兩種高濃度靜注人免疫球蛋白中IgA 殘留量檢測方法的驗(yàn)證及比較

劉勇，李澤秀，唐良玉，鄧靖，張堯，余雨蓉，陳云華，趙學(xué)梅

貴州泰邦生物制品有限公司，貴州貴陽550025

靜注人免疫球蛋白（human immunoglobulin for intravenous injection，IVIG）是治療原發(fā)性免疫缺陷病、繼發(fā)性免疫缺陷病和自身免疫性疾病（原發(fā)性血小板減少癥、川崎?。┑挠行幬铮?-4］。目前，國內(nèi)上市的IVIG 制劑為IVIG（pH4），蛋白濃度為50g／L（5%IVIG），以糖類作為穩(wěn)定劑。高濃度IVIG 是采用層析工藝開發(fā)的新一代 IVIG 制劑［5］，蛋白濃度為 100 g ／L（10%IVIG），以氨基酸類作為穩(wěn)定劑，國內(nèi)暫無產(chǎn)品上市。目前，10%IVIG 的研發(fā)已成為血液制品行業(yè)的焦點(diǎn)［6-7］。

選擇性IgA 缺乏癥（selective immunoglobulin A deficiency，SIgAD）是指患者血清 IgA 低于 0.05 g ／L，IgG 和IgM 含量正常，是免疫缺陷中最常見的類型，占原發(fā)性免疫缺陷病的60%以上。IgA 缺乏型患者可能因使用含IgA 的IVIG 制劑而產(chǎn)生抗-IgA，當(dāng)再次輸入該類制品時可產(chǎn)生嚴(yán)重的過敏反應(yīng)，甚至危及生命，因此，嚴(yán)格控制IVIG 中IgA 殘留量具有重要的臨床意義［8-9］，國外如Octaphama 公司內(nèi)部標(biāo)準(zhǔn)要求 IVIG 制品 IgA 殘留量 ≤ 200 μg ／ mL［10］。

《中國藥典》三部（2020 版）已增加IVIG 中IgA殘留量檢測要求，檢測方法包括紫外-可見分光光度法、酶聯(lián)免疫法和散射比濁法 3 種［11］。10% IVIG 較5%IVIG 蛋白濃度高1 倍，更應(yīng)關(guān)注制品中IgA 的殘留量。目前，紫外-可見分光光度法中所用抗人IgA 血清試劑批間質(zhì)量尚存在一定的差異，為加快10%IVIGⅢ期臨床樣品IgA 殘留量檢測方法的建立，本研究對酶聯(lián)免疫法和散射比濁法進(jìn)行驗(yàn)證及比較。

1 材料與方法

1.1 供試品 高濃度IVIG 由貴州泰邦生物制品有限公司生產(chǎn)。

1.2 主要試劑及儀器 人IgA 測定試劑盒購自美國Immunology Consultants Laboratory，Inc 公司（ICL）；人腦脊液IgA 測定試劑盒購自德國Siemens Healthcare Diagnostics Products GmbH 公司；IgA 國際標(biāo)準(zhǔn)品（批號：67 ／ 086，規(guī)格：100 IU ／ 支，1 IU = 14.2 μg）購自NIBSC；全波長酶標(biāo)儀購自美國賽默飛公司；BN Pro-Spec?全自動蛋白分析儀購自德國Siemens Healthcare Diagnostics Products GmbH ／西門子公司。

1.3 檢測方法

1.3.1 酶聯(lián)免疫法 取ICL 試劑盒中樣品稀釋液進(jìn)行5 倍稀釋，配制成樣品稀釋液，并將樣品 ／ 標(biāo)準(zhǔn)品按需求進(jìn)行稀釋。取100 μL 標(biāo)準(zhǔn)品 ／ 樣品，室溫孵育 30 min；洗滌液洗板 3 次，加入 100 μL 酶標(biāo)工作液，避光孵育30 min；洗滌液洗板3 次，加入100 μL TMB 顯色液，避光孵育 10 min；加入 100 μL 終止液，酶標(biāo)儀450 nm 測定A 值，A450值與濃度進(jìn)行四參數(shù)擬合，得到標(biāo)準(zhǔn)曲線，計(jì)算IgA 殘留量。

1.3.2 散射比濁法 IgA 試劑盒內(nèi)定標(biāo)液、質(zhì)控品、檢測試劑、檢測輔助試劑按要求進(jìn)行復(fù)溶，放入儀器指定位置；供試品經(jīng)0.45 μm 微孔濾膜過濾后，取2 mL 濾液置于試管中，裝載上機(jī)檢測IgA 殘留量。

1.4 方法的驗(yàn)證

1.4.1 線性與范圍

1.4.1.1 酶聯(lián)免疫法 將ICL 試劑盒內(nèi)標(biāo)準(zhǔn)品按照試劑盒說明書用樣品稀釋液倍比稀釋，按1.3.1 項(xiàng)步驟檢測，驗(yàn)證線性與范圍。

1.4.1.2 散射比濁法 將試劑盒內(nèi)定標(biāo)品裝載至全自動蛋白分析儀上，建立標(biāo)準(zhǔn)曲線方法，儀器自動按預(yù)設(shè)比例倍比稀釋，驗(yàn)證線性與范圍。

1.4.2 準(zhǔn)確度 采用加標(biāo)回收率法。取復(fù)溶后的標(biāo)準(zhǔn)品溶液，分別稀釋至 6、12 和 18 μg ／ mL；將 10%IVIG 原液稀釋至濃度分別約為 6、12 和 18 μg ／ mL，作為供試品。將對應(yīng)濃度的標(biāo)準(zhǔn)品和供試品按體積比1 ∶1 混合，分別制成3 個濃度水平的加標(biāo)混合溶液，每個濃度制備3 份，分別采用酶聯(lián)免疫法和散射比濁法進(jìn)行測定，按下式計(jì)算回收率，驗(yàn)證方法的準(zhǔn)確度。

回收率（%）=（加標(biāo)供試品測定濃度-供試品測定濃度）／標(biāo)準(zhǔn)品理論濃度× 100%

1.4.3 重復(fù)性 分別采用酶聯(lián)免疫法和散射比濁法測定平行制備的6 份10% IVIG，并計(jì)算RSD，驗(yàn)證方法的重復(fù)性。

1.4.4 中間精密性 不同試驗(yàn)員于不同時間獨(dú)立采用酶聯(lián)免疫法和散射比濁法分別測定平行制備的6 份 10% IVIG 的 IgA 殘留量，并計(jì)算 RSD，驗(yàn)證方法的中間精密性。

1.4.5 專屬性 取同一批次的2 份10%IVIG 樣品，分別采用酶聯(lián)免疫法和散射比濁法測定，樣品1 直接測定IgA 殘留量，樣品2 添加甘氨酸濃度至20 g ／ L再測定IgA 殘留量，各平行測定3 次，并計(jì)算RSD，驗(yàn)證方法的專屬性。

1.5 兩種方法的比較 取3 批10% IVIG，分別采用酶聯(lián)免疫法和散射比濁法測定樣品中的IgA 殘留量，每個樣品平行制備3 份。

1.6 委外檢測比對 試制7 批次10% IVIG 的Ⅲ期臨床試驗(yàn)藥物，完成公司自檢后，委托中國食品藥品檢定研究院檢測IgA 殘留量，進(jìn)行比對分析。

1.7 統(tǒng)計(jì)學(xué)分析 應(yīng)用SPSS 25.0 軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)分析，組間比較采用獨(dú)立樣本t 檢驗(yàn)，以P < 0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié) 果

2.1 方法的驗(yàn)證

2.1.1 線性與范圍

2.1.1.1 酶聯(lián)免疫法 IgA 濃度在2.5~800 ng／mL范圍內(nèi)，以IgA 標(biāo)準(zhǔn)品A450值和濃度做四參數(shù)曲線擬合，IgA 與A450呈良好的線性關(guān)系，相關(guān)系數(shù)r 為0.999 96。見圖1。

圖1 酶聯(lián)免疫法標(biāo)準(zhǔn)曲線Fig.1 Standard curve of ELISA

2.1.1.2 散射比濁法 以IgA 的濃度0.261~8.35mg／L與散射光強(qiáng)度值求得直線回歸方程，標(biāo)準(zhǔn)曲線均值偏差為0.56%，見圖2。

圖2 散射比濁法標(biāo)準(zhǔn)曲線Fig.2 Standard curve of nephelometry assay

2.1.2 準(zhǔn)確度 酶聯(lián)免疫法和散射比濁法測定不同濃度水平樣品的平均加標(biāo)回收率（n = 9）分別為103.32%和89.82%，見表1。表明兩種方法受樣品基質(zhì)影響小，能夠準(zhǔn)確測定10%IVIG 中IgA 的殘留量。

表1 兩種方法的回收率測定結(jié)果Tab.1 Determination results of recoveries by two methods

2.1.3 重復(fù)性 酶聯(lián)免疫法和散射比濁法重復(fù)測定10%IVIG IgA 殘留量的RSD 分別為4.90%和5.05%，均小于8%，見表2。表明兩種方法重復(fù)性良好。

表2 兩種方法的重復(fù)性驗(yàn)證結(jié)果Tab.2 Verification for reproducibility of two methods

2.1.4 中間精密性 酶聯(lián)免疫法和散射比濁法測定10% IVIG IgA 殘留量的RSD 分別為5.88%和5.42%，均小于8%，見表3。表明兩種方法中間精密性良好。

表3 兩種方法的精密性驗(yàn)證結(jié)果Tab.3 Verification for precision of two methods

2.1.5 專屬性 酶聯(lián)免疫法和散射比濁法測定結(jié)果的均值分別為 9.38 和 7.28 μg ／ mL，RSD 分別為6.14%和4.3%，見表4。表明甘氨酸輔料對IgA 檢測干擾較小。

表4 兩種方法的專屬性驗(yàn)證結(jié)果Tab.4 Verification for specificity of two methods

2.2 兩種方法的比較 酶聯(lián)免疫法與散射比濁法相比，測定IgA 殘留量偏高，兩種方法平行測定的結(jié)果穩(wěn)定性良好，兩種方法檢測結(jié)果差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（t = 1.311，P = 0.260）。見表 5。

表5 兩種方法檢測結(jié)果的比較Tab.5 Determination results by two methods

2.3 委外檢測結(jié)果 委外檢驗(yàn)10% IVIG 的IgA 殘留量略低于企業(yè)自檢結(jié)果，見表6。

表6 委外檢測與企業(yè)自檢結(jié)果比對（μg ／ mL）Tab.6 Determination results by two laboratories（μg ／ mL）

3 討 論

本研究通過酶聯(lián)免疫法和散射比濁法檢測10%IVIG 中IgA 殘留量，并驗(yàn)證兩種檢測方法的線性范圍、準(zhǔn)確度、重復(fù)性、中間精密性、專屬性均符合藥典要求，兩種方法的檢測結(jié)果差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P ＞0.05），但酶聯(lián)免疫法較散射比濁法檢測結(jié)果略高，這可能與供試品IgA 含量較低有關(guān)，有一定的誤差，今后需進(jìn)一步深入研究。

采用兩種方法檢測試制7 批次的高濃度IVIGⅢ期臨床試驗(yàn)藥物中的IgA 殘留量略高于中國食品藥品檢定研究院檢測結(jié)果，這可能與不同實(shí)驗(yàn)室采用的檢測試劑盒、儀器不同有關(guān)，后續(xù)還需進(jìn)行多批次對比分析。高濃度IVIGⅢ期臨床試驗(yàn)藥物中的IgA 殘留量遠(yuǎn)低于 200 μg ／ mL。

已有研究報道國內(nèi)廠家已上市的IVIG（pH 4）IgA均值約 150 μg ／ mL，部分廠家接近 400 μg ／ mL［12］。IgA 是IVIG 中重要的安全性指標(biāo)，本研究檢測的新型高濃度IVIG 中雜蛋白IgA 含量極低，能有效降低副作用，臨床使用更加安全［9］。

《中國藥典》三部（2020 版）中規(guī)定的3 種測定方法原理均是基于IgA 與相應(yīng)的抗體特異性結(jié)合，與酶聯(lián)免疫法和散射比濁法所用的包被IgA 特異性抗體的酶標(biāo)板和顆粒不同，紫外-可見分光光度法使用的試劑是抗人IgA 血清（應(yīng)為全血清經(jīng)一定純化技術(shù)分離制得的特異性抗體），而目前國內(nèi)抗人IgA血清試劑批間質(zhì)量尚存在一定差異，因此暫未系統(tǒng)地開展該方法驗(yàn)證。

酶聯(lián)免疫法具有簡便、快速、靈敏、精確等優(yōu)點(diǎn)而被廣泛使用，更易于實(shí)驗(yàn)室操作［13］；散射比濁法所使用的全自動蛋白分析儀更多地應(yīng)用于醫(yī)療機(jī)構(gòu)臨床檢驗(yàn)，檢測時間短于酶聯(lián)免疫法，但對于IgA 含量較低的IVIG 檢測時需使用人腦脊液IgA 測定試劑盒，費(fèi)用相對較高。《中國藥典》三部（2020 版）規(guī)定，首次采用本法檢測供試品中IgA 殘留量時，應(yīng)根據(jù)不同樣品基質(zhì)及IgA 殘留量的水平選擇適宜的測定方法，并進(jìn)行相應(yīng)的驗(yàn)證［11］。

綜上所述，本研究結(jié)果表明，酶聯(lián)免疫法和散射比濁法均可用于高濃度IVIG 中IgA 殘留量的質(zhì)量控制，基于檢測費(fèi)用成本考慮，同時多批次酶聯(lián)免疫法檢測結(jié)果略高于散射比濁法，參考風(fēng)險評估原則，企業(yè)對于IgA 含量極低的10% IVIG 中IgA 殘留量進(jìn)行放行檢測時，更推薦使用酶聯(lián)免疫法。此外，參考《中國藥典》，企業(yè)也可根據(jù)研制的10% IVIG 樣品基質(zhì)及IgA 殘留量的水平選擇適宜的測定方法。