用靶點尚不十分清楚。過氧化物酶體增殖物激活受體(PPARs)系配體激活的核轉(zhuǎn)錄因子超家族的一員,在脂類代謝、免疫調(diào)節(jié)及炎癥反應(yīng)等過程中起著十分重要的作用[2]。PPAR-γ是PPARs亞型之一,在許多器官中具有抗炎和抗纖維化作用[3-4],但是其在腸纖維化中的確切作用尚不清楚,在腸纖維化進(jìn)程中的動態(tài)變化亦沒有報道。故本研究采用三硝基苯磺酸(TNBS)建立小鼠腸纖維化模型,觀察PPAR-γ在腸纖維化過程中的動態(tài)變化,并分析其與膠原表達(dá)的相關(guān)性,為闡明PPAR-γ在腸纖維化中的作用以及中醫(yī)藥干預(yù)炎癥性腸病腸纖維化的靶點提供一些實驗依據(jù)。
1.1實驗動物 雄性BALB/c小鼠90只,SPF級,體重20~24 g,動物合格證編號:SCXK(滬)2017-0005。飼養(yǎng)環(huán)境:溫度20~26 ℃,相對濕度為40%~70%。
1.2試劑 5%TNBS(Sigma公司),HE染液套裝(Servicebio公司),Masson染液套裝(Servicebio公司),Ⅰ型膠原α2(COL1A2)抗體(Abcam公司),PPAR-γ抗體(正能生物公司),RNA引物(上海擎熙生物科技有限公司)。
1.3儀器與設(shè)備 熒光定量PCR儀(ABI,7300),正置熒光顯微鏡(OLYMPUS,BX51),電泳儀(Bio-rad, Basic), 全自動化學(xué)發(fā)光圖像分析系統(tǒng)(天能,Tanon-4600SF),臺式高速冷凍型微量離心機(jī)(DragonLab,D3024R),超微量分光光度計(Thermo,NanoDrop2000)。
1.4實驗方法 將90只BALB/c小鼠隨機(jī)分為對照組和造模1周組、造模2周組、造模3周組、造模4周組、造模5周組、造模6周組、造模7周組、造模8周組,每組10只。造模各組小鼠參考Lawrance等[5]的研究進(jìn)行造模:禁食,異氟烷麻醉,從肛門插入醫(yī)用聚乙烯管至距肛緣3 cm,每周1次灌入不同劑量的TNBS乙醇溶液(第1周和第2周均為0.5 mg,第3周和第4周均為0.75 mg,第5周和第6周均為1.0 mg),保持肛門高位3 min,保證TNBS乙醇溶液不會立刻從肛門流出。對照組小鼠給予等體積的0.9%氯化鈉溶液灌腸,其余過程均相同。
1.5檢測指標(biāo)及方法
1.5.1結(jié)腸長度及重量 對照組于灌腸8周、造模各組于造模相應(yīng)時間點,采用10%水合氯醛腹腔注射麻醉小鼠后處死,取肛門至回盲的腸段,測量長度并稱重。
1.5.2結(jié)腸組織學(xué)形態(tài) 取各組小鼠結(jié)腸病變明顯處腸管,4%多聚甲醛固定,常規(guī)石蠟包埋,用于HE染色、Masson染色,電子顯微鏡下觀察結(jié)腸組織學(xué)形態(tài)。
1.5.3總膠原含量 采用化學(xué)比色法檢測:取液氮冷凍的結(jié)腸組織約30 mg,加入300 μL的胃蛋白酶冰醋酸溶液,4 ℃孵育過夜;3 000×g離心10 min后取上清液100 μL;加入1 mL Sircol染料,獲得膠原-染料復(fù)合物;13 000×g離心10 min;加入750 μL洗滌液;13 000×g離心10 min;加入染料釋放劑,將復(fù)合物中的染料釋放出來;取200 μL樣品,用分光光度計測定在556 nm處的吸光度。。
1.5.4結(jié)腸組織中PPAR-γ、COL1A2蛋白表達(dá)檢測 采用Western blot法檢測:取適量結(jié)腸組織,提取蛋白并定量,蛋白上樣15 μg/孔;5% SDS-PAGE電泳分離,電泳條件為80 V 20 min,120 V跑至膠底附近;300 mA轉(zhuǎn)膜60 min,將蛋白轉(zhuǎn)印至PVDF膜;5%BSA封閉2 h,TBST洗3次,每次10 min;孵育一抗(抗體濃度1∶1 000),4 ℃過夜;回收一抗,TBST洗3次,每次10 min;孵育HRP結(jié)合二抗(抗體濃度1∶2 000),室溫1 h;回收二抗,TBST洗3次,每次10 min;ECL試劑盒顯色,成像系統(tǒng)下成像,Image J軟件分析灰度值。
1.5.5結(jié)腸組織中PPAR-γ和COL1A2 mRNA表達(dá)檢測 采用RT-PCR法檢測:取適量結(jié)腸組織,提取總RNA,參照反轉(zhuǎn)錄試劑盒說明書反轉(zhuǎn)錄為cDNA,以甘油酸-3-磷酸脫氫酶(GAPDH)為內(nèi)參照,進(jìn)行PCR擴(kuò)增,引物序列:內(nèi)參GAPDH上游為5’-GGTGTGAACCACGAGAAATATGAC-3’,下游為5’-TCATGAGCCCTTCCACAATG-3’;PPAR-γ上游為5’-GGAAGACCACTCGCATTCCTT-3’,下游為5’-GTAATCAGCAACCATTGGGTCA-3’;COL1A2上游為5’-GGTGAGCCTGGTCAAACGG-3’,下游為5’-ACTGTGTCCTTTCACGCCTTT-3’。結(jié)果分析采用ΔΔCT法,ΔCt=Ct目的基因-Ct內(nèi)參,ΔΔCt=ΔCt處理組-ΔCt對照組,相對定量法(RQ)處理組=2-ΔΔCt,其中對照組RQ值設(shè)為1。以GAPDH為內(nèi)參,依據(jù)2-ΔΔCt法計算各mRNA的相對表達(dá)量。
2.1各組小鼠結(jié)腸長度、結(jié)腸重量比較 與對照組比較,造模6周組、造模7周組、造模8周組小鼠的結(jié)腸長度均明顯縮短(P均<0.05),造模7周組、造模8周組小鼠的結(jié)腸重量均明顯增加(P均<0.05)。見表1。
表1 對照組和腸纖維化造模各組小鼠結(jié)腸長度及結(jié)腸重量比較
2.2各組小鼠結(jié)腸組織病理學(xué)表現(xiàn) HE染色和Masson染色發(fā)現(xiàn),造模5周組、造模6周組、造模7周組、造模8周組小鼠腸壁可見明顯的炎癥細(xì)胞浸潤、腺體破壞、腺管扭曲、杯狀細(xì)胞減少及膠原纖維增生。見圖1及圖2。
圖1 對照組和腸纖維化造模各組小鼠結(jié)腸組織HE染色表現(xiàn)(×50)
圖2 對照組和腸纖維化造模各組小鼠結(jié)腸組織Masson染色表現(xiàn)(×50)
2.3各組小鼠結(jié)腸組織中總膠原含量比較 對照組小鼠結(jié)腸組織中總膠原含量為(6.82±0.35)μg/mg,造模1周組、造模2周組、造模3周組、造模4周組、造模5周組、造模6周組、造模7周組、造模8周組分別為(6.92±0.29)μg/mg、(6.95±0.27)μg/mg、(7.13±0.37)μg/mg、(7.52±0.42)μg/mg、(8.30±0.26)μg/mg、(9.31±0.38)μg/mg、(9.88±0.59)μg/mg、(10.47±0.50)μg/mg,造模5周組、造模6周組、造模7周組、造模8周組均明顯高于對照組(P均<0.05)。
2.4各組小鼠結(jié)腸組織中PPAR-γ和COL1A2蛋白表達(dá)情況 造模各組小鼠結(jié)腸組織中PPAR-γ蛋白表達(dá)量均明顯低于對照組(P均<0.05),COL1A2蛋白表達(dá)量均明顯高于對照組(P均<0.05),且分別呈遞減和遞增趨勢。見圖3。
圖3 對照組和腸纖維化造模各組小鼠結(jié)腸組織中PPAR-γ和COL1A2蛋白表達(dá)情況
2.5各組小鼠結(jié)腸組織中PPAR-γ和COL1A2 mRNA表達(dá)情況 造模1周組和造模2周組小鼠結(jié)腸組織中PPAR-γ和COL1A2 mRNA表達(dá)量與對照組比較差異均無統(tǒng)計學(xué)意義(P均>0.05);其余造模各組PPAR-γ mRNA表達(dá)量均明顯低于對照組(P均<0.05),COL1A2 mRNA表達(dá)量均明顯高于對照組(P均<0.05),且分別呈遞減和遞增趨勢。見圖4。
圖4 對照組和腸纖維化造模各組小鼠結(jié)腸組織中PPAR-γ和COL1A2 mRNA表達(dá)情況
2.6結(jié)腸組織中PPAR-γ和COL1A2表達(dá)的相關(guān)性 造模后小鼠結(jié)腸組織中PPAR-γ和COL1A2蛋白及mRNA的表達(dá)均呈負(fù)相關(guān)(r=-0.949,P<0.05;r=-0.870,P<0.05)。見圖5及圖6。
圖5 腸纖維化造模各組小鼠結(jié)腸組織中PPAR-γ和COL1A2蛋白表達(dá)的相關(guān)性
圖6 腸纖維化造模各組小鼠結(jié)腸組織中PPAR-γ和COL1A2 mRNA表達(dá)的相關(guān)性
炎癥性腸病包括潰瘍性結(jié)腸炎和克羅恩病,我國炎癥性腸病的發(fā)病率近年來呈明顯上升趨勢[6]??肆_恩病的纖維化累及腸壁全層,統(tǒng)計發(fā)現(xiàn)約75%的克羅恩病患者在病程中至少接受一次手術(shù),近半數(shù)是因為腸纖維化導(dǎo)致的腸狹窄和腸梗阻[7-8]。與克羅恩病相比,潰瘍性結(jié)腸炎的纖維化常局限于黏膜及黏膜下層,雖一般不引起腸道狹窄,但會引起結(jié)腸短縮、腸壁僵硬。炎癥性腸病腸纖維化的發(fā)生機(jī)制尚未完全闡明,對纖維性狹窄主要依賴內(nèi)鏡和手術(shù)治療[9],缺乏有效的、耐受性好的抗纖維化藥物,故明確腸纖維化的機(jī)制、尋找有效的治療靶點是目前研究的重點。
動物模型對于研究炎癥性腸病腸纖維化十分重要。本實驗采用TNBS小鼠模型,該模型操作簡單,經(jīng)濟(jì)實用,重復(fù)性好,病變持續(xù)時間長,體現(xiàn)疾病急性向慢性轉(zhuǎn)化的過程,是一種經(jīng)典的動物模型[10]。TNBS的劑量、給藥頻次、給藥方式及給藥時間參考Lawrance等[5]的研究,該方法自2003年問世以來,已被多位學(xué)者用于研究腸纖維化的發(fā)病機(jī)制或各種藥物對腸纖維化的療效[11-12]。本實驗結(jié)果顯示,從造模5周組開始,小鼠腸壁可見膠原纖維增生,結(jié)腸組織中總膠原含量增高;從造模6周組開始,小鼠的結(jié)腸長度明顯縮短;造模7周組、造模8周組小鼠的結(jié)腸重量明顯增加。這與既往相關(guān)研究結(jié)果一致。
PPARs是一種新型的核激素受體超家族,是調(diào)控眾多基因表達(dá)所必需的核受體。PPARs包括3種亞型:PPAR-α、PPAR-γ和PPAR-β/δ,它們具有不同的組織分布和功能。其中PPAR-γ是研究最廣泛的亞型,其廣泛分布于包括腸道在內(nèi)的多個組織器官,參與調(diào)控脂質(zhì)代謝、炎癥反應(yīng)、細(xì)胞增殖和纖維化[13]。PPAR-γ的過表達(dá)可防止組織纖維化,而PPAR-γ的缺失則會增加纖維化[14]。多個實驗發(fā)現(xiàn)PPAR-γ激動劑可減輕心、肝、腎等器官的纖維化,PPAR-γ拮抗劑則能抵抗這種抗纖維化作用[15-17]。針對腸道,PPAR-γ激動劑亦表現(xiàn)出抗纖維化效應(yīng)[18-19]。本課題組既往研究發(fā)現(xiàn),TNBS單次灌腸造模3d后,大鼠結(jié)腸組織中PPAR-γ的表達(dá)受抑制,14d時其表達(dá)逐漸恢復(fù)[20]。Yang等[21]和Fu等[22]的研究也發(fā)現(xiàn)TNBS造模3d后PPAR-γ表達(dá)下調(diào)。本研究采用TNBS多次灌腸建立小鼠腸纖維化模型,結(jié)果發(fā)現(xiàn)隨造模時間延長,結(jié)腸組織中PPAR-γ表達(dá)逐漸減少,與既往研究結(jié)果不一致的可能原因是TNBS給藥的次數(shù)和觀察的時間點不一樣,既往的研究多觀察PPAR-γ在急性炎癥期的表達(dá)情況,而非在慢性纖維化進(jìn)程中的動態(tài)表達(dá)情況。
腸纖維化主要表現(xiàn)為腸道ECM的過度沉積,膠原是ECM的主要成分,它有多個亞型,Ⅰ型膠原是最主要的亞型。本實驗結(jié)果發(fā)現(xiàn),隨造模時間延長,結(jié)腸組織中COL1A2表達(dá)逐漸增加,相關(guān)性分析顯示PPAR-γ和COL1A2的表達(dá)呈負(fù)相關(guān),提示PPAR-γ可能通過影響膠原的表達(dá)而參與腸纖維化進(jìn)程。
綜上所述,TNBS灌腸誘導(dǎo)小鼠纖維化模型中,造模5周后出現(xiàn)明顯病變,結(jié)腸組織中總膠原含量增加,PPAR-γ隨造模時間延長而表達(dá)逐漸受抑制,且PPAR-γ與COL1A2的表達(dá)呈負(fù)相關(guān),PPAR-γ在腸纖維化進(jìn)程中可能起重要作用。
利益沖突:所有作者均聲明不存在利益沖突。
現(xiàn)代中西醫(yī)結(jié)合雜志2021年34期