TNF-α對(duì)足細(xì)胞損傷的影響

苑佳奇，沈曉丹，張志鳳，丁海麥，張學(xué)明

(包頭醫(yī)學(xué)院基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)與法醫(yī)學(xué)院，內(nèi)蒙古 包頭 014040)

腎小球結(jié)構(gòu)在腎單位內(nèi)，腎小球過(guò)濾屏障負(fù)責(zé)血液從傳入小動(dòng)脈到鮑曼間隙的選擇性過(guò)濾。過(guò)濾屏障包括3層:腎小球上皮、基底膜和縫隙隔膜。足細(xì)胞維持腎小球過(guò)濾屏障，足細(xì)胞足突附著在腎小球基底膜(glomerular basement membrane,GBM)的腎小球毛細(xì)血管上，形成細(xì)胞間連接，在相鄰足突之間的界面上呈階梯狀結(jié)構(gòu)，形成縫隙隔膜過(guò)濾屏障，幫助維持正常的腎功能?？p隙隔膜是阻止蛋白質(zhì)進(jìn)入尿液濾液的最后一道屏障[1]。足細(xì)胞由細(xì)胞體、主要突起和足突組成的復(fù)雜細(xì)胞組織，足突有三個(gè)膜結(jié)構(gòu)域，分別是頂端膜結(jié)構(gòu)域(apical membrane domain,AMD)，基膜結(jié)構(gòu)域(basement membrane domain,BMD)和裂孔隔膜(slit diaphragm,SD)。這三個(gè)結(jié)構(gòu)域都與細(xì)胞骨架相互連接。足突中含有高度有序的、平行的、可收縮的肌動(dòng)蛋白纖維束，細(xì)胞骨架及肌動(dòng)蛋白纖維束破壞，會(huì)使足細(xì)胞損傷進(jìn)而導(dǎo)致足突抹消、SD選擇性濾過(guò)功能受損，進(jìn)而形成蛋白尿[2]。有研究表明單個(gè)足細(xì)胞分子異常與蛋白尿和腎小球硬化之間存在因果關(guān)系[3]。足細(xì)胞應(yīng)激細(xì)胞通常在健康狀態(tài)下保持體內(nèi)平衡，當(dāng)遇到生理壓力或病理刺激時(shí)，它們適應(yīng)于保持功能，但當(dāng)壓力超過(guò)其補(bǔ)償能力時(shí)，可能會(huì)受到損傷。受損的足細(xì)胞會(huì)消失，從而失去結(jié)構(gòu)并擴(kuò)散，導(dǎo)致過(guò)濾屏障功能降低。蛋白尿是足細(xì)胞受損的早期結(jié)果，也是腎臟疾病的早期癥狀。足細(xì)胞損傷可引起微小病變性腎病和局灶節(jié)段性腎小球腎病。隨著對(duì)足細(xì)胞生物學(xué)研究的深入，尤其是在發(fā)現(xiàn)足細(xì)胞表達(dá)的一些特異性蛋白分子之后，足細(xì)胞已被認(rèn)為是參與各種原發(fā)性或繼發(fā)性腎小球疾病進(jìn)展的關(guān)鍵細(xì)胞。因此足細(xì)胞在腎臟疾病中具有關(guān)鍵作用。

腫瘤壞死因子α(Tumor necrosis factor alpha，TNF-α)由157個(gè)氨基酸組成，屬于TNF超蛋白家族。它是一種涉及系統(tǒng)性炎癥的細(xì)胞因子，主要由巨噬細(xì)胞直接分泌，其主要功能是調(diào)節(jié)免疫細(xì)胞，引起細(xì)胞凋亡、炎癥和自身免疫[4]。通過(guò)TNF-α建立足細(xì)胞損傷模型有利于進(jìn)一步研究足細(xì)胞損傷所引起疾病的分子機(jī)制，為疾病的診斷和治療提供新的方向。

1 對(duì)象與方法

1.1材料 來(lái)源于南京醫(yī)科大學(xué)的MPC5小鼠腎足細(xì)胞；TNF-α購(gòu)自abcam公司；RIPA裂解液(強(qiáng))、PMSF(100 Mm)、BCΑ蛋白濃度測(cè)定試劑盒、極超敏ECL化學(xué)發(fā)光試劑盒、一抗二抗去除液﹑SDS-PAGE蛋白上樣緩沖液(5×)、彩色預(yù)染Marker、TEMED購(gòu)自于上海碧云天生物技術(shù)有限公司；Tween-20﹑TritonX-100購(gòu)自美國(guó)Amresco公司；0.45 μm PVDF膜購(gòu)自美國(guó)Immobilon?-P公司；Synaptopodin兔多克隆抗體﹑RhoA兔多克隆抗體﹑14-3-3β兔多克隆抗體﹑HRP標(biāo)記山羊抗兔IgG﹑HRP標(biāo)記Tubulin小鼠單克隆抗體購(gòu)自abcam(英國(guó))生物技術(shù)公司；羅丹明標(biāo)記的TRITC鬼筆環(huán)肽熒光染色劑購(gòu)自上海翊圣生物科技有限公司。

1.2方法

1.2.1模型制備 在33 ℃、5 % CO2條件下將75 cm2培養(yǎng)瓶中的足細(xì)胞培養(yǎng)至80 %～90 %時(shí)進(jìn)行傳代，將增殖過(guò)程中生長(zhǎng)狀態(tài)良好匯合度達(dá)到80 %的足細(xì)胞進(jìn)行分化培養(yǎng)。分化細(xì)胞在37 ℃，5 % CO2條件下培養(yǎng)6.5 d后，將培養(yǎng)基全部吸出，用PBS清洗兩次，加入3 mL無(wú)血清的1640培養(yǎng)基培養(yǎng)4 h后，再加1 %的FBS 3μL，并依次加入6個(gè)不同體積的濃度為10ng/μL TNF-α使終濃度為0、5、10、20、30、40 ng/mL，37 ℃繼續(xù)培養(yǎng)24 h后，收集細(xì)胞，提取蛋白用于Western Blot。分別給予相同濃度的TNF-α 10 ng/mL和20 ng/mL作用時(shí)間分別為6、12、24、36、48 h，分別收集細(xì)胞，提取蛋白用于Western Blot。

1.2.2形態(tài)學(xué)檢測(cè) 將爬片放置于12孔板，每孔接入1×104數(shù)量的足細(xì)胞培養(yǎng)6.5 d后，更換培養(yǎng)基，每孔按TNF-α濃度為0、5、10、20、30、40 ng/mL培養(yǎng)24 h(將這6組設(shè)置為A、B、C、D、E、F組，其中A組為對(duì)照組)，爬片取出后用 4 % 的甲醛溶液固定，通過(guò) 0.5 % Triton X-100溶液的透化處理，然后將羅丹明標(biāo)記的鬼筆環(huán)肽與足細(xì)胞進(jìn)行免疫熒光染色，最后通過(guò)共聚焦顯微鏡觀察足細(xì)胞骨架結(jié)構(gòu)。

1.2.3Western印跡 樣品處理每個(gè)60 mm培養(yǎng)皿加入100 μL含有PMSF的 RIPA裂解液，超聲裂解提取總蛋白溶液。使用BCA蛋白濃度測(cè)定試劑盒測(cè)定總蛋白濃度，用含有 PMSF 的 RIPA 裂解液稀釋各樣品濃度相同，SDS-PAGA上樣緩沖液(5×)制備上樣蛋白，煮沸5min使蛋白變性，-20 ℃保存。用10 %分離膠，5 %濃縮膠進(jìn)行垂直電泳后轉(zhuǎn)膜，5 %脫脂牛奶封閉1h,孵育一抗HRP標(biāo)記的Tubulin(1∶2000)、Synaptopodin(1∶500)、RhoA(1∶1000)、14-3-3β(1∶1000)4 ℃過(guò)夜(12～18 h)，TBST洗膜三次，10 min/次。孵育HRP標(biāo)記的山羊抗兔二抗(1∶2000)室溫2 h，TBST洗膜三次，10 min/次。用Western blot方法檢測(cè)蛋白表達(dá)，將膜置于天能凝膠成像儀上進(jìn)行化學(xué)發(fā)光影像采集，Image J軟件進(jìn)行目的蛋白相對(duì)定量分析及統(tǒng)計(jì)。

1.3統(tǒng)計(jì)學(xué)分析 Western blot結(jié)果使用Image J、SPSS 17.0統(tǒng)計(jì)軟件進(jìn)行灰度值分析，對(duì)目的蛋白進(jìn)行相對(duì)定量(相對(duì)蛋白表達(dá)量=灰度值目的蛋白/灰度值內(nèi)參)分析并統(tǒng)計(jì)，以P<0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1足細(xì)胞鬼筆環(huán)肽免疫熒光染色 利用鬼筆環(huán)肽免疫熒光染色檢測(cè)細(xì)胞骨架變化(圖1A～F)，圖1A和圖1B顯示足細(xì)胞肌動(dòng)蛋白絲(F-actin)經(jīng)羅丹明標(biāo)記的TRITC-phalldidin染色后，F(xiàn)-actin 被染成紅色并均勻分布于細(xì)胞內(nèi)，而圖 C-F 經(jīng)羅丹明標(biāo)記的 TRITC-phalldidin 染色后肌動(dòng)蛋白應(yīng)力纖維減少，細(xì)胞邊緣染色程度較細(xì)胞中央強(qiáng)，且細(xì)胞骨架排列失調(diào)，經(jīng)圖1A與圖1B～F比較分析表明，足細(xì)胞分化培養(yǎng)中，TNF-α 濃度達(dá)到10 ng/mL 后，就可以誘導(dǎo)足細(xì)胞骨架損傷。

圖1 足細(xì)胞鬼筆環(huán)肽熒光染色(原始放大倍數(shù)1000×，A～F)

2.2Western印跡結(jié)果 不同濃度 TNF-α 誘導(dǎo)足細(xì)胞24 h 體外培養(yǎng)的足細(xì)胞，分化培養(yǎng)6.5 d后，添加TNF-α 0、5、10、20、30、40 ng/mL誘導(dǎo)損傷培養(yǎng)24 h，采用Western Blot從蛋白表達(dá)水平檢測(cè)足細(xì)胞中Synaptopodin、RhoA及14-3-3β的表達(dá)變化(圖2)。隨著培養(yǎng)液中TNF-α濃度的增加與正常對(duì)照組比較，Synaptopodin、RhoA及14-3-3β表達(dá)水平以α-Tubulin為內(nèi)參得到的各組相對(duì)表達(dá)量從TNF-α 濃度為10.00 ng/mL起逐漸降低，且差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(n=3, *P<0.05)。該結(jié)果也表明：TNF-α濃度為10 ng/mL足細(xì)胞發(fā)生損傷，隨著TNF-α濃度的升高，足細(xì)胞中Synaptopodin、RhoA及14-3-3β的表達(dá)水平均顯著降低，表明足細(xì)胞損傷模型建立成功。

2.3TNF-α 濃度為10 ng/mL 誘導(dǎo)足細(xì)胞不同時(shí)間 體外培養(yǎng)的足細(xì)胞，分化培養(yǎng)6.5 d后，添加 TNF-α 濃度為10 ng/mL誘導(dǎo)損傷培養(yǎng)6、12、24、36、48h，采用Western Blot從蛋白表達(dá)水平檢測(cè)足細(xì)胞中Synaptopodin、RhoA及14-3-3β的表達(dá)變化(圖2)。細(xì)胞培養(yǎng)液中TNF-α濃度為10 ng/mL，隨著細(xì)胞損傷培養(yǎng)的時(shí)間越長(zhǎng)，Synaptopodin、RhoA及14-3-3β表達(dá)水平以α-Tubulin為內(nèi)參得到的各組相對(duì)表達(dá)量均下降，且差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(n=3, *P<0.05)。該結(jié)果也表明：TNF-α 濃度為10 ng/ml誘導(dǎo)損傷培養(yǎng)細(xì)胞時(shí)間越長(zhǎng)，足細(xì)胞中Synaptopodin、RhoA及14-3-3β的表達(dá)水平降低越明顯，表明足細(xì)胞損傷模型建立成功。

圖2 腎足細(xì)胞中各組synaptopodin、14-3-3β、RhoA蛋白表達(dá)

2.4TNF-α 濃度為20 ng/mL 誘導(dǎo)足細(xì)胞不同時(shí)間 體外培養(yǎng)的足細(xì)胞，分化培養(yǎng)6.5 d后，添加 TNF-α 濃度為20 ng/mL誘導(dǎo)損傷培養(yǎng)6、12、24、36、48 h，采用Western Blot從蛋白表達(dá)水平檢測(cè)足細(xì)胞中Synaptopodin、RhoA及14-3-3β的表達(dá)變化(圖3)。細(xì)胞培養(yǎng)液中TNF-α濃度20 ng/mL，隨著細(xì)胞損傷培養(yǎng)的時(shí)間越長(zhǎng)，Synaptopodin、RhoA及14-3-3β表達(dá)水平以α-Tubulin為內(nèi)參得到的各組相對(duì)表達(dá)量均下降，且差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(n=3, *P<0.05)。該結(jié)果也表明：TNF-α 濃度為20 ng/mL誘導(dǎo)損傷培養(yǎng)細(xì)胞時(shí)間越長(zhǎng)，足細(xì)胞中Synaptopodin、RhoA及14-3-3β的表達(dá)水平降低越明顯，表明足細(xì)胞損傷模型建立成功。

圖3 腎足細(xì)胞中各組synaptopodin、14-3-3β、RhoA蛋白表達(dá)

3 討論

足細(xì)胞是排列在腎小球毛細(xì)血管外表面的終末分化細(xì)胞，受損后不再具有自愈和再生能力，一旦損傷最終將導(dǎo)致細(xì)胞脫落。當(dāng)足細(xì)胞受損，足突出現(xiàn)彌漫性增生或融合以及進(jìn)一步脫落后形成節(jié)段性硬化，最終會(huì)導(dǎo)致局灶節(jié)段性腎小球硬化(focal segmental glomerulosclerosis，F(xiàn)SGS)的形成。FSGS也被稱為足細(xì)胞病[5]，顧名思義造成FSGS的主要原因是足細(xì)胞的損傷，尤其是足突的損傷。FSGS是腎病綜合征(nephrotic syndrome，NS)中最常見的類型之一，NS是腎小球?yàn)V過(guò)屏障功能障礙從而引起血液中的蛋白從尿液中被排出的一系列病理以及生理改變的臨床綜合征[6]。目前全球范圍內(nèi)FSGS患病人數(shù)較其他類型的腎小球疾病呈現(xiàn)上升趨勢(shì)，同時(shí)隨著FSGS的惡化也是進(jìn)一步造成終末期腎臟病(End-Stage Renal Disease，ESRD)的重要原因[7]?？梢詫⒁餏SGS的因素分為兩大類，原發(fā)性誘因和繼發(fā)性誘因，繼發(fā)性又包括適應(yīng)性型、病毒相關(guān)型、遺傳型、藥物誘導(dǎo)型和APOL相關(guān)型[8]，其病因的最大共同點(diǎn)是足細(xì)胞損傷或脫落。足細(xì)胞的獨(dú)特功能是建立和維持腎小球正常的濾過(guò)功能，因此足細(xì)胞損傷以及脫落程度對(duì)FSGS病情的發(fā)展起著尤為重要的作用[9]。

圖4 腎足細(xì)胞中各組synaptopodin、14-3-3β、RhoA蛋白表達(dá)

足細(xì)胞能夠穩(wěn)定存在是依賴于細(xì)胞骨架，與細(xì)胞骨架相關(guān)的蛋白質(zhì)有很多。在TNF-α誘導(dǎo)的足細(xì)胞中磷酸化的Synaptopodin減少，14-3-3β乙?；黾?，導(dǎo)致14-3-3β和Synaptopodin解離[10]。鈣調(diào)神經(jīng)磷酸酶可阻斷Synaptopodin去磷酸化，通過(guò)磷酸化的Synaptopodin 與14-3-3β 相互作用來(lái)保護(hù)Synaptopodin免受組織蛋白酶L的降解[11]。磷酸化的Synaptopodin可以阻止RhoΑ的降解，Synaptopodin的基因沉默抑制了肌動(dòng)蛋白應(yīng)力纖維的形成[12]，細(xì)胞骨架穩(wěn)定依賴于肌動(dòng)蛋白應(yīng)力纖維。由此可以通過(guò)14-3-3β、Synaptopodin和RhoA 的表達(dá)明顯降低證明足細(xì)胞損傷模型建立成功。

文獻(xiàn)報(bào)道阿霉素也可用于建立足細(xì)胞損傷模型。阿霉素是一種抗腫瘤抗生素，屬于一種周期非特異性抗癌化療藥物，具有較強(qiáng)的毒性作用[13]。有研究表明[14]，對(duì)小鼠靜脈給藥后以腎臟毒性最為明顯，伴隨肝臟毒性、心臟毒性以及生殖毒性等。阿霉素通過(guò)誘發(fā)腎小球細(xì)胞凋亡、誘導(dǎo)氧化應(yīng)激反應(yīng)、促進(jìn)細(xì)胞因子的釋放、抑制腎小球足細(xì)胞周期等，損害腎小球毛細(xì)血管袢，造成腎損傷。

本研究結(jié)果表明，TNF-α可誘導(dǎo)足細(xì)胞的損傷，并且足細(xì)胞的損傷程度與TNF-α的作用時(shí)間和作用濃度呈正比，即在TNF-α為10 ng/mL和20 ng/mL的作用下，其TNF-α的作用時(shí)間在6 h時(shí)足細(xì)胞已發(fā)生損傷且隨著作用時(shí)間越長(zhǎng)足細(xì)胞損傷越嚴(yán)重；在相同損傷培養(yǎng)時(shí)間24 h下，TNF-α濃度為10 ng/mL時(shí)，足細(xì)胞出現(xiàn)損傷，且隨著濃度增高足細(xì)胞損傷越嚴(yán)重。在本研究中，對(duì)正常足細(xì)胞和TNF-α誘導(dǎo)損傷足細(xì)胞進(jìn)行Western Blot檢測(cè)發(fā)現(xiàn)，14-3-3β、Synaptopodin和RhoA 的表達(dá)明顯降低?？筛鶕?jù)實(shí)驗(yàn)需求，選擇合適的TNF-α作用濃度及作用時(shí)間，為后期研究腎病綜合征的預(yù)防及其治療奠定基礎(chǔ)。