沉默Galectin-3對(duì)人甲狀腺乳頭狀癌細(xì)胞增殖、侵襲能力影響及機(jī)制研究

胡永全，任 麗，郭道華，袁 超，陶新全，李衛(wèi)鵬，劉恒超，申 勇，訾 剛

(1.蚌埠醫(yī)學(xué)院第一附屬醫(yī)院核醫(yī)學(xué)科，安徽 蚌埠 233004；2.蚌埠醫(yī)學(xué)院核醫(yī)學(xué)教研室；3.藥劑科)

甲狀腺癌是常見的頭頸部惡性腫瘤之一，甲狀腺癌是近年來發(fā)病率增長(zhǎng)最快的實(shí)體惡性腫瘤,其中分化型甲狀腺癌占新發(fā)甲狀腺癌的90 %以上[1]。乳頭狀癌是分化型甲狀腺癌中最常見的組織學(xué)類型，目前臨床上常見的治療手段有手術(shù)、131I治療、甲狀腺激素替代治療等，一般預(yù)后較好。盡管大多數(shù)分化型甲狀腺癌患者可以通過手術(shù)治愈，通常隨后進(jìn)行131I治療和促甲狀腺激素抑制，但不能切除的局部復(fù)發(fā)和/或轉(zhuǎn)移性及放射性碘難治性患者的10年生存率低，存活率僅為19 %，治療難度大[2]?，F(xiàn)靶向藥物僅能改善碘難治性分化型甲狀腺癌的無進(jìn)展生存期,不提高總生存期，其有一定不良反應(yīng)，且用藥患者的選擇及適應(yīng)證的把握存在困難；用藥前后患者的評(píng)估、長(zhǎng)期隨訪的評(píng)價(jià)及撤藥原則也缺乏統(tǒng)一標(biāo)準(zhǔn)[3]。以上方法對(duì)部分進(jìn)展期或轉(zhuǎn)移性病灶效果不佳,因此，有必要提高對(duì)乳頭狀甲狀腺癌致癌和發(fā)展的分子機(jī)制的認(rèn)識(shí),提高對(duì)乳頭狀甲狀腺癌的認(rèn)識(shí)可促進(jìn)其基因治療的應(yīng)用，改善患者的預(yù)后[4]。探究發(fā)病機(jī)制尋找治療新靶點(diǎn)對(duì)于提高此類癌癥的治療效果具有更加重要的意義。

半乳糖凝集素-3(Galectin-3)是凝集素家族中重要一員，參與多種細(xì)胞的生長(zhǎng)、凋亡、周期調(diào)控、損傷、修復(fù)等過程，并且在多種腫瘤組織中均有表達(dá)，與腫瘤組織的惡性程度、腫瘤細(xì)胞的浸潤(rùn)、轉(zhuǎn)移密切相關(guān)[5]。本研究采用沉默人甲狀腺乳頭狀癌細(xì)胞(Human papillary thyroid carcinoma cells，B-CPAP)的Galectin-3表達(dá)，初步探討Galectin-3在B-CPAP增殖、侵襲中的作用。

1 材料與方法

1.1細(xì)胞與試劑 B-CPAP細(xì)胞株購買于上海拜力生物公司，RPMI-1640培養(yǎng)基購于Gibco北京生物有限公司公司，10 %胎牛血清購于杭州四季青生物工程材料有限公司，小干擾RNA(si-NCAPG)購于上海吉瑪公司，Lipofectamine TM2000試劑盒、MTT試劑盒購于TAKARA大連有限公司；Western blot使用抗體：半乳糖凝集素-3(Galectin-3)、B淋巴細(xì)胞瘤-2(B-cell lymphoma-2, Bcl-2)、凋亡抑制基因(Survivin)、基質(zhì)金屬蛋白酶-9(Matrix metallopeptidase 9,MMP-9)及內(nèi)參基因(β-actin)單克隆抗體購于Sigma公司，合肥志宏生物技術(shù)有限公司銷售。

1.2Galectin-3 siRNA轉(zhuǎn)染B-CPAP及轉(zhuǎn)染后細(xì)胞中Galectin-3的表達(dá) 實(shí)驗(yàn)細(xì)胞為對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期細(xì)胞，在轉(zhuǎn)染前1 d將細(xì)胞濃度調(diào)整至1×106個(gè)/孔濃度，接種于6孔板中每孔2 mL,當(dāng)細(xì)胞融合度達(dá)到50 %左右時(shí)按照Lipofection TM 2000試劑盒說明書對(duì)空白對(duì)照組(Control,僅加入脂質(zhì)體)、NC-siRNA組(非特異性siRNA，不具有任何干擾作用)、Galectin-3-siRNA1組、Galectin-3-siRNA2組的B-CPAP進(jìn)行轉(zhuǎn)染。轉(zhuǎn)染并進(jìn)行培養(yǎng)48 h后，收集細(xì)胞并檢測(cè)各組Galectin-3表達(dá)情況，實(shí)驗(yàn)重復(fù)3次。

1.3噻唑藍(lán)[3-(4,5-Dimethylthiazol-2-yl)-2,5-Diphenyltetrazolium Bromide,MTT]法監(jiān)測(cè)Galectin-3-siRNA轉(zhuǎn)染后B-CPAP增殖情況 將對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期細(xì)胞接種于96孔板中，每組細(xì)胞設(shè)置3個(gè)復(fù)孔，放置培養(yǎng)箱中培養(yǎng)24 h,換液后繼續(xù)培養(yǎng)48 h,每孔加入MTT液20 μL繼續(xù)放入培養(yǎng)箱中，4 h后取出，棄去上清并每孔加入150 μL DMOS，待細(xì)胞完全裂解后，用酶標(biāo)儀于490 nm檢測(cè)每孔的吸光度值，重復(fù)實(shí)驗(yàn)3次，取平均值。細(xì)胞抑制率(%)=(對(duì)照組吸光度值-實(shí)驗(yàn)組吸光度值)/對(duì)照組吸光度值×100 %。

1.4Transwell小室測(cè)各組細(xì)胞侵襲率 按文獻(xiàn)[6]的方式，取Transwell小室，4 ℃預(yù)冷，PBS緩沖液(1∶8配置Matrigel膠液)，將100 μL膠液從小室內(nèi)緩慢注入完成輔膠，37 ℃放置30 min備用。向24孔板中注入含有10 %胎牛血清的培養(yǎng)液600 μL/孔，將小室置入24孔板中同時(shí)向小室中加入100 μL細(xì)胞混懸液，低氧下繼續(xù)培養(yǎng)48 h,除去未穿膜細(xì)胞、固定、染色。鏡下隨機(jī)讀取10個(gè)視野，計(jì)算膜背側(cè)的穿膜數(shù)(侵襲率 = 低氧組穿膜細(xì)胞數(shù)/常氧組穿膜細(xì)胞數(shù) × 100 %)。

1.5Galectin-3-siRNA轉(zhuǎn)染后檢測(cè)B-CPAP中相關(guān)蛋白表達(dá)情況 取對(duì)數(shù)期生長(zhǎng)細(xì)胞接種至96孔板中，每孔200 μL，置入培養(yǎng)箱中24 h,按Lipofection TM 2000試劑盒說明書分組轉(zhuǎn)染，收集轉(zhuǎn)染后48 h的細(xì)胞(包括加入脂質(zhì)體的空白對(duì)照組)，利用蛋白裂解液將各組細(xì)胞裂解，并分組提取蛋白，電泳、轉(zhuǎn)膜、一抗(Survivin、Bcl-2、MMP-9均按1∶500稀釋)4 ℃過夜、TBST清洗5次，二抗(辣根過氧化物酶HRP標(biāo)記)37 ℃孵育2 h, 后按Western blot 步驟測(cè)化學(xué)發(fā)光顯影，凝膠成像，通過掃描儀采集條帶，計(jì)算灰度值，獨(dú)立重復(fù)實(shí)驗(yàn)3次。

1.6統(tǒng)計(jì) 采用SPSS 22.0統(tǒng)計(jì)軟件進(jìn)行分析，多組比較采用單因素方差分析，組間比較采用LSD-t檢驗(yàn)，以P<0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1沉默B-CPAP中Galectin-3后，B-CPAP中Galectin-3表達(dá)水平 通過Western blot檢測(cè)后Galectin-3-siRNA1及Galectin-3-siRNA2均可以降低細(xì)胞中Galectin-3表達(dá)，其中以Galectin-3-siRNA1的效果稍佳，實(shí)驗(yàn)組及陰性對(duì)照組對(duì)Galectin-3蛋白表達(dá)無影響，見圖1。

圖1 Western blot檢測(cè)Galectin-3-siRNA后甲狀腺癌細(xì)胞Galectin-3表達(dá)變化

2.2MTT測(cè)沉默B-CPAP中Galectin-3后各組細(xì)胞增殖情況 經(jīng)siRNA Galectin-3后，與空白組及NC-siRNA相比，Galectin-3-siRNA1、Galectin-3-siRNA2這兩組細(xì)胞增殖率顯著降低，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05),見圖2。

圖2 4組細(xì)胞增殖率比較

2.3Transwell小室測(cè)沉默B-CPAP中Galectin-3后各組細(xì)胞侵襲能力 結(jié)果如圖3所示，與對(duì)照組及陰性組相比Galectin-3-siRNA1及Galectin-3-siRNA2組細(xì)胞侵襲能力顯著下降，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。

圖3 Galectin-3-siRNA對(duì)B-CPAP侵襲能力影響

2.4沉默B-CPAP中Galectin-3后對(duì)Bcl-2、Survivin及MMP-9蛋白表達(dá)影響 結(jié)果發(fā)現(xiàn)，沉默Galectin-3后凋亡抑制蛋白Bcl-2、Survivin表達(dá)明顯降低，與空白對(duì)照組及陰性組相比差異顯著，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)，同時(shí)結(jié)果也顯示MMP-9蛋白表達(dá)明顯降低，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)，見圖4、5。

圖4 各組Survivin及Bcl-2蛋白表達(dá)

3 討論

Galectin-3廣泛分布腫瘤細(xì)胞內(nèi)，參與細(xì)胞免疫調(diào)節(jié)及腫瘤增殖、侵襲等過程[5，7]。國(guó)內(nèi)研究[8-9]發(fā)現(xiàn)，Galectin-3在多種腫瘤細(xì)胞中表達(dá)較為顯著且在腫瘤細(xì)胞發(fā)展、轉(zhuǎn)移過程中充當(dāng)了重要的角色。有研究[10]顯示，Galectin-3通過半乳糖苷結(jié)合功能調(diào)節(jié)細(xì)胞生長(zhǎng)，與乳頭狀甲狀腺癌的發(fā)生和轉(zhuǎn)移有關(guān)。Shetty等[11]證實(shí)，使用RNA干擾Galectin-3表達(dá)后乳腺癌細(xì)胞的增殖、侵襲能力均下降，使得癌細(xì)胞凋亡增加。有研究[12]發(fā)現(xiàn)減少Galectin-3可以抑制卵巢癌增殖、遷移和侵襲，過度表達(dá)Galectin-3則產(chǎn)生相反作用，該研究提示Galectin-3可能成為癌癥治療的新靶點(diǎn)。鑒于Galectin-3在腫瘤發(fā)生和癌癥進(jìn)展中的作用，其可作為甲狀腺癌治療潛在的靶點(diǎn)[5、13]。本研究通過探究沉默Galectin-3對(duì)B-CPAP的增殖、侵襲能力的影響，結(jié)果顯示在B-CPAP中使用siRNA干擾Galectin-3表達(dá)后，B-CPAP增殖、侵襲能力明顯下降(P<0.05)，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，證實(shí)通過有效降低Galectin-3表達(dá)可以遏制B-CPAP增殖、侵襲能力，與研究結(jié)果相一致[11-12]。其也提示Galectin-3可作為甲狀腺癌治療潛在的靶點(diǎn)。

圖5 各組MMP-9蛋白表達(dá)

Survivin屬于凋亡抑制蛋白，能夠維持細(xì)胞活性，抑制細(xì)胞凋亡,在腫瘤細(xì)胞的發(fā)生、發(fā)展過程中發(fā)揮重要的作用[14]。Survivin在甲狀腺癌組織和細(xì)胞中均呈高表達(dá)，提示Survivin在甲狀腺癌細(xì)胞的凋亡過程中發(fā)揮著重要作用，沉默Survivin表達(dá)可通過下調(diào)Bcl-2蛋白的表達(dá)引起甲狀腺癌細(xì)胞凋亡[15]。Bcl-2是Bcl家族中最先發(fā)現(xiàn)的抑制細(xì)胞凋亡因子，主要通過細(xì)胞途徑維持細(xì)胞正常增長(zhǎng)，遏制細(xì)胞凋亡[16]。有研究發(fā)現(xiàn)通過抑制Bcl-2降低腫瘤細(xì)胞遷移而誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡[17]。國(guó)外研究也發(fā)現(xiàn)Galectin-3與Bcl-2有相似的重要序列，且序列的存在與抗細(xì)胞凋亡的特征具有很大的相關(guān)性[5]。蛋白質(zhì)-細(xì)胞內(nèi)Galectin-3與Bcl-2蛋白的相互作用可能是Galectin-3抑制癌細(xì)胞凋亡的機(jī)制之一[18-19]。劉松[20]在甲狀腺癌組織研究中發(fā)現(xiàn)Galectin-3基因與Survivin表達(dá)呈正相關(guān)，提示兩者可能存在協(xié)同，但該實(shí)驗(yàn)僅從組織學(xué)上推測(cè)兩者可能存在相關(guān)性，并未從細(xì)胞學(xué)上進(jìn)一步來干預(yù)Galectin-3基因表達(dá)后探究Survivin蛋白表達(dá)的變化。本實(shí)驗(yàn)通過siRNA基因抑制Galectin-3表達(dá)后，Survivin、Bcl-2表達(dá)顯著低于空白對(duì)照組及陰性對(duì)照組(P<0.05)，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，即B-CPAP增殖、侵襲能力下降，從而表明Galectin-3在Survivin和Bcl-2使B-CPAP凋亡中的作用是促進(jìn)的關(guān)系，也可能是沉默Galectin-3對(duì)B-CPAP增殖和侵襲能力的機(jī)制之一。

MMP-9屬于MMP家族，為高度保守的蛋白水解酶，其在癌細(xì)胞的轉(zhuǎn)移潛能中起著重要作用，可以破壞組織屏障細(xì)胞外基質(zhì)，導(dǎo)致腫瘤發(fā)生轉(zhuǎn)移[21]。大量證據(jù)表明[22]MMP-9是腫瘤生長(zhǎng)、侵襲和轉(zhuǎn)移的重要調(diào)節(jié)因子，此研究也發(fā)現(xiàn)高危甲狀腺乳頭狀癌患者術(shù)前MMP-9水平較高，而那些需要重復(fù)劑量的131I治療的患者M(jìn)MP-9水平較高,故對(duì)轉(zhuǎn)移性及碘難治性分化型甲狀腺癌有指導(dǎo)意義。研究[23]證實(shí)MMP-9能促進(jìn)轉(zhuǎn)移生長(zhǎng)因子誘導(dǎo)甲狀腺癌的上皮-間質(zhì)轉(zhuǎn)化過程，MMP-9的高表達(dá)可能是影響甲狀腺癌高侵襲性和預(yù)后不良的因素之一。有研究報(bào)道通過沉默MMP-9高轉(zhuǎn)移性乳腺癌的侵襲和轉(zhuǎn)移能力明顯下降，這說明MMP-9過表達(dá)可以促進(jìn)腫瘤細(xì)胞的遠(yuǎn)處轉(zhuǎn)移[24]，以上研究均說明MMP-9在多種腫瘤細(xì)胞的增殖和侵襲能力過程中發(fā)揮重要的作用。楊柳等[25]研究發(fā)現(xiàn)在肺癌H460細(xì)胞中下調(diào)Galectin-3后的H460細(xì)胞中MMP-9水平下降，說明下調(diào)Galectin-3可能通過抑制肺癌細(xì)胞合成MMP-9發(fā)揮抗腫瘤作用。有研究表明MMP-9在甲狀腺癌的侵襲和轉(zhuǎn)移過程中起著重要的作用[26]。方政等[9]通過沉默Galectin-3表達(dá)發(fā)現(xiàn)口腔鱗狀細(xì)胞MMP-9表達(dá)低于空白對(duì)照組。對(duì)于在B-CPAP中，研究沉默Galectin-3表達(dá)與MMP-9表達(dá)的相關(guān)性尚未見文獻(xiàn)報(bào)道。本實(shí)驗(yàn)通過沉默Galectin-3表達(dá)進(jìn)一步研究MMP-9蛋白表達(dá)的變化，MMP-9蛋白表達(dá)顯著低于空白對(duì)照組及陰性對(duì)照組(P<0.05)，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，同時(shí)B-CPAP增殖及侵襲能力也顯著減弱。與之前實(shí)驗(yàn)相比，從細(xì)胞學(xué)角度證實(shí)可以通過沉默Galectin-3降低MMP-9蛋白表達(dá)，從而降低B-CPAP的增殖及侵襲能力。

既往對(duì)于Galectin-3與B-CPAP的增殖及侵襲能力的關(guān)系研究較少，現(xiàn)有報(bào)道僅是限于從甲狀腺癌組織學(xué)角度的研究，從細(xì)胞學(xué)角度對(duì)于B-CPAP發(fā)生、發(fā)展的機(jī)制研究鮮有報(bào)道。本研究表明，借助于siRNA技術(shù)沉默Galectin-3基因表達(dá)，可以下調(diào)survivin、Bcl-2及MMP-9蛋白表達(dá)，B-CPAP增殖率明顯下降，同時(shí)細(xì)胞侵襲能力也明顯降低，Galectin-3在B-CPAP的發(fā)生發(fā)展中發(fā)揮了重要作用。沉默Galectin-3對(duì)B-CPAP增殖和侵襲能力的可能機(jī)制是沉默Galectin-3基因，下調(diào)了survivin、Bcl-2及MMP-9蛋白表達(dá)。本次研究結(jié)果也為該疾病，尤其是部分進(jìn)展期、轉(zhuǎn)移性病灶或碘難治性分化型甲狀腺癌的未來靶向治療提供可能理論依據(jù)。但本研究仍然存在不足之處，僅對(duì)沉默Galectin-3基因與survivin、Bcl-2及MMP-9下調(diào)的關(guān)系進(jìn)行了簡(jiǎn)單的研究，而對(duì)于促進(jìn)腫瘤細(xì)胞凋亡方面存在的具體機(jī)制尚需進(jìn)一步深入研究。