納米二氧化鈦增強五價砷對豐年蝦的慢性毒性作用

楊舒萍, 楊 帆, 董四君, 顏昌宙*

1.中國科學(xué)院城市環(huán)境研究所, 城市環(huán)境與健康重點實驗室， 福建 廈門 361021 2.中國科學(xué)院大學(xué), 北京 100049 3.河北大學(xué)生命科學(xué)學(xué)院, 河北 保定 071002

砷(arsenic，As)作為一種豐富的自然元素和重要的環(huán)境污染物，對水生生物及人類健康均具有嚴重危害[1-2]. 有關(guān)As對水生生物的毒性效應(yīng)，國內(nèi)外均有大量報道[3-4]. 在真實的水環(huán)境中，As的生物可利用性和毒理效應(yīng)可能會受到環(huán)境中廣泛存在的納米顆粒物的影響. 因此，在研究As對水生生物毒性效應(yīng)時，有必要考慮人工納米顆粒的影響及其潛在的復(fù)合毒性效應(yīng)，這對深入了解As的環(huán)境行為及生態(tài)毒理效應(yīng)具有重要意義.

納米二氧化鈦(titanium dioxide nanoparticles，nano-TiO2)是目前應(yīng)用最廣泛的納米材料之一[5-6]. 近年來已有關(guān)于nano-TiO2對As載體效應(yīng)的研究，即As能以As-nano-TiO2復(fù)合物的形式進入生物體內(nèi)，導(dǎo)致其生物利用性和毒性增強[7-8]. 然而，也有研究[9-10]發(fā)現(xiàn)，由于nano-TiO2對As的吸附作用導(dǎo)致暴露介質(zhì)或生物體內(nèi)As有效濃度降低而引起As毒性減弱. 這些研究結(jié)果的差異性可能主要與nano-TiO2晶型、濃度、受試生物以及試驗體系不同有關(guān). 另外，nano-TiO2對As的生物利用性及其毒性效應(yīng)的影響還可以通過生殖及攝食行為進行傳遞，對下一代及高營養(yǎng)級生物造成難以預(yù)估的風險[11-12]. 因此，進一步探究nano-TiO2與As的復(fù)合毒性效應(yīng)十分必要. 相較于淡水環(huán)境，研究人員對咸水環(huán)境中nano-TiO2與As交互作用及二者復(fù)合毒性效應(yīng)的關(guān)注較少. 由于咸水環(huán)境具有高鹽度、高離子強度的特點，使得nano-TiO2在咸水環(huán)境中的行為及歸趨不同于淡水環(huán)境，因此亟需加強nano-TiO2與As對咸水生物的復(fù)合毒性效應(yīng)研究. 此外，目前有關(guān)nano-TiO2與As的復(fù)合毒性效應(yīng)研究均基于急性毒性試驗，而實際環(huán)境中生物體往往是持續(xù)暴露于多種污染物中，因此在生物體整個生命周期內(nèi)考察污染物的慢性復(fù)合毒性效應(yīng)可能更具有實際意義.

該研究以咸水環(huán)境中的浮游動物——豐年蝦(Artemiasalina)為模式生物[13]，通過觀察五價砷〔arsenate，As(Ⅴ)〕和nano-TiO2在單獨和聯(lián)合暴露條件下對豐年蝦存活率、生長發(fā)育狀況、腸道形態(tài)和超微結(jié)構(gòu)的影響，并測定豐年蝦對As攝入、累積量以及As在豐年蝦體內(nèi)各亞細胞組分分布情況，揭示在nano-TiO2存在條件下As(Ⅴ)對豐年蝦的慢性毒性效應(yīng)，以期為系統(tǒng)認識咸水體系中nano-TiO2和As復(fù)合毒性效應(yīng)與生態(tài)風險評估提供基礎(chǔ)數(shù)據(jù)和理論依據(jù).

1 材料與方法

1.1 試驗材料

Nano-TiO2(銳鈦礦，純度≥99.7%，平均粒徑<25 nm，表面積為45～55 m2/g)購自美國西格瑪奧德里奇公司，用于制備濃度為1 g/L nano-TiO2儲備液，室溫避光保存?zhèn)溆? 為了使nano-TiO2顆粒分散均勻，每次使用前需將nano-TiO2儲備液冰浴超聲20 min (40 kHz). 十二水砷酸鈉(Na3AsO4·12H2O，分析純)購自國藥集團化學(xué)試劑有限公司，用于制備As(Ⅴ)(1 g/L)儲備液，置于4 ℃冰箱中避光保存?zhèn)溆? 觀賞魚類海水晶(中鹽工程技術(shù)研究院有限公司)用于配置人工海水(30‰)，人工海水需過濾(0.45 μm，Millipore)后使用. Nano-TiO2在人工海水(30‰，pH=8.0±0.1)中形貌特征、水合粒徑和zeta電位在筆者課題組先前研究[12]中已進行表征. 該試驗涉及的其他化學(xué)試劑(分析純)均購自國藥集團化學(xué)試劑有限公司.

1.2 豐年蝦孵化與培養(yǎng)

豐年蝦(A.salina)滯育卵購自當?shù)厮屦^，置于-20 ℃冰箱中解除滯育. 使用曝氣24 h人工海水(30‰，pH=8.0±0.1)孵化豐年蝦，具體孵化步驟參考文獻[7]. 新孵化的豐年蝦Ⅰ齡無節(jié)幼蟲轉(zhuǎn)移到新鮮人工海水中無喂食培養(yǎng)24 h，豐年蝦Ⅱ齡無節(jié)幼蟲即可用于毒性試驗.

1.3 試驗設(shè)置

試驗設(shè)置1個As(Ⅴ)濃度(0.1 mg/L)和2個nano-TiO2濃度(1和10 mg/L)，組別設(shè)置如表1所示，所有處理均設(shè)3個重復(fù)，試驗重復(fù)兩次. 用曝氣24 h的人工海水(30‰，pH=8.0±0.1)及預(yù)先配置好的As(Ⅴ)和nano-TiO2儲備液配置暴露溶液，待As(Ⅴ)在nano-TiO2上吸附平衡后(1 h)即可接入豐年蝦[7]. 每個培養(yǎng)皿(15 cm)含200 mL暴露溶液及400只豐年蝦Ⅱ齡幼蟲. 培養(yǎng)條件：溫度(25±2)℃；光照/黑暗循環(huán)為16 h/8 h，光照強度為 4 000 lx. 試驗為期28 d，每天喂食杜氏鹽藻(Dunaliellasalina)(4×104cells/mL)2次，每周更換3次暴露溶液.

表1 豐年蝦28 d長期慢性毒性試驗組別設(shè)置

1.4 豐年蝦存活率及體長測定

暴露期間，每天記錄豐年蝦死亡個體數(shù)，計算存活率. 另外，每周測定豐年蝦體長，具體方法：在暴露第7、14、21和28天，隨機選取5只豐年蝦置于4%甲醛溶液中進行固定，隨后置于載玻片上，于倒置電子顯微鏡(AE31，Motic，德國)下測定體長. 豐年蝦頭部到尾叉之間的距離即為體長.

1.5 豐年蝦腸道形態(tài)及超微結(jié)構(gòu)觀察

暴露結(jié)束后，采用倒置電子顯微鏡觀察豐年蝦形態(tài)變化，并拍照記錄. 另外，參考Bacchetta等[14]方法制作生物樣品超薄切片，采用透射電子顯微鏡(Transmission Electron Microscope，TEM；H-7650，Hitachi，日本)觀察豐年蝦腸道超微結(jié)構(gòu)變化.

1.6 豐年蝦對As的攝入與累積

在暴露第7、14、21和28天收集生物樣品(n=50)，洗滌后(超純水沖洗1 min，0.1 mmol/L磷酸鹽緩沖液浸泡30 s，超純水沖洗1 min)均分成兩部分. 其中，一部分直接冷凍干燥至恒重，消解后用于測定豐年蝦對As的攝入；另一部分轉(zhuǎn)至干凈人工海水中，凈化10 h[7]后冷凍干燥至恒重，消解后用于測定豐年蝦對As的累積，消解過程參考文獻[15]的方法. 消解結(jié)束后，樣品用2% HNO3溶液稀釋定容，過濾后用電感耦合等離子體質(zhì)譜儀(7500Cx型，Agilent，美國)測定樣品中的As含量，豐年蝦對As的攝入及積累量均用μg/g (以干質(zhì)量計)表示. 同時測定標準物質(zhì)紫菜(GBW08521，國家標準物質(zhì)研究中心)中的As含量，從而對消解過程進行質(zhì)控. 另外，豐年蝦攝入體內(nèi)的部分As能在凈化過程中通過排泄作用排出體外，可根據(jù)式(1)計算凈化過程中豐年蝦對As的平均排泄速率.

νd=(cu-ca)/10

(1)

式中：νd為As平均排泄速率，μg/(g·h)；cu、ca分別為豐年蝦對As的攝入量及累積量，μg/g.

1.7 As在豐年蝦各亞細胞組分中的分布

按1.6節(jié)中方法收集、洗滌和凈化生物樣品(n=25)，隨后將樣品置于組織勻漿器中勻漿(加入1 mL 0.9%預(yù)冷生理鹽水). 采用差速離心法(見圖1)將生物組織勻漿分為5部分，分別為細胞碎屑組分、富金屬礦體(metal rich granules，MRG)組分、細胞器組分、熱穩(wěn)定蛋白(heat-stable protein，HSP)組分和熱敏感蛋白(heat-denatured protein，HDP)組分[16]. 所有亞細胞組分均按1.6節(jié)所述方法冷凍干燥、消解和測定分析. 結(jié)果以各組分中As含量占5個亞細胞組分中As總含量的比例表示.

圖1 分離各亞細胞組分的差數(shù)離心法[16]Fig.1 Differential centrifugation procedure for separating each subcellular fraction[16]

1.8 數(shù)據(jù)統(tǒng)計分析

采用SPSS 19.0軟件對處理組之間差異進行單因素方差分析(one-way ANOVA)，P值小于0.05時表示差異顯著.

2 結(jié)果與討論

2.1 豐年蝦存活率及體長變化

Nano-TiO2與As(Ⅴ)單獨或聯(lián)合暴露28 d過程中豐年蝦存活率變化如圖2所示. 由圖2可見：暴露結(jié)束后，對照組存活率大于95%，5個試驗組最終存活率在60%～90%之間，其中，1TiO2試驗組和10TiO2試驗組最終存活率(約為90%)與對照組之間差異不顯著，而0.1As(Ⅴ)試驗組(約為80%)、1TiO2+0.1As(Ⅴ)試驗組(約為70%)和10TiO2+0.1As(Ⅴ)試驗組(約為60%)最終存活率均明顯低于對照組(P均小于0.05). 與As(Ⅴ)單獨暴露組相比，nano-TiO2與As(Ⅴ)聯(lián)合暴露組豐年蝦存活率進一步下降，且0.1As(Ⅴ)試驗組和10TiO2+0.1As(Ⅴ)試驗組之間存在顯著差異(P<0.05). 由圖3可見：各處理組豐年蝦體長均隨暴露時間的增長而增加. 暴露第14天時豐年蝦體長比暴露第7天時增長近40%；而在暴露第14、21和28天時，豐年蝦體長基本維持在同一水平，體長約為 1 000 μm. 整個暴露過程中，5個試驗組豐年蝦體長均略小于對照組，但與對照組均不存在顯著差異(P>0.05).

圖2 28 d慢性暴露過程中豐年蝦存活曲線Fig.2 Survival curves of A. salina under 28 d of chronic exposure

圖3 28 d慢性暴露過程中豐年蝦體長的變化Fig.3 Change of body length of A. salina under 28 d of chronic exposure

由于在整個暴露過程中nano-TiO2單獨暴露組(1TiO2試驗組和10TiO2試驗組)豐年蝦的存活率及生長率與對照組之間差異均不顯著，因此在該研究中可以認為nano-TiO2對豐年蝦的毒性效應(yīng)較低，可以忽略其直接的毒理效應(yīng)，重點關(guān)注聯(lián)合暴露條件下As(Ⅴ)對豐年蝦的毒性效應(yīng)以及nano-TiO2對豐年蝦毒性的影響. 已有研究[17]證實，As(Ⅴ)對豐年蝦全生命周期存在慢性毒性作用，毒性指標主要集中在存活率、生長率及繁殖率. 筆者研究中nano-TiO2與As(Ⅴ)單獨或聯(lián)合慢性暴露導(dǎo)致豐年蝦體長雖略有下降，但與對照組相比并不存在顯著差異；相反，0.1As(Ⅴ)試驗組、1TiO2+0.1As(Ⅴ)試驗組和10TiO2+0.1As(Ⅴ)試驗組豐年蝦存活率顯著低于對照組，因此推測與生長率相比，存活率可能是生物體在暴露過程中最敏感的毒性指標. 與筆者研究結(jié)果類似，Brix等[17]將豐年蝦Ⅰ齡幼蟲暴露于不同濃度的As(Ⅴ)溶液28 d，發(fā)現(xiàn)不同暴露濃度對豐年蝦親代及子代生長率均沒有顯著影響，且子代對As(Ⅴ)敏感度降低，而親代豐年蝦存活率比對照組顯著下降. 另外，相比As(Ⅴ)單獨暴露組，添加nano-TiO2后豐年蝦存活率進一步下降，揭示nano-TiO2對As(Ⅴ)毒性有增強作用. 與筆者研究結(jié)果類似，Wang等[18]發(fā)現(xiàn)，當網(wǎng)紋蚤(Ceriodaphniadubia)同時暴露于As(Ⅴ)和nano-TiO2時，As(Ⅴ)對網(wǎng)紋蚤半致死濃度由As(Ⅴ)單獨暴露下的3.68 mg/L降至1.43 mg/L；Fan等[11]發(fā)現(xiàn)，As〔As(Ⅴ)和As(Ⅲ)〕與nano-TiO2聯(lián)合暴露下大型蚤(Daphniamagna)存活率均明顯低于As單獨暴露條件下.

2.2 豐年蝦腸道形態(tài)及超微結(jié)構(gòu)變化

暴露結(jié)束后，5個試驗組豐年蝦生長發(fā)育進程與對照組相比并沒有顯著差別，各處理組豐年蝦均發(fā)育完全，在胸部均可觀察到11對附肢. 然而通過觀察其內(nèi)部結(jié)構(gòu)發(fā)現(xiàn)，nano-TiO2單獨暴露下豐年蝦腸道形態(tài)未見明顯破壞，而As(Ⅴ)暴露組〔0.1As(Ⅴ)試驗組、1TiO2+0.1As(Ⅴ)試驗組和10TiO2+0.1As(Ⅴ)試驗組〕豐年蝦腸道正常形態(tài)被破壞，腸道腫脹變形，且As(Ⅴ)與nano-TiO2聯(lián)合暴露下破壞作用更明顯(見圖4). 在0.1As(Ⅴ)試驗組、1TiO2+0.1As(Ⅴ)試驗組和10TiO2+0.1As(Ⅴ)試驗組中腸道腫脹的豐年蝦占比分別為60%、60%和80%.

注：紅色虛線方框內(nèi)指示豐年蝦腸道腫脹變形.圖4 暴露28 d后豐年蝦腸道形態(tài)特征Fig.4 Morphological characteristics of intestine of A. salina after exposed for 28 d

為了進一步探究豐年蝦腸道出現(xiàn)腫脹變形的原因，筆者同時觀察了豐年蝦腸道超微結(jié)構(gòu). 由圖5可見：對照組豐年蝦腸道上皮細胞細胞內(nèi)部結(jié)構(gòu)完好，腸道微絨毛排列整齊，未見明顯損傷；而各試驗組豐年蝦腸道微絨毛排列雜亂，且與對照組相比，腸道微絨毛密度降低(見圖5藍色箭頭指示處). 在5個試驗組中，每個試驗組各觀察10個豐年蝦腸道電鏡圖，發(fā)現(xiàn)1TiO2試驗組和10TiO2試驗組中腸道微絨毛密度降低的豐年蝦占比較小，分別為10%和30%；而0.1As(Ⅴ)試驗組、1TiO2+0.1As(Ⅴ)試驗組和10TiO2+0.1As(Ⅴ)試驗組中腸道微絨毛密度降低的豐年蝦占比分別達60%、60%和70%. 另外，0.1As(Ⅴ)試驗組豐年蝦腸道上皮細胞出現(xiàn)明顯細胞質(zhì)空洞化和細胞質(zhì)纖維化〔見圖5(b)〕. 當添加nano-TiO2后，細胞質(zhì)空洞化及纖維化程度加深，且與1TiO2+0.1As(Ⅴ)試驗組相比，10TiO2+0.1As(Ⅴ)試驗組豐年蝦腸道超微結(jié)構(gòu)破壞更為嚴重〔見圖5(e)(f)〕. 在10TiO2+0.1As(Ⅴ)試驗組還觀察到了腸道上皮細胞脫離腸壁的現(xiàn)象〔見圖5(f)〕.

功能器官結(jié)構(gòu)變化是生物體在不利環(huán)境條件脅迫下受到毒性作用的直接表現(xiàn)，也是分析污染物對其毒性的重要指標[17]. 腸道作為動物重要的消化、吸收和免疫器官，是生物體抵御外源性物質(zhì)入侵的關(guān)鍵防線[19]. 研究[20-22]表明，不論是重金屬暴露、納米材料暴露或是二者聯(lián)合暴露，都可能導(dǎo)致生物體腸道受損，直觀表現(xiàn)為腸道變形，微觀表現(xiàn)為腸道上皮細胞損傷、腸黏膜損傷、炎癥和腸道微生物群紊亂. 腸道損傷會影響消化系統(tǒng)正常運行，最終對生物體造成不良影響[23]. 筆者研究中5個試驗組豐年蝦均存在腸道微絨毛排列雜亂、密度降低的情況，這可能預(yù)示著暴露導(dǎo)致腸道炎癥的發(fā)生[24]. 此外，nano-TiO2單獨暴露對豐年蝦腸道形態(tài)及超微結(jié)構(gòu)并未產(chǎn)生其他顯著影響，進一步揭示了nano-TiO2對豐年蝦的低毒性. 然而，不論是As(Ⅴ)單獨暴露或與nano-TiO2聯(lián)合暴露均對豐年蝦腸道形態(tài)及超微結(jié)構(gòu)造成顯著破壞. 與筆者研究結(jié)果類似，Shi等[25]將鰷魚(Gobiocyprisrarus)暴露于不同濃度的As(Ⅲ)溶液96 h，TEM結(jié)果顯示，與對照組相比，暴露組鰷魚腸道存在大量細胞和組織病變，表現(xiàn)為腸道外觀不規(guī)則、腸絨毛變性破裂、腸壁皺襞萎縮、腸道上皮細胞增生和腫大. 與存活率結(jié)果相似，nano-TiO2參與下As(Ⅴ)對豐年蝦腸道破壞作用加劇. Liu等[22]探究Cu2+與兩種nano-TiO2(親水型與疏水型)對大型蚤聯(lián)合毒性效應(yīng)時發(fā)現(xiàn)：疏水型nano-TiO2存在時Cu的生物積累增加，可能導(dǎo)致更嚴重的氧化應(yīng)激損傷；而親水型nano-TiO2對Cu毒性的促進作用可能與nano-TiO2加劇大型蚤腸黏膜機械損傷有關(guān). 因此，nano-TiO2導(dǎo)致重金屬離子毒性效應(yīng)增強的機制與nano-TiO2種類、受試生物種類以及試驗設(shè)置緊密相關(guān). 已有研究主要基于短期急性暴露試驗，長期慢性暴露下nano-TiO2對As(Ⅴ)毒性的增加效應(yīng)的研究仍需進一步加強.

注： *表示攝入量與累積量之間存在顯著性差異(P<0.05). As攝入量與積累量以干質(zhì)量計.圖6 28 d慢性暴露下豐年蝦對As的攝入與累積Fig.6 The uptake and accumulation of As in A. salina under 28 d of chronic exposure

2.3 豐年蝦對As的攝入與累積

由圖6可見：各試驗組豐年蝦在暴露第7、14、28天時對As的攝入和累積并沒有顯著差異；但在暴露第21天時，豐年蝦對As的攝入和累積比第7、14、28天時顯著下降. 由于14～21 d是豐年蝦主要產(chǎn)卵(子)期，因此豐年蝦可能通過子代轉(zhuǎn)移部分As，這與Luo等[8]研究結(jié)果一致. 與0.1As(Ⅴ)試驗組相比，添加nano-TiO2后豐年蝦對As的攝入和累積均增加，且暴露后期(第21和28天)，10TiO2+0.1As(Ⅴ)試驗組豐年蝦對As的攝入與累積均顯著增加(P<0.05). 另外，通過對比豐年蝦對As的攝入與累積差異發(fā)現(xiàn)，0.1As(Ⅴ)試驗組豐年蝦對As的攝入與累積并無顯著差異，1TiO2+0.1As(Ⅴ)試驗組豐年蝦對As的攝入在暴露第21天時顯著高于對As的累積，而10TiO2+0.1As(Ⅴ)試驗組豐年蝦對As的攝入在整個暴露過程中都明顯高于對As的累積.

為了探究As(Ⅴ)單獨暴露或與nano-TiO2聯(lián)合暴露下豐年蝦對As的排泄能力，該研究計算了不同處理下豐年蝦對As的平均排泄速率(凈化10 h). 由圖7可見：0.1As(Ⅴ)試驗組豐年蝦對As的平均排泄速率隨暴露時間的延長并未出現(xiàn)明顯變化；而1TiO2+0.1As(Ⅴ)試驗組和10TiO2+0.1As(Ⅴ)試驗組豐年蝦對As的平均排泄速率均隨暴露時間的延長而下降. 在暴露前期(第7和14天)，nano-TiO2能顯著提高豐年蝦對As的平均排泄速率；然而在暴露后期(第21和28天)，添加nano-TiO2對As平均排泄速率沒有顯著影響.

注： 不同小寫字母表示試驗組之間存在顯著性差異(P<0.05).圖7 豐年蝦在10 h凈化過程中對As的 平均排泄速率Fig.7 The average excretion rate of As during 10 h of purification in A. salina

已有研究[7-8,26]發(fā)現(xiàn)，海洋微藻(Nannochloropsismaritima)、豐年蝦(A.salina)和大型蚤(D.magna)中均可觀察到nano-TiO2對As的載體效應(yīng). 作為典型非選擇性濾食生物，豐年蝦能夠隨機攝取周圍環(huán)境中1～50 μm顆粒物質(zhì)[23]. Yan等[7]探究了nano-TiO2在人工海水中的行為及對As(Ⅴ)的吸附，結(jié)果表明，nano-TiO2在人工海水中能迅速發(fā)生團聚使得nano-TiO2(1和10 mg/L)及As-nano-TiO2復(fù)合物的水合粒徑在1.0～1.5 μm之間，存在被豐年蝦攝取的可能，而攝取As-nano-TiO2復(fù)合物增加了豐年蝦對As的攝入. 筆者研究中，與0.1As(Ⅴ)試驗組相比，nano-TiO2存在下〔10TiO2+0.1As(Ⅴ)試驗組〕豐年蝦對As的攝入顯著增加(P<0.05)；同時，添加nano-TiO2會導(dǎo)致豐年蝦對As的排泄作用顯著增加(第7和14天)，最終導(dǎo)致各試驗組豐年蝦對As的累積無顯著差異(P>0.05). 結(jié)果表明，生物體對化學(xué)物質(zhì)攝入量并不能真實反映生物體對化學(xué)物質(zhì)的累積及生物利用情況，尤其是在與nano-TiO2等“載體”共存條件下，化學(xué)物質(zhì)毒性機理可能不僅與nano-TiO2載體效應(yīng)有關(guān)，也可能與nano-TiO2無生物可利用性而被生物體快速排泄緊密相關(guān). 然而，隨著暴露時間的延長(第21和28天)，nano-TiO2對豐年蝦As平均排泄速率的影響逐漸消失，而nano-TiO2對As的載體效應(yīng)依舊顯著，導(dǎo)致暴露后期nano-TiO2與As(Ⅴ)聯(lián)合暴露組中豐年蝦對As的累積顯著高于As(Ⅴ)單獨暴露組，這也可能是暴露后期聯(lián)合暴露組豐年蝦腸道超微結(jié)構(gòu)破壞作用更為嚴重的原因之一.

2.4 As在豐年蝦各亞細胞組分中的分布

注：不同小寫字母表示試驗組之間存在顯著性差異(P<0.05).圖8 As在豐年蝦各亞細胞組分中的分布情況Fig.8 Distribution of As in different subcellular fractions of A. salina

單獨和聯(lián)合暴露條件下，As在豐年蝦各亞細胞組分(細胞碎屑組分、MRG組分、HSP組分、細胞器組分、HDP組分)中分布情況如圖8所示. 由圖8可見：在整個暴露階段，As主要分布在豐年蝦細胞碎屑組分(22.98%～66.91%)及HSP組分(15.47%～57.25%). 在暴露前期(第7和14天)，As在細胞碎屑組分中的相對含量隨暴露時間延長而增加；相反，As在HSP組分中的相對含量隨暴露時間延長而降低. 在暴露后期(第21和28天)，As在細胞碎屑組分及HSP組分中的相對含量基本相同. 與As(Ⅴ)單獨暴露組相比，As在聯(lián)合暴露組細胞碎屑組分中的相對含量增加，特別是在10TiO2+0.1As(Ⅴ)試驗組(第7天，p>0.05；第14、21、28天，p均小于0.05). 在暴露第14、21和28天時，10TiO2+0.1As(Ⅴ)試驗組中As在豐年蝦細胞碎屑組分中相對含量分別比As(Ⅴ)單獨暴露組顯著增加了24.55%±6.23%、33.13%±3.52%和46.68%±8.35%. 與此相反，與As(Ⅴ)單獨暴露組相比，聯(lián)合暴露組As在HSP組分中的相對含量下降，特別是在10TiO2+0.1As(Ⅴ)試驗組(第7天，p>0.05；第14、21、28天，p均小于0.05). 在暴露第7、14、21和28天時，10TiO2+0.1As(Ⅴ)試驗組中As在豐年蝦HSP組分中的相對含量分別比0.1As(Ⅴ)試驗組降低了20.74%±2.80%、39.83%±9.54%、43.27%±5.29%和50.91%±7.60%.

細胞碎屑組分一般由細胞膜(壁)及組織碎片等組成[27]. 細胞膜(壁)上富含官能基團，可通過靜電吸附、化學(xué)絡(luò)合等作用將金屬離子隔絕在細胞外[28]，從而導(dǎo)致金屬離子在細胞碎屑組分中分布比例較高. 研究[7]發(fā)現(xiàn)，顆粒結(jié)合態(tài)金屬穿膜能力弱于自由離子態(tài)金屬. 筆者研究表明，在nano-TiO2存在條件下As在細胞碎屑組分中的相對含量增加，說明由于nano-TiO2對As(Ⅴ)的吸附作用，As-nano-TiO2復(fù)合物比離子態(tài)As更易被細胞膜阻隔，使得聯(lián)合暴露組As穿膜能力顯著下降，從而導(dǎo)致聯(lián)合暴露組As在細胞碎屑組分中的相對含量高于As(Ⅴ)單獨暴露組，這與Yang等[26,29]研究結(jié)果一致；同時，As在細胞碎屑組分中相對含量的增加導(dǎo)致As在細胞器、酶等生物活性組分中的相對含量降低，在一定程度上緩解了As對豐年蝦的毒性作用，使豐年蝦可以在較長時間暴露下維持正常生長發(fā)育. 然而，一部分As仍能夠通過細胞膜上的離子通道或胞吞作用進入細胞內(nèi)，對生物體產(chǎn)生不良影響.

與MRG和HSP組分結(jié)合的金屬通常被定義為生物解毒金屬(biologically detoxified metal，BDM)，即金屬可以通過與HSP組分結(jié)合或通過將金屬沉淀成MRG的方式解毒[30]. 筆者研究中As在HSP組分中相對含量較高，說明HSP組分可能參與了豐年蝦對As的解毒. Wang等[31]研究證明，As暴露下牡蠣(Crassostreaangulata和Crassostreahongkongensis)通過將體內(nèi)大部分As分配到HSP組分而解毒. Velez等[32]研究表明，蛤蜊(Venerupiscorrugata)體內(nèi)累積的As主要分布在HSP組分，表明該組分在As的隔離和穩(wěn)態(tài)中起重要作用. HSP組分一般由富含巰基的金屬硫蛋白以及其他巰基化合物和多肽(如谷胱甘肽)組成[33]. 生物體暴露于某些未知生物學(xué)功能的金屬(如Cd、Cu或As等)能誘導(dǎo)生物體內(nèi)產(chǎn)生低分子量金屬結(jié)合蛋白，表明細胞具有識別有毒金屬并對其作出反應(yīng)的獨特能力，這對生物體內(nèi)微量金屬代謝和毒理學(xué)研究起重要作用[34]. Cd、Cu或As等金屬離子對巰基的親和力較高，研究[35-37]發(fā)現(xiàn)，生物體處于Cd、Cu或As等離子暴露下也會出現(xiàn)金屬硫蛋白中金屬含量增加的現(xiàn)象. 這種金屬離子與富含硫基的HSP組分之間的相互作用被認為是生物體對非必需金屬離子的一種解毒機制，即二者相互作用限制金屬離子在生物體內(nèi)的移動與轉(zhuǎn)移，金屬離子處于隔離狀態(tài)從而不能與蛋白質(zhì)、酶和細胞器等生物敏感組分相互作用，從而降低其毒性效應(yīng)[33]. 然而在筆者研究中，添加nano-TiO2后As在HSP組分中相對含量下降，說明nano-TiO2抑制了豐年蝦對As的解毒過程. Fan等[38]研究提出，nano-TiO2存在時一部分Cu2+與nano-TiO2通過形成Cu—O鍵而被吸附，吸附態(tài)Cu不能有效誘導(dǎo)金屬硫蛋白形成，從而導(dǎo)致聯(lián)合暴露組大型蚤體內(nèi)金屬硫蛋白含量顯著低于單獨暴露組. 由于As(Ⅴ)也能通過與nano-TiO2形成As—O鍵而被吸附[39]，筆者推測這種吸附作用可能也會干擾As(Ⅴ)對豐年蝦體內(nèi)金屬硫蛋白形成的誘導(dǎo)作用，使得As在HSP組分中相對含量下降. 因此，nano-TiO2存在時As與金屬硫蛋白絡(luò)合的解毒過程受限，這可能是nano-TiO2增強As毒性效應(yīng)的重要原因之一.

3 結(jié)論

a) Nano-TiO2與As(Ⅴ)聯(lián)合暴露顯著增強As(Ⅴ)對豐年蝦的慢性毒性效應(yīng)，導(dǎo)致豐年蝦存活率顯著降低及腸道損傷加劇.

b) 在Nano-TiO2與As(Ⅴ)聯(lián)合暴露后期(第21和28天)，nano-TiO2促進豐年蝦排泄As的效應(yīng)減弱，導(dǎo)致聯(lián)合暴露組豐年蝦對As的累積顯著增加.

c) 在聯(lián)合暴露條件下，As在生物解毒組分——HSP組分中占比顯著下降，說明nano-TiO2可能會抑制豐年蝦體內(nèi)As解毒過程，從而增強As的毒性效應(yīng).