14株乳酸菌產(chǎn)酸抗鹽特性研究

羅麗蓉 李宏洋 李升

摘 要：乳酸菌特別是乳桿菌是泡椒發(fā)酵過程中的風(fēng)味微生物。為探究乳酸菌的產(chǎn)酸特性，研究選取從發(fā)酵辣椒產(chǎn)品中分離篩選的14株乳酸菌作為試驗(yàn)材料。通過測OD值、pH、消耗堿的量、活菌數(shù)，對(duì)14株乳酸菌的生長繁殖、產(chǎn)酸強(qiáng)弱、總酸度、抗鹽性進(jìn)行分析比較。結(jié)果表明，編號(hào)為5-1（Lactobacillus plantarum）和29-1（Lactobacillus alimentarius） 的2株菌生長性能好、產(chǎn)酸能力強(qiáng)且適合低鹽環(huán)境生長，因此可作為純種強(qiáng)化低鹽發(fā)酵泡椒的優(yōu)良菌種。

關(guān)鍵詞：乳酸菌;生長性能;pH;產(chǎn)酸特性;抗鹽性

中圖分類號(hào)：TS201.3

文獻(xiàn)標(biāo)識(shí)碼：A

文章編號(hào)：1008-0457（2021）06-0076-05

國際DOI編碼：10.15958/j.cnki.sdnyswxb.2021.06.011

Abstract：Lactic acid bacteria，especially Lactobacillus，are the flavor microorganism in the fermentation process of pickled pepper.In order to explore the acid-producing properties of lactic acid bacteria，14 strains of lactic acid bacteria isolated and screened from fermented pepper were selected as experimental materials.The growth and reproduction，acid production strength，total acidity and salt resistance of 14 strains of lactic acid bacteria were analyzed and comparedby measuring the OD value，pH，consumption of the alkali and viable count.The results showed that the strains numbered 5-1（Lactobacillus plantarum） and 29-1（Lactobacillus alimentarius） had good growth performance，strong acid production capacity，and were suitable for low salt environment，so they could be used as excellent strains of pure strain to enhance low salt fermentation of pickled pepper.

Keywords：lactic acid bacteria;growth characteristic;pH;acid production;salt resistance

乳酸菌（Lactic acid bacteria，LAB）是一類細(xì)菌的總稱，這類細(xì)菌都能夠發(fā)酵糖類[1]產(chǎn)生乳酸（主要產(chǎn)物），其共同特征是過氧化氫酶陰性、革蘭氏染色陽性[2]。乳酸菌可分為乳桿菌屬、鏈球菌屬、雙歧桿菌屬和片球菌屬等[3]，其中乳桿菌屬和雙歧桿菌屬與人類身體健康有密切聯(lián)系[4-5]。

乳酸菌能促進(jìn)動(dòng)物生長[6]，調(diào)節(jié)胃腸道菌群，維持微生態(tài)平衡[7]，從而改善腸道功能[8]，提高食物消化率[9]和生物效價(jià)，防止便秘[10]，降低血清膽固醇和血脂[11]，預(yù)防心臟病，控制內(nèi)毒素，抑制腸道內(nèi)腐敗微生物的生長[12]，促進(jìn)乳糖消化，調(diào)節(jié)機(jī)體免疫力，延緩機(jī)體衰老和抗腫瘤等作用[13]。

乳酸菌是酸奶、泡菜、酸菜、乳制品的主要發(fā)酵劑。如今，乳酸菌發(fā)酵食品被人們廣泛食用，人們對(duì)其健康也越來越關(guān)注。乳酸菌發(fā)酵食品的生產(chǎn)應(yīng)引起廣泛的重視，同時(shí)乳酸菌的發(fā)展對(duì)發(fā)酵食品專業(yè)化和安全化有積極的推動(dòng)作用[14]，對(duì)豐富和挖掘傳統(tǒng)菌劑具有重要的現(xiàn)實(shí)意義。因此篩選對(duì)微生物發(fā)酵有益的菌種已經(jīng)成為當(dāng)前研究發(fā)展的熱門趨勢。

1 材料與方法

1.1 試驗(yàn)材料

1.1.1 菌株

待測14株乳酸菌為實(shí)驗(yàn)室保藏菌種，有植物乳桿菌（Lactobacillus plantarum）、食品乳桿菌（Lactobacillus alimentarius）、戊糖乳桿菌（Lactobacillus pentosus）、希氏乳桿菌（Lactobacillus higardii）、納木雷氏乳桿菌（Lactobacillus namurensis）、副干酪乳桿菌（Lactobacillus paracasei）、哈爾濱乳桿菌（Lactobacillus harbinensis），編號(hào)為5-1（Lactobacillus plantarum）、16-1（Lactobacillus plantarum）、10-1（Lactobacillus alimentarius）、19-2（Lactobacillus alimentarius）、25-1（Lactobacillus alimentarius）、28-1（Lactobacillus alimentarius）、29-1（Lactobacillus alimentarius）、16-4（Lactobacillus pentosus）、19-1（Lactobacillus pentosus）、21-3（Lactobacillus pentosus）、5-4（Lactobacillus higardii）、9-1（Lactobacillus namurensis）、9-3（Lactobacillus paracasei）、21-4（Lactobacillus harbinensis）。

1.1.2 培養(yǎng)基

MRS培養(yǎng)基：蛋白胨10 g，牛肉膏10 g，酵母膏5 g，葡萄糖20 g，乙酸鈉5 g，檸檬酸氫二氨2 g，吐溫80 mL，磷酸氫二鉀2 g，硫酸錳0.25 g，硫酸鎂0.58 g，瓊脂18 g，蒸餾水1000 mL，pH（6.2～6.6），121 ℃滅菌20 min。

1.1.3 儀器與試劑

儀器：PHS-3C酸度計(jì)、高壓蒸汽滅菌鍋、振蕩培養(yǎng)箱、超凈工作臺(tái)、分光光度計(jì)、堿式滴定管、4 ℃冰箱。

試劑：酚酞、0.1 mol/L的鹽酸、pH=4.0的緩沖液。

1.2 試驗(yàn)方法

OD值測定方法：取已滅菌的MRS液體培養(yǎng)基3 mL作為空白對(duì)照，將已活化的14株菌液將其OD值稀釋至0.03左右，然后按3%的接種量，往80 mLMRS液體培養(yǎng)基中接入待測菌株，37 ℃振蕩培養(yǎng)。用分光光度計(jì)每2 h測定菌懸液在波長680 nm處的OD值。

pH值測定方法：用 PHS-3C精密酸度計(jì)，每2 h測各菌液的pH值。

酸度測定方法：每2 h取菌液，按酸堿滴定消耗堿的體積來測定乳酸菌的酸度。以吉爾涅爾度（°T） 來表示乳酸菌的酸度，即每100 mL發(fā)酵液消耗1 mL 0.1 mol/L NaOH 溶液，記為°T[15]。

抗鹽性測定方法：將挑選的7株菌活化并進(jìn)行鹽敏感測試，按3%的接種量分別接種于0% NaCl、1% NaCl、3% NaCl、5% NaCl的MRS液體培養(yǎng)基，以37 ℃、180 r/min于振蕩培養(yǎng)箱培養(yǎng)2 h，按10-1、10-2、10-3、10-4、10-5、10-6的梯度進(jìn)行稀釋，然后取10-6的菌液0.1 mL分別均勻涂布于含空白、1% NaCl、3% NaCl、5% NaCl的MRS固體培養(yǎng)基，在恒溫培養(yǎng)箱培養(yǎng)48 h，最后采用平板計(jì)數(shù)法計(jì)算活菌數(shù)目并對(duì)數(shù)據(jù)進(jìn)行分析比較，以此來確定各乳酸菌生長的最適鹽濃度及抗鹽能力。

根據(jù)測定菌懸液的OD值、pH值、酸度和活菌數(shù)來制作乳酸菌生長曲線圖、pH值變化趨勢圖、酸度變化趨勢圖、抗鹽統(tǒng)計(jì)表。

2 結(jié)果與分析

2.1 乳酸菌的生長曲線

14株乳酸菌生長曲線的測定結(jié)果如圖1所示?？梢姡?4株菌的OD值在培養(yǎng)初始沒有明顯的變化，待到6 h之后14株乳酸菌幾乎都開始大量生長繁殖并且進(jìn)入對(duì)數(shù)生長時(shí)期，但培養(yǎng)20 h后各菌株的生長逐漸變慢，然后到達(dá)穩(wěn)定期。

由表1可知各菌株之間生長速度沒有顯著差異（F=1.038，P=0.418>0.05），但不同時(shí)間乳酸菌的生長速度有顯著差異（F=67.879，P=0<0.05）。在14株乳酸菌中，其中5-1、29-1這2株菌的對(duì)數(shù)生長期開始的最早，培養(yǎng)4 h后開始，從4～16 h這2株菌都快速增長，16～48 h生長速度幾乎一直保持不變。而19-1菌株的對(duì)數(shù)生長開始的較晚，培養(yǎng)10 h后進(jìn)入對(duì)數(shù)生長期且一直持續(xù)到48 h，說明此菌的適應(yīng)時(shí)間較長，對(duì)于要縮短發(fā)酵周期的試驗(yàn)，顯然是劣勢菌?？偟膩碚f，不同的乳酸菌耐酸能力有所不同，因此不同乳酸菌的生長繁殖也表現(xiàn)出一定的差異性。對(duì)不同時(shí)間的14株菌的生長狀況進(jìn)行多重比較，結(jié)果表明5-1、29-1這2株菌生長性能較好，而9-1、16-1、16-4、21-4、25-1這5株菌的生長性能較差，因此，篩選出5-1和29-1這2株生長繁殖旺盛的菌株。

2.2 乳酸菌的pH變化

pH在一定程度上可反映乳酸菌的產(chǎn)酸性能，14株乳酸菌的pH變化如圖2所示。在培養(yǎng)早期（0～4 h）14株乳酸菌的pH變化不明顯，4 h后14株乳酸菌pH開始下降，在4～18 h pH快速下降，即處于對(duì)數(shù)生長期，同時(shí)此階段菌體生長快速、代謝加快。表明乳酸菌開始大量繁殖，產(chǎn)酸量迅速升高，同時(shí)菌體的代謝速度也加快。在18～24 h時(shí)，pH下降變緩，產(chǎn)酸能力減弱，表明細(xì)菌代謝減慢，菌體生長已進(jìn)入穩(wěn)定期。由表1可知，不同乳酸菌菌株pH變化差異不顯著（F=1.407，P=0.162>0.05）。不同時(shí)間乳酸菌pH變化差異顯著（F=63.751，P=0<0.05）。

對(duì)不同時(shí)間的14株乳酸菌的pH進(jìn)行多重比較，如圖2所示，5-1、29-1這2株乳酸菌的pH在4～16 h下降較快、持續(xù)時(shí)間長。在18～48 h，pH幾乎不變。其中5-1菌株的pH在4～18 h都下降較快，且5-1菌株的pH曲線圖最陡，因此該階段5-1菌株產(chǎn)酸速度和產(chǎn)酸量最大且明顯優(yōu)于其他菌株，16 h后開始進(jìn)入穩(wěn)定期，產(chǎn)酸速度減小，但產(chǎn)酸量還在增加。5-4菌株的pH下降較快的時(shí)間段為培養(yǎng)后的10～26 h，該菌株用于微生物發(fā)酵將延長發(fā)酵時(shí)間。29-1在4-16 h期間pH下降的較快，之后便進(jìn)入穩(wěn)定期，同時(shí)剩余乳酸菌的pH也有所下降，但下降速度較緩慢。分析發(fā)現(xiàn)整個(gè)過程幾乎與乳酸菌的活菌數(shù)變化情況大體一致。

2.3 乳酸菌酸度變化

酸度在一定程度上也能反映菌株的產(chǎn)酸性能。酸度越大，產(chǎn)酸性能越強(qiáng)，環(huán)境的pH也會(huì)隨之降低。14株乳酸菌48 h內(nèi)酸度變化如圖3所示，可看出14株乳酸菌的酸度變化有一定差異性?？偟膩砜?，14株乳酸菌在4～36 h產(chǎn)酸速度逐漸增加，此階段處于乳酸菌對(duì)數(shù)生長期。在36～48 h，乳酸菌的產(chǎn)酸量基本保持不變，菌體的生長從對(duì)數(shù)期進(jìn)入到穩(wěn)定期，之后進(jìn)入衰亡期。同時(shí)，由表1可知，14株菌酸度變化有顯著差異（F=7.18，P=0<0.05），不同時(shí)間各菌株的產(chǎn)酸量也存在顯著差異（F=133.381，P=0<0.05）。

對(duì)不同時(shí)間各株乳酸菌酸度進(jìn)行多重比較，可以看出5-1、28-1、29-1這3株乳酸菌的產(chǎn)酸能力較強(qiáng)，且產(chǎn)酸量較高的時(shí)間段為8～36 h。其中5-1菌株產(chǎn)酸量從6～48 h不斷上升并持續(xù)到48 h之后，若要將5-1作為優(yōu)勢菌株，一定要控制好該菌株的后酸化。9-3菌株從8～36 ?h產(chǎn)酸速度快速增加，36～48 h產(chǎn)酸速度緩慢增加，且一直有增加的趨勢。28-1菌株是從4～14 h產(chǎn)酸量快速增加，14～18 h產(chǎn)酸量幾乎不變，18～48 h產(chǎn)酸量又快速增加。29-1菌株從4～36 h產(chǎn)酸量不斷增加，36～48 h產(chǎn)酸量幾乎不變。從圖中也可看出，其余8株菌的產(chǎn)酸能力相對(duì)較弱。14株菌在不同的時(shí)間產(chǎn)酸量各不相同，因此應(yīng)根據(jù)實(shí)際需要選擇恰當(dāng)?shù)臅r(shí)間添加乳酸菌株。

2.4 鹽敏感測試

不同菌株在不同鹽濃度中的活菌變化情況如表2。

由表2可以看出，這7株乳酸菌的鹽耐受能力由高到低依次為：28-1>21-3>5-1>16-4>29-1>19-2>10-1。已有研究表明：H+-ATPase在乳酸菌株處于不良鹽環(huán)境下時(shí)，可以有效調(diào)節(jié)滲透壓，因此對(duì)菌株的耐鹽性有重要作用。當(dāng)細(xì)胞處于逆環(huán)境時(shí)，要調(diào)節(jié)細(xì)胞內(nèi)環(huán)境的滲透壓，必然需要質(zhì)子泵為跨膜運(yùn)輸提供動(dòng)力，一般認(rèn)為陽離子的跨膜調(diào)節(jié)是通過H+-ATPase來完成[16]，從而來調(diào)節(jié)細(xì)胞膜兩側(cè)的滲透壓?？梢?，菌株的耐鹽性與H+-ATPase酶活有密切關(guān)系，因此不同菌株表現(xiàn)不同的耐鹽性是合理的[17]。

3 結(jié)論與討論

本試驗(yàn)有7個(gè)種的乳桿菌，其中植物乳桿菌的產(chǎn)酸性能最強(qiáng)，植物乳桿菌也常存在于發(fā)酵的蔬菜和果汁中[18]，是傳統(tǒng)醬腌菜中的優(yōu)勢菌[19]。人體腸道常見的乳桿菌，如植物乳桿菌，它對(duì)調(diào)節(jié)人體健康有積極作用，同時(shí)也是目前研究和關(guān)注的熱點(diǎn)之一[20]。乳酸菌除了具有產(chǎn)酸性能外，還具有降解亞硝酸鹽、富硒性能、酸應(yīng)激性、抑菌性、預(yù)防貧血等眾多性能[21]，但產(chǎn)酸性能是評(píng)價(jià)乳酸菌優(yōu)良的基本指標(biāo)，因此本試驗(yàn)測了14株菌的生長曲線、pH、酸度和抗鹽性。

本試驗(yàn)通過測OD值得出5-1、29-1在4～16 h時(shí)，菌體數(shù)目迅速增加，這可能是由于發(fā)酵初期，培養(yǎng)液酸度較低，環(huán)境非常適合乳酸菌的生長[22]。結(jié)果表明，若將這2株菌用于食品發(fā)酵中可能縮短發(fā)酵時(shí)間提高發(fā)酵的效率。通過測pH得出5-1、29-1這2株乳酸菌具有明顯的優(yōu)越性。結(jié)果表明，若有較強(qiáng)的生長繁殖能力，那么也會(huì)導(dǎo)致其有較強(qiáng)的產(chǎn)酸能力，因此可通過控制菌體的數(shù)量的來控制發(fā)酵食品的酸度和后酸化，同時(shí)解決后酸化問題是當(dāng)前乃至未來需關(guān)注的熱點(diǎn)問題。通過測發(fā)酵液的總酸度得出5-1、29-1這2株菌在4～36 h產(chǎn)酸速度迅速增加，隨著乳酸含量升高，酸度上升變快[23]。在36～48 h時(shí)，5-1、29-1這2株乳酸菌的生長從穩(wěn)定期進(jìn)入衰亡期，這可能是由于發(fā)酵中期和后期，隨著乳酸菌的不斷繁殖，酸度不斷升高，導(dǎo)致高酸度環(huán)境對(duì)乳酸菌的生長有不同程度的抑制作用[24]。通過對(duì)平板活菌數(shù)的記錄、統(tǒng)計(jì)和分析，得出5-1、29-1適合低鹽環(huán)境生長，而21-3、28-1適合在高鹽環(huán)境。高鹽食品會(huì)導(dǎo)致高血壓、心腦血管等疾病，因此可得出5-1、29-1是低鹽純種強(qiáng)化發(fā)酵的最佳菌株。

綜上所述，通過對(duì)14株乳酸菌產(chǎn)酸指標(biāo)的測定，得出5-1（Lactobacillus plantarum）和29-1（Lactobacillus alimentarius）這2株菌的生長繁殖能力強(qiáng)、產(chǎn)酸能力強(qiáng)且適合低鹽環(huán)境生長，因此可將這2株優(yōu)良菌株用來作為發(fā)酵泡椒、酸奶、泡菜等發(fā)酵食品的優(yōu)良菌種，同時(shí)這2株菌也可作為進(jìn)一步研究與應(yīng)用的備選菌株，深入探索和挖掘其產(chǎn)酸的調(diào)控機(jī)制和產(chǎn)生對(duì)人體健康有益的物質(zhì)。

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