褪黑素對(duì)內(nèi)蒙古絨山羊毛囊干細(xì)胞增殖和遷移的影響及機(jī)制探討*

嚴(yán)其高，祁冰潔，劉慧娟，劉金林，劉 毅

(安慶醫(yī)藥高等專科學(xué)校教務(wù)處，安徽 安慶 246052)

毛囊的周期發(fā)育過(guò)程是一個(gè)復(fù)雜的生理調(diào)控網(wǎng)絡(luò)，受到大量的細(xì)胞因子以及細(xì)胞信號(hào)通路的相關(guān)因子的調(diào)控及影響[1]。據(jù)報(bào)道，體內(nèi)的內(nèi)分泌激素、機(jī)體的營(yíng)養(yǎng)狀態(tài)、環(huán)境因素等均參與了毛囊周期性發(fā)育過(guò)程[2]。褪黑素最初是Lerner于1958年首次從牛的松果體中分離出來(lái)后被發(fā)現(xiàn)，目前得到證實(shí)的是，褪黑素由生物體的松果體分泌，本質(zhì)上屬于吲哚類的神經(jīng)內(nèi)分泌性激素及抗氧化劑，能夠刺激毛囊干細(xì)胞向毛囊細(xì)胞分化，促進(jìn)其增殖及遷移[3]。為了進(jìn)一步探索褪黑素對(duì)毛囊干細(xì)胞的影響以及相關(guān)機(jī)制，本研究探討褪黑素是否能夠通過(guò)激活典型的Wnt/β-catenin通路促進(jìn)毛囊干細(xì)胞的增殖與遷移，從而進(jìn)一步明確毛囊干細(xì)胞的有效調(diào)控物質(zhì)和相關(guān)信號(hào)通路。

1 材料與方法

1.1材料 細(xì)胞：來(lái)自內(nèi)蒙古自治區(qū)生物制造重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室分離純化的內(nèi)蒙古絨山羊毛囊干細(xì)胞所建立的P3代絨山羊毛囊干細(xì)胞系。試劑：高糖DMEM培養(yǎng)基、10 %胎牛血清、胰蛋白酶購(gòu)于美國(guó)Gibco公司，褪黑素購(gòu)于美國(guó)Sigma公司，IWR-1(Wnt/β-catenin信號(hào)通路抑制劑)購(gòu)于美國(guó)MedChemExpresss公司，CCK8實(shí)驗(yàn)試劑盒購(gòu)于上海生工有限公司，Transwell細(xì)胞遷移實(shí)驗(yàn)試劑盒購(gòu)于美國(guó)eBscience公司，Western-blot試劑盒購(gòu)于美國(guó)Sigma公司，β-連環(huán)蛋白(β-catenin)、淋巴細(xì)胞增強(qiáng)結(jié)合因子1(Lymphoid Enhancer-binding Factor-1，LEF-1)蛋白一抗購(gòu)于美國(guó)Santa Cruz Biotechnology公司。儀器：超凈工作臺(tái)(HEAR GU ARD ECO，蘇州凈化設(shè)備廠)；蛋白電泳儀、轉(zhuǎn)膜儀購(gòu)于BIO-RAD公司；紫外分光光度計(jì)購(gòu)于上海儀天科學(xué)儀器有限公司。

1.2細(xì)胞培養(yǎng)及分組 將P3代內(nèi)蒙古絨山羊毛囊干細(xì)胞置于37 ℃、5 %CO2細(xì)胞培養(yǎng)箱中，當(dāng)細(xì)胞生長(zhǎng)到60 %～70 %匯合時(shí)，應(yīng)用0.25 %胰蛋白酶將細(xì)胞消化為單細(xì)胞懸液，加入24孔板中，每孔1×104個(gè)細(xì)胞接種。置于37 ℃、5 %CO2細(xì)胞培養(yǎng)箱中培養(yǎng)，當(dāng)細(xì)胞生長(zhǎng)貼壁后進(jìn)行分組。

分為空白對(duì)照組、褪黑素干預(yù)A組、褪黑素干預(yù)B組、褪黑素干預(yù)C組、IWR-1組、褪黑素+IWR-1組?？瞻讓?duì)照組未作處理，其余各組分別加入100 pg/mL褪黑素(20 μL)、300 pg/mL褪黑素(20 μL)、500 pg/mL褪黑素(20 μL)、IWR-1(20 μL)、300 pg/mL褪黑素(10 μL)與IWR-1的混合物(10 μL)，室溫處理1 h。

1.3細(xì)胞計(jì)數(shù)試劑盒(cell counting kit-8，CCK8)實(shí)驗(yàn) 利用CCK8實(shí)驗(yàn)檢測(cè)褪黑素對(duì)內(nèi)蒙古絨山羊毛囊干細(xì)胞增殖活性的影響。收集各組對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期內(nèi)蒙古絨山羊毛囊干細(xì)胞，將1×104個(gè)細(xì)胞接種于96孔板中，分別于接種后24 h向各孔中加入CCK-8溶液，37℃培養(yǎng)24 h，振蕩混勻，酶標(biāo)儀上讀取450 nm波長(zhǎng)處吸光光度值(OD)。根據(jù)以下公式計(jì)算細(xì)胞活力值。實(shí)驗(yàn)重復(fù)3次。

細(xì)胞活力(%)=[A(處理組)-A(空白組)]/[A(未處理組)-A(空白組)]×100 %。處理組加入細(xì)胞、實(shí)驗(yàn)試劑和干預(yù)藥物；空白組僅加入實(shí)驗(yàn)試劑；未處理組加入細(xì)胞和實(shí)驗(yàn)試劑。

1.4Transwell細(xì)胞遷移實(shí)驗(yàn) 利用Transwell細(xì)胞遷移實(shí)驗(yàn)檢測(cè)褪黑素對(duì)內(nèi)蒙古絨山羊毛囊干細(xì)胞遷移的影響。收集各組對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期內(nèi)蒙古絨山羊毛囊干細(xì)胞，調(diào)整細(xì)胞濃度為1.5×108/L，將各組150 μL細(xì)胞懸液接種于Transwell小室，37℃、5 %CO2細(xì)胞培養(yǎng)箱中培養(yǎng)20 h；后經(jīng)多聚甲醛固定、磷酸鹽緩沖液清洗、顯微鏡觀察進(jìn)行細(xì)胞計(jì)數(shù)。實(shí)驗(yàn)重復(fù)3次。

1.5Western-blot檢測(cè)LEF-1、β-catenin蛋白表達(dá) 各組細(xì)胞使用含有PMSF的RIPA裂解液進(jìn)行裂解，離心(12 000 r/min，15 min)后取上清液，經(jīng)Western Blot法檢測(cè)各組LEF-1、β-catenin蛋白表達(dá)量。應(yīng)用Gel-ProAnalyzer成像系統(tǒng)進(jìn)行灰度值分析。實(shí)驗(yàn)重復(fù)3次。

2 結(jié)果

2.1褪黑素對(duì)內(nèi)蒙古絨山羊毛囊干細(xì)胞增殖活性的影響 褪黑素干預(yù)各組的細(xì)胞活力值均顯著高于空白對(duì)照組(P<0.05)。伴隨褪黑素濃度的增加，細(xì)胞活力值有顯著升高趨勢(shì)。經(jīng)統(tǒng)計(jì)，褪黑素干預(yù)B組、C組的細(xì)胞活力值顯著高于褪黑素干預(yù)A組(P<0.05)；褪黑素干預(yù)C組的細(xì)胞活力值顯著高于褪黑素干預(yù)B組(P<0.05)。見(jiàn)表1。

表1 CCK8細(xì)胞增殖實(shí)驗(yàn)獲取的細(xì)胞活力值

2.2褪黑素對(duì)內(nèi)蒙古絨山羊毛囊干細(xì)胞遷移的影響 褪黑素干預(yù)各組的遷移細(xì)胞數(shù)目均顯著高于空白對(duì)照組(P<0.05)。伴隨褪黑素濃度的增加，遷移細(xì)胞數(shù)目有顯著增加的趨勢(shì)。經(jīng)統(tǒng)計(jì)，褪黑素干預(yù)B組、C組的遷移細(xì)胞數(shù)目顯著高于褪黑素干預(yù)A組(P<0.05)；褪黑素干預(yù)C組的遷移細(xì)胞數(shù)目與褪黑素干預(yù)B組比較差異無(wú)明顯統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)。見(jiàn)表2。

表2 Transwell細(xì)胞遷移實(shí)驗(yàn)

2.3Wnt/β-catenin信號(hào)通路對(duì)內(nèi)蒙古絨山羊毛囊干細(xì)胞增殖及遷移的影響 褪黑素干預(yù)組的細(xì)胞活力值、遷移細(xì)胞數(shù)目均顯著高于空白對(duì)照組(P<0.05)。IWR-1組的細(xì)胞活力值、遷移細(xì)胞數(shù)目均顯著低于褪黑素干預(yù)組(P<0.05)。褪黑素+IWR-1組的細(xì)胞活力值、遷移細(xì)胞數(shù)目均顯著高于IWR-1組(P<0.05)。見(jiàn)表3、4。

表3 Wnt/β-catenin信號(hào)通路對(duì)內(nèi)蒙古絨山羊毛囊干細(xì)胞增殖的影響

2.4Western-blot檢測(cè)各組Wnt/β-catenin信號(hào)通路的活性 結(jié)果顯示，褪黑素干預(yù)組的β-catenin蛋白、LEF-1蛋白的相對(duì)表達(dá)量明顯高于空白對(duì)照組(P<0.05)。IWR-1組的β-catenin蛋白、LEF-1蛋白的相對(duì)表達(dá)量顯著低于褪黑素干預(yù)組(P<0.05)。褪黑素+IWR-1組的β-catenin蛋白、LEF-1蛋白的相對(duì)表達(dá)量顯著高于IWR-1組(P<0.05)。見(jiàn)表5、圖1和表6、圖2。

圖2 Western-blot檢測(cè)各組LEF-1蛋白表達(dá)

表4 Wnt/β-catenin信號(hào)通路對(duì)內(nèi)蒙古絨山羊毛囊干細(xì)胞遷移的影響

表5 Western-blot檢測(cè)各組β-catenin蛋白相對(duì)表達(dá)量

表6 Western-blot檢測(cè)各組LEF-1蛋白相對(duì)表達(dá)量

圖1 Western-blot檢測(cè)各組β-catenin蛋白表達(dá)

3 討論

毛囊干細(xì)胞是具有自我更新能力和多向分化潛能的毛囊細(xì)胞，是毛囊組織中的原始性細(xì)胞，體外克隆形成的能力較強(qiáng)[4]。一直以來(lái)，毛囊干細(xì)胞的表面標(biāo)志物、受調(diào)控的信號(hào)通路、影響生長(zhǎng)調(diào)控的激素及路徑等為該領(lǐng)域研究的熱點(diǎn)[5]。Wnt/β-catenin信號(hào)傳導(dǎo)通路是最早被發(fā)現(xiàn)和研究、參與到各類干細(xì)胞調(diào)控中的信號(hào)通路，其在維持干細(xì)胞的生長(zhǎng)中發(fā)揮重要作用[6]。在干細(xì)胞增殖分化的過(guò)程中，Wnt/β-catenin通路中的Wnt蛋白能夠阻止β-catenin的水解過(guò)程，因此細(xì)胞質(zhì)中的β-catenin將達(dá)到一定的濃度，并轉(zhuǎn)移至細(xì)胞核中，進(jìn)一步與細(xì)胞核中的轉(zhuǎn)錄因子形成復(fù)合物，通過(guò)轉(zhuǎn)錄效應(yīng)激活下游靶基因[7]。在高水平β-catenin蛋白的作用下，毛囊干細(xì)胞活化后分化為毛發(fā)[2]。淋巴樣增強(qiáng)因子(LEF)在Wnt/β-catenin通路中能夠與T細(xì)胞轉(zhuǎn)錄因子結(jié)合形成轉(zhuǎn)錄復(fù)合體，對(duì)相應(yīng)基因的轉(zhuǎn)錄發(fā)揮調(diào)控作用[8]。

直至1993年，褪黑素在抗氧化、延緩衰老、優(yōu)化睡眠方面的生物學(xué)作用才引起科學(xué)界的重視[9]。目前，褪黑素及其衍生物在人體生理學(xué)、藥理學(xué)和臨床醫(yī)學(xué)領(lǐng)域中的研究為醫(yī)學(xué)界的前沿課題[10]。有研究報(bào)道，褪黑素能夠激活Wnt/β-catenin通路，促進(jìn)周圍神經(jīng)損傷的修復(fù)機(jī)制，發(fā)揮延緩神經(jīng)系統(tǒng)衰老的作用[11]。也有研究報(bào)道，Wnt/β-catenin通路對(duì)毛囊干細(xì)胞的增殖與分化發(fā)揮明顯的調(diào)控作用[12]。

本研究結(jié)果顯示，在一定濃度的褪黑素干預(yù)下，內(nèi)蒙古絨山羊毛囊干細(xì)胞的增殖活性和遷移能力顯著增加。當(dāng)褪黑素的濃度為300～500 pg/mL時(shí)，內(nèi)蒙古絨山羊毛囊干細(xì)胞增殖活性最高，細(xì)胞發(fā)生遷移的數(shù)量最多。說(shuō)明褪黑素能夠刺激體外培養(yǎng)的毛囊干細(xì)胞的增殖，而細(xì)胞的遷移能力也在客觀上反映了細(xì)胞的增殖狀態(tài)，但其對(duì)毛囊干細(xì)胞的具體作用機(jī)制尚不完全清楚。為了進(jìn)一步探索褪黑素對(duì)毛囊干細(xì)胞的具體作用機(jī)制，本研究進(jìn)一步增設(shè)了IWR-1組、褪黑素+IWR-1組，觀察在Wnt/β-catenin被阻斷后的情況下，內(nèi)蒙古絨山羊毛囊干細(xì)胞的增殖及遷移情況。IWR-1為Wnt/β-catenin信號(hào)通路的抑制劑，經(jīng)IWR-1干預(yù)后，毛囊干細(xì)胞的增殖及遷移情況明顯受到抑制。而在褪黑素與IWR-1同時(shí)作用于內(nèi)蒙古絨山羊毛囊干細(xì)胞的情況下，細(xì)胞的活力值及遷移細(xì)胞數(shù)目明顯高于IWR-1單純干預(yù)組。以上結(jié)果證實(shí)了Wnt/β-catenin信號(hào)在內(nèi)蒙古絨山羊毛囊干細(xì)胞的增殖與分化中的必要性，也證實(shí)了一定濃度的褪黑素對(duì)內(nèi)蒙古絨山羊毛囊干細(xì)胞的增殖活性和遷移能力的促進(jìn)作用，但尚不能說(shuō)明褪黑素是否通過(guò)激活Wnt/β-catenin信號(hào)通路來(lái)發(fā)揮以上作用。后續(xù)的Western-blot檢測(cè)結(jié)果發(fā)現(xiàn)，在褪黑素的干預(yù)下，Wnt/β-catenin信號(hào)通路激活狀態(tài)標(biāo)志物(β-catenin蛋白、LEF-1蛋白)的表達(dá)量顯著高于空白對(duì)照組，證明了褪黑素干預(yù)有效激活Wnt/β-catenin信號(hào)通路的情況。隨后的研究中，IWR-1的干預(yù)明顯降低了毛囊干細(xì)胞中β-catenin蛋白、LEF-1蛋白的相對(duì)表達(dá)量，說(shuō)明Wnt/β-catenin信號(hào)被阻斷后相應(yīng)的激活蛋白標(biāo)志物的水平也明顯減低。然而，當(dāng)一定濃度的褪黑素及IWR-1同時(shí)作用于毛囊干細(xì)胞時(shí)，β-catenin蛋白、LEF-1蛋白的相對(duì)表達(dá)量有所增加，更進(jìn)一步證實(shí)了褪黑素能夠通過(guò)激活Wnt/β-catenin信號(hào)通路促進(jìn)毛囊干細(xì)胞增殖及遷移的生物學(xué)活性。

本研究通過(guò)體外實(shí)驗(yàn)進(jìn)一步闡明了一定濃度的褪黑素可能通過(guò)激活Wnt/β-catenin信號(hào)通路來(lái)促進(jìn)內(nèi)蒙古絨山羊毛囊干細(xì)胞生物學(xué)活性的相關(guān)作用，豐富了臨床關(guān)于褪黑素的生理學(xué)、藥理學(xué)機(jī)制研究的理論基礎(chǔ)，在后續(xù)的研究中尚需要進(jìn)一步闡明其他信號(hào)通路在褪黑素調(diào)控內(nèi)蒙古絨山羊毛囊干細(xì)胞生物學(xué)活性中的作用及相關(guān)機(jī)制。