基于網(wǎng)絡藥理學探討振中湯治療類風濕關節(jié)炎作用機制*

張尚祖，陳 琰，冒 銳，張鵬程，張宏偉，馬吾生，張利英，，3，劉永琦，3

(1.甘肅中醫(yī)藥大學，甘肅 蘭州 730000；2.甘肅省心血管病研究所；3.甘肅省高校重大疾病分子醫(yī)學與中醫(yī)藥防治研究重點實驗室)

類風濕關節(jié)炎(rheumatic arthritis,RA)是一種主要表現(xiàn)為侵蝕性、對稱性關節(jié)炎的慢性、全身性自身免疫疾病[1]。其基本病理改變?yōu)殛P節(jié)慢性滑膜炎癥，逐步發(fā)展出現(xiàn)軟骨基質(zhì)和骨破壞，最終導致關節(jié)形狀、功能喪失[2]。據(jù)報道，全球范圍內(nèi)RA發(fā)病率呈上升趨勢，我國患病率約0.4 %，多見于中年女性[3]。目前，指南多推薦甲氨蝶呤作為臨床首選藥物，但其起效慢、療程長，部分患者表現(xiàn)胃腸道反應、肝損害等多種不耐受[4]。以TNF-α拮抗劑為代表的生物靶向制劑對近半數(shù)患者并不敏感，長期使用可能增加結核、腫瘤風險，再加上其高昂的價格和治療的長周期性都限制了臨床使用[5]。中醫(yī)將該病歸于“痹證”探討，成書于春秋戰(zhàn)國的《素問》已有專篇論述，形成了風、寒、濕三邪夾雜，致肢體經(jīng)絡氣血運行不暢，瘀血痰濁痹阻關節(jié)的基本病因病機認識，后經(jīng)各大醫(yī)家接續(xù)發(fā)展，建立了系統(tǒng)的辨治體系，創(chuàng)立了大量常用驗方。中醫(yī)治療RA具有獲效快、不良反應少等特點，結合現(xiàn)代研究進展，開發(fā)了雷公藤多苷片等多種良效中藥制劑，并隨著網(wǎng)絡藥理學發(fā)展中藥復方研究進一步獲得關注。

振中湯源于《醫(yī)學衷中參西錄》，主腿疼、腰疼，飲食減少者。方重用白術，一取其主風寒濕痹之意；二取其健補脾胃以旁達關節(jié)之功；陳皮、厚樸共主中焦，以辛苦之味入脾胃經(jīng)脈，行氣燥濕，除無形之痰濕；乳香、沒藥二味，入心肝脾經(jīng)，氣血同治，解肢體痹痛。有健補脾胃、通活氣血之功，善治風寒濕痹。網(wǎng)絡藥理學利用網(wǎng)絡生物學及生物信息學技術，全面揭示疾病的發(fā)展過程和藥物與機體的相互作用，為中藥復方多層次系統(tǒng)研究提供了方法[6]。本研究基于網(wǎng)絡藥理學探討振中湯治療RA的主要有效化合物、作用靶點、作用通路，旨在為研究振中湯治療RA的具體作用機制提供研究思路，為其臨床上更廣泛的應用提供依據(jù)。

1 材料與方法

1.1振中湯有效成分及靶點篩選 基于中藥系統(tǒng)藥理學數(shù)據(jù)庫與分析平臺(Traditional Chinese Medicine Systems Pharmacology Database and Analysis Platform，TCMSP)[7]搜集振中湯中白術、當歸、陳皮、乳香、沒藥、厚樸的化合物，以口服生物利用度(oral bioavailability，OB)≥ 30 % 和類藥性(drug-likeness，DL)≥ 0.18 篩選出振中湯有效成分，通過Uniport數(shù)據(jù)庫(http://www.uniprot.org/)[8]將振中湯有效成分蛋白名轉(zhuǎn)化為基因名。

1.2振中湯有效成分-靶點網(wǎng)絡構建 將篩選所獲藥物有效成分和經(jīng)Uniprot數(shù)據(jù)庫驗證的靶點信息,構建成作圖節(jié)點信息導入Cytoscape3.8.2[9],構建振中湯有效成分-靶點網(wǎng)絡。

1.3類風濕關節(jié)炎靶點獲取 通過Drugbank數(shù)據(jù)庫(http：//www.drugbank.ca/)[10]和Genecard數(shù)據(jù)庫(http：//www.genecards.org/)[11]以“rheumatic arthritis”“RA”為關鍵詞檢索RA相關疾病靶點，并使用Uniprot數(shù)據(jù)庫進行規(guī)范。

1.4關鍵靶點篩選及構建蛋白作用網(wǎng)絡 應用Venny2.1在線平臺(http：//bioinfogp.cnb.csic.es/tools/venny)將振中湯有效成分靶點和RA相關的疾病靶點建立映射構建韋恩圖。獲得交集的可能是振中湯有效成分治療RA的關鍵靶點。將交集共同靶點輸入String11.0數(shù)據(jù)庫(https：//string-db.org/)[12]構建蛋白-蛋白相互作用(protein-protein interaction,PPI)網(wǎng)絡。

1.5關鍵靶點基因功能注釋和通路富集分析 應用 WebGestalt 富集分析工具(http：//www.webgestalt.org)[13]，選擇ORA Sample Run數(shù)據(jù)入口，使用ORA算法，選擇pathway注釋數(shù)據(jù)來源和KEGG數(shù)據(jù)庫，輸入交集共同靶點，設置genome protein-coding為參考基因集，進行基因本體(Gene Ontology，GO)[14]功能注釋和京都基因與基因組百科全書(Kyoto Encyclopedia of Genes and Genomes，KEGG)[15]通路富集分析，保留P≤0.05 的結果進行可視化處理，進一步分析振中湯治療RA潛在的生物過程和信號通路。

2 結果

2.1振中湯有效成分-作用靶點網(wǎng)絡構建 本次研究在TCMSP數(shù)據(jù)庫中共篩選振中湯有效成分53個，其中白術4個，當歸2個，陳皮5個，乳香6個，沒藥34個，厚樸2個，去除2個重復有效成分，共計51個有效成分納入研究。將所獲有效成分蛋白名經(jīng)Uniport數(shù)據(jù)庫轉(zhuǎn)換去重后共得到234個靶點基因信息。將上述數(shù)據(jù)導入構建作圖文件后導入Cytoscape3.8.2進行可視化分析。見表1、圖1。

圖1 振中湯有效成分靶點網(wǎng)絡

表1 振中湯成分信息

2.2RA疾病靶點的篩選及共同靶點PPI網(wǎng)絡構建 通過Drugbank和Genecard數(shù)據(jù)庫檢索疾病靶點信息，并刪除重復項，獲得RA相關基因1 223個。將1223個疾病基因與234個振中湯有效成分靶點基因信息錄入Venny2.1取交集后獲得了120個疾病-有效成分共同靶點，所得共同靶點在振中湯治療RA中具有重要作用。將120個共同靶點錄入String11.0數(shù)據(jù)平臺構建PPI網(wǎng)絡，只選取評分值 > 0.9的最高置信度數(shù)據(jù)，獲得一個120個節(jié)點、429條邊、平均度值為7.15的網(wǎng)絡圖，其節(jié)點邊越多則該節(jié)點在PPI網(wǎng)絡中越重要。將該網(wǎng)絡tsv格式導入Cytoscape進行可視化化分析，利用Analyze Network插件，選擇degree二倍中位數(shù)篩選，獲得25個關鍵靶點基因PPI示圖，依據(jù)度值設置節(jié)點大小，由振中湯治療RA關鍵靶點PPI網(wǎng)絡圖可見，原癌基因(JUN)、腫瘤壞死因子(TNF)、絲裂原活化蛋白激酶3(MAPK3)、白細胞介素-6(IL6)、蛋白激酶B1(ATK1)、B細胞k輕肽基因增強子核因子3(RELA)、腫瘤蛋白P53(TP53)、即早基因(FOS)、白細胞介素-8(CXCL8)、雌激素受體1(ESR1)、myc基因(MYC)、信號轉(zhuǎn)導與轉(zhuǎn)錄激活因子1(STAT1)、B細胞k輕肽基因增強子核因子抑制因子(NFKBIA)等25個靶基因可能是振中湯與RA產(chǎn)生作用的關鍵靶點。見圖2、3、4。

圖2 振中湯(ZZT)有效成分靶點與RA靶點韋恩圖

圖3 振中湯治療RA的PPI網(wǎng)絡

圖4 振中湯治療RA關鍵靶點PPI網(wǎng)絡

2.3關鍵靶點GO生物功能注釋 用 WebGestalt 富集分析工具,設置P值 ≤0.05,P值越小，富集程度越高。對振中湯有效成分靶點-RA靶點的120個交集靶基因進行GO生物功能注釋，共獲取到119個生物進程，預測靶基因代謝途徑(BP)主要富集于刺激反應(response to stimulus)、生物調(diào)節(jié)(biological regulation)、代謝過程(metabolic process)等；振中湯調(diào)控的細胞成分(CC)為膜區(qū)(membrane)、腔上包膜membrane-enclosed lumen)、細胞溶質(zhì)(cytosol)等；分子功能(MF)涉及蛋白質(zhì)結合(protein binding)、離子結合(ion binding)、核酸結合(nucleic acid binding)等方面。這表明振中湯多種成分可以通過調(diào)節(jié)機體對刺激的應答反應、生物物質(zhì)代謝等途徑，作用于細胞各層結構組織和各種人體內(nèi)物質(zhì)的結合過程，以維持機體內(nèi)環(huán)境的穩(wěn)定從而發(fā)揮對RA的治療作用。見圖5。

圖5 振中湯靶點基因GO分析條形圖

2.4KEGG通路富集分析 用 WebGestalt 富集分析工具對振中湯有效成分靶點-RA靶點的120個交集靶蛋白進行KEGG富集通路分析，設置P值 ≤ 0.05，共包括104條信號通路，取P值最小的前20條通路，導入在線平臺omicshare(https：//www.omicshare.com)繪制P值顏色梯度富集條形圖。視圖可見，共同靶點主要富集于TNF信號通路、AGE-RAGE信號通路、白介素-17信號通路、Th17細胞分化、Toll樣受體信號通路、內(nèi)分泌抵抗、破骨細胞分化、HIF-1信號通路等20條通路上。見圖6。

圖6 振中湯靶點基因 KEGG富集條形圖

3 討論

3.1振中湯治療RA有效成分分析 張錫純所著《醫(yī)學衷中參西錄》一書，結合張氏熟讀醫(yī)史之通悟和數(shù)十載臨床經(jīng)驗，對具體藥物使用推陳出新，臨床注重滋補后天脾胃，調(diào)暢一身氣機，處方用藥簡明有效，為后世醫(yī)家所喜。振中湯雖主腰腿疼痛，但白術獨重是為主“痹證”之意，配伍它藥氣血同調(diào)，使人體氣機得暢，有形無形之痰瘀皆可得去，體現(xiàn)了張氏臨床之精妙。藥理學研究表明白術含揮發(fā)油、倍半萜類酯化合物具有促進營養(yǎng)物質(zhì)吸收、調(diào)節(jié)胃腸道功能、抗衰老、抗感染、抗腫瘤等作用[16]；當歸含β-谷甾醇、豆甾醇，具有促進血細胞生成、增強機體免疫、抑制炎癥后期肉芽組織增生、抗血栓、抗腫瘤、抗感染等作用[17]；陳皮含黃酮類、生物堿類等成分，具有抗血小板凝集、抗氧化、抗衰老、抗過敏、抗腫瘤等作用[18]；乳香含甘遂醇、乳香脂酸等物質(zhì)，具有鎮(zhèn)痛、抗炎消腫、廣譜抗菌、抗氧化、降低血小板黏稠性、抗腫瘤等作用[19]；沒藥含槲皮素、沒食子酸、花葵素等成分，具有降脂、鎮(zhèn)痛、消炎抗菌、抗腫瘤等作用[20]；厚樸含桉葉油醇、新橙皮苷，具有抑菌、松弛肌肉、調(diào)節(jié)胃腸功能、降壓等作用[21]。

3.2振中湯治療RA的關鍵靶點分析 通過韋恩圖獲得藥物疾病共同靶點，通過PPI分析，Cytoscape對關鍵靶點進行篩選，可發(fā)現(xiàn)JUN、TNF、MAPK3、IL6、ATK1、NFKBIA等25個靶點對振中湯治療RA發(fā)揮關鍵作用，對Degree前十的關鍵靶點進行分析。RA患者穿刺標本中可見原癌基因(JUN)中fos、ras表達增高，并且JUN可與TNF-、CREB等多種基因轉(zhuǎn)錄因子結合，誘導增生滑膜細胞凋亡[22-23]。動物實驗發(fā)現(xiàn)，腫瘤壞死因子(TNF)表達越高，關節(jié)腫脹程度越重[24]，TNF參與RA炎癥過程和骨細胞增殖和分化并介導多種白細胞介素生成，可控制炎癥反應過程和直接殺傷或抑制RA相關細胞增殖[25-26]。絲裂原活化蛋白激酶(MAPK)系列通路成分，參與細胞生理過程和炎癥反應等病理過程，且能夠促進IL、TNF表達[27]，在RA病理過程中發(fā)揮重要作用。IL是RA病理過程的一種關鍵炎癥細胞因子，RA患者血液學檢測中白介素(IL)家族水平明顯增高，IL可通過刺激大量自身抗體生成、刺激血管內(nèi)皮增殖，誘導關節(jié)組織炎癥反應和骨細胞破壞，致使RA全身及局部癥狀[28-29]。蛋白激酶B1(ATK1)，在細胞凋亡，糖代謝，蛋白質(zhì)合成中具有重要作用，參與RA滑膜成纖維細胞生成[30]。B細胞k輕肽基因增強子核因子3(RELA)是NFκB 轉(zhuǎn)錄因子信號通路中的關鍵蛋白[31]，它可能在RA炎癥應答、介導相關信號傳遞、激活NFκB 轉(zhuǎn)錄因子等方面發(fā)揮作用。腫瘤蛋白P53(TP53)是細胞染色DNA的正常組成成分，具有重要的生理功能，在多種疾病中發(fā)揮重要作用，其被認為參與RA滑膜細胞增殖和骨破壞[32]，即早基因(FOS)可能通過參與機體多種細胞信號、功能調(diào)節(jié)，在RA中發(fā)揮作用[33-34]。雌激素受體1(ESR1)是配體依賴的轉(zhuǎn)錄調(diào)節(jié)因子，其可能通過刺激破骨細胞成熟，成骨細胞凋亡，促進骨形成，抑制骨小梁和皮質(zhì)內(nèi)骨表面的骨吸收參與RA疾病過程[35]。目前認為myc基因(MYC)異常表達，參與了多種腫瘤進程，對于RA疾病過程調(diào)節(jié)可能與滑膜增生有關。

3.3振中湯治療RA的關鍵通路分析 GO分析及KEGG通路富集結果顯示，關鍵靶點主要富集在TNF信號通路、AGE-RAGE信號通路、白介素-17信號通路等20條通路上。振中湯-RA關鍵靶點基因JUN、TNF、MAPK、IL、NFκB都可以調(diào)控TNF信號通路，增加滑膜細胞異常表達炎癥因子可能和促使滑膜細胞增生[36]。AGE-RAGE信號通路與RA關系缺少研究，但可能與AGEs含量與血管增生密切相關，AGEs與受體結合導致破骨、成骨細胞NF-kB途徑失調(diào)，骨重建紊亂有關[37]。白介素-17可誘導滑膜細胞、軟骨炎癥因子和趨化因子的表達[38]，使大量免疫細胞到達炎癥部位加劇機體的炎癥反應，IL-17、IL-6、TNF、IL-I等靶點可調(diào)節(jié)白介素-17信號通路加重RA關節(jié)癥狀甚至直接損傷關節(jié)[39]。Th17因子由Th0細胞在IL-6和IL-23的刺激下分化而成的輔助性T細胞，主要分泌各種促炎癥因子，與RA等自身免疫性疾病明顯相關[40]，實驗證明干預Th17細胞分化，可顯著改善RA動物模型病情。Toll樣受體信號通路可活化多種免疫細胞，啟動非特異性、激活特異性免疫應答，在炎癥反應、免疫細胞調(diào)控方面發(fā)揮著重要作用，實驗表明RA炎癥因子表達與其密切相關。尚缺乏RA內(nèi)分泌抵抗信號通路相關研究，但雌激素的異常表達對RA有重要作用，可以推斷雌激素抵抗可能導致骨關節(jié)結構、功能喪失。破骨細胞分化信號通路是維持骨功能、代謝的關鍵通路，RA患者骨代謝失衡，滑膜炎導致的骨侵蝕是其主要特征，NFκB途徑是介導破骨細胞分化的重要調(diào)節(jié)途徑[41]。HIF-1信號通路是機體細胞感知和反應氧氣的重要過程，缺氧可直接調(diào)節(jié)VEGF(血管內(nèi)皮生長因子)分化以促進血管生成，誘導p53蛋白的積累導致滑膜細胞增殖和骨破壞[42]。

綜上所述，本研究采用網(wǎng)絡藥理學方法，挖掘振中湯中51種有效成分及234個潛在靶點,類風濕關節(jié)炎相關疾病靶點1 223個,其中振中湯-類風濕關節(jié)炎共同靶點120個，共同作用靶點主要富集于119個生物過程和104條信號通路上。振中湯臨床治療RA多用，但尚無針對其治療機制的相關研究，運用網(wǎng)絡藥理學方法，可認為振中湯通過多靶點、多通路協(xié)調(diào)發(fā)揮治療類風濕關節(jié)炎，JUN、TNF、MAPK3、IL6、ATK1、RELA等可能是此治療過程的核心靶點，TNF信號通路、AGE-RAGE信號通路、白介素-17信號通路等為其主要作用通路，從而發(fā)揮抗炎、調(diào)節(jié)免疫、調(diào)節(jié)內(nèi)分泌功能、抑制滑膜細胞增殖、減少破骨細胞生成、抗缺氧應激來治療類風濕關節(jié)炎。但由于各種平臺存在數(shù)據(jù)更新不及時、數(shù)據(jù)一致性較差等限制，振中湯治療RA相關機制還需進一步實驗驗證。