江蘇省某市部分農(nóng)村河道水體和污水處理廠主要工藝環(huán)節(jié)病毒污染狀況調(diào)查

陳曉峰， 朱 迅， 馮微宏， 丁新良， 錢燕華*， 許秋瑾

1.無(wú)錫市疾病預(yù)防控制中心(南京醫(yī)科大學(xué)附屬無(wú)錫疾病預(yù)防控制中心)， 江蘇 無(wú)錫 214023 2.中國(guó)環(huán)境科學(xué)研究院，環(huán)境基準(zhǔn)與風(fēng)險(xiǎn)評(píng)估國(guó)家重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室， 北京 100012 3.南京醫(yī)科大學(xué)全球健康中心， 江蘇 南京 211166

水環(huán)境中已知的病毒、細(xì)菌、原生動(dòng)物等病原生物超過(guò)140種，一些病原微生物的感染、傳播可以導(dǎo)致人類疾病的暴發(fā). 全世界沿海區(qū)域中的水源性病原生物每年會(huì)造成大約300萬(wàn)傷殘調(diào)整壽命年，即約120億美元的經(jīng)濟(jì)損失[1]. 水環(huán)境中常見(jiàn)的導(dǎo)致腹瀉的病毒有諾如病毒(norovirus，NV)、輪狀病毒(rotavirus，RV)、札如病毒(sapovirus，SaV)、腺病毒(adenovirus，AdV)、星狀病毒(astrovirus，AstV)和腸道病毒〔enterovirus，EV，包括脊髓灰質(zhì)炎病毒(polioviruses)、柯薩奇病毒(coxsackie viruses)和艾可病毒(echoviruses)〕等. 水源性病毒主要來(lái)自人畜糞便、生活及城市的污水污染，由于病毒的非細(xì)胞屬性，其在適宜的水環(huán)境中可以存活幾周，并大多數(shù)可以感染人類[2]. 2015年US EPA頒布的飲用水污染物候選清單CCL4列入了NV在內(nèi)的多種病毒污染物，表明水環(huán)境中存在的病毒對(duì)公眾健康的影響日益受到關(guān)注. 近年來(lái)，很多國(guó)家和地區(qū)發(fā)生了多起因水體諾如病毒污染而引起的腹瀉病事件[3-8]. 同時(shí)，我國(guó)城鎮(zhèn)污水處理廠目前采用的污水處理工藝并不能完全去除污水中的病毒[9-10]. 江蘇省某市自然水網(wǎng)分布廣泛，且每年時(shí)有諾如病毒疫情發(fā)生，因而非常有必要了解江蘇省某市自然水體、沉積物、污水處理廠各工藝段出水及污泥中病毒的季節(jié)性分布特征以及種類分布情況，筆者于2019年4—12月對(duì)該市農(nóng)村自然河道水體和污水處理廠主要工藝環(huán)節(jié)水樣以及污泥、沉積物進(jìn)行為期9個(gè)月的病毒污染狀況監(jiān)測(cè)采樣，以確定農(nóng)村河道水體和污水處理廠主要工藝環(huán)節(jié)病毒的污染狀況，并分析病毒污染與水環(huán)境常見(jiàn)理化因素之間的相關(guān)性，以研究病毒的水環(huán)境影響因素，以期為水環(huán)境中病毒的監(jiān)測(cè)及其生態(tài)環(huán)境與人體健康風(fēng)險(xiǎn)評(píng)估提供參考.

1 材料與方法

1.1 樣品采集

樣品采集時(shí)間為2019年4—12月，樣品采集頻次為每月1次，共采集并檢測(cè)90份樣本，其中水體樣本63份，污泥樣本9個(gè)，沉積物樣本18份. 水樣采集和保存按HJ 91—2002《地表水和污水監(jiān)測(cè)技術(shù)規(guī)范》和HJ/T 493—2009《水質(zhì)樣品的保存和管理技術(shù)規(guī)定》執(zhí)行，每月下旬采樣，用有機(jī)玻璃采樣器取水面以下20 cm處樣品20 L，放入潔凈的采樣桶. 沉積物樣本用彼得森采泥器(PBS-411，武漢彼德森科技有限公司)在固定點(diǎn)位采集500 g. 現(xiàn)場(chǎng)使用YSI 550A 野外便攜式溶氧儀(550A，美國(guó)YSI 公司 )測(cè)定水體的水溫和DO(溶解氧). 樣品及采集點(diǎn)位信息見(jiàn)表1.

表1 樣品及采集點(diǎn)位信息

1.2 樣品處理

1.2.1水樣處理

在10 L原始水樣中加入濃度為2 mol/L的MgCl2溶液，使Mg2+終濃度為0.1 mol/L，充分?jǐn)嚢杌旌暇鶆?；采用真空抽濾使水樣以0.1 L/min的速度通過(guò)孔徑為0.45 μm的硝酸纖維素濾膜[11].

1.2.2污泥與沉積物樣品處理

取污泥或沉積物樣本10 g，加入50 mL提取劑(pH=9.4)(沉積物終濃度為0.1 g/mL)，提取劑中含有3%牛肉浸膏、0.05 mol/L磷酸氫二鈉(Na2HPO4)、5 mmol/L 檸檬酸(C6H8O7)；在振蕩培養(yǎng)箱中恒溫(4 ℃)、恒速(300 r/min)連續(xù)旋轉(zhuǎn)振蕩30 min，然后輕輕將其混合液轉(zhuǎn)移至高速離心管中，調(diào)節(jié)pH至9.4，4 ℃ 下以 10 000 r/min(即 12 096g)高速離心30 min，上清液調(diào)節(jié)pH為7.2～7.4；上清液經(jīng)過(guò)Cetrion plus 70超濾管濃縮至2 mL，對(duì)超濾濃縮后的病毒液提取核酸[12].

1.3 RNA提取與RT-PCR檢測(cè)

1.3.1RNA提取

將膜浸入pH=3.5的鹽酸溶液中，5 min后取1/4大小的膜剪碎(最后病毒量換算時(shí)再乘以4)，用1 mL Tralk洗脫液(0.05 mol/L KH2PO4，1.0 mol/L NaCl，0.1% Triton X-100，pH=9.2)在4 ℃下浸泡過(guò)夜洗脫，取200 μL洗脫液提取RNA，RNA提取按試劑盒說(shuō)明書操作.

1.3.2熒光定量RT-PCR檢測(cè)

使用ABI 7500實(shí)時(shí)熒光PCR儀(Prism? 7500，美國(guó)ABI公司)對(duì)每份樣本進(jìn)行檢測(cè)，熒光PCR試劑盒選用深圳生科原股份有限公司生產(chǎn)的輪狀病毒、諾如病毒(G Ⅰ、G Ⅱ)三重核酸檢測(cè)試劑盒(貨號(hào)：SKY-8413)[11]以及札如病毒、星狀病毒、腺病毒三重核酸檢測(cè)試劑盒(貨號(hào)：SKY-8412)和腸道通用核酸檢測(cè)試劑盒(貨號(hào)：SKY-8301). 反應(yīng)中所用陰陽(yáng)性質(zhì)控樣品來(lái)自試劑盒，體系配置和PCR反應(yīng)條件可參考試劑盒說(shuō)明書.

1.4 理化檢測(cè)方法

水樣采集后自然沉降30 min，取上層非沉降部分進(jìn)行分析. TN濃度采用堿性過(guò)硫酸鉀消解紫外分光光度法進(jìn)行測(cè)定；TP濃度采用為鉬酸銨分光光度法進(jìn)行測(cè)定；COD濃度采用為重鉻酸鉀法進(jìn)行測(cè)定；pH采用為玻璃電極法進(jìn)行測(cè)定；EC按照《水和廢水監(jiān)測(cè)分析方法》(第四版)相關(guān)方法進(jìn)行測(cè)定.

1.5 數(shù)據(jù)處理及分析

采用SPSS 15.0軟件進(jìn)行描述性分析和卡方檢驗(yàn)、相關(guān)性分析，P<0.05有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義.

2 結(jié)果與分析

2.1 不同類型病毒檢出率

在檢測(cè)的90份樣本中：NV G Ⅱ檢出份數(shù)最多，為33份，檢出率為36.67%；其次是EV，為27份，檢出率為30.00%；其他類型病毒檢出率均低于10%. NV G Ⅱ檢出率與EV檢出率無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)差異(P>0.05)，NV G Ⅱ和EV占據(jù)了腹瀉病毒檢出率的前兩位.

2.2 不同樣本類型中病毒檢出率

在63份水體樣本中，有28份檢出NV G Ⅱ，檢出率為44.44%，有22份檢出EV，檢出率為34.90%，其他類型病毒檢出率均低于10.00%. 27份污泥和沉積物樣本中，有5份檢出NV G Ⅱ，檢出率為18.50%；5份檢出EV，檢出率為18.50%；其他類型病毒檢出率均低于10.00%. 水樣與底泥中NV G Ⅱ的檢出率差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)，其他種類病毒在水樣與底泥中的檢出率差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)(見(jiàn)表2).

表2 不同樣本類型病毒檢出情況

2.3 污水處理廠主要工藝環(huán)節(jié)水體病毒檢出情況

污水廠進(jìn)水、膜處理后出水(未消毒)和消毒出水各有9份水樣，共計(jì)27份水樣，其中15份檢出NV G Ⅱ，11份檢出EV，NV G Ⅰ、RV、SaV、AdV各有2份檢出，AstV未檢出(見(jiàn)表3). 進(jìn)水(W5)中有4份檢出NV G Ⅱ，檢出率為44.44%；有3份檢出EV，檢出率為33.33%. 膜處理后水(未消毒)(W6)中有6份檢出NV G Ⅱ，檢出率為66.67%；有3份檢出EV，檢出率為33.33%. 消毒出水(W7)樣品共9份，其中NV G Ⅱ和EV各5份檢出，檢出率為55.56%(見(jiàn)表3). 不管污水處理前或處理后，NV和EV始終占據(jù)檢出病毒的前兩位，前后檢出率并無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)差異(P>0.05).

表3 污水處理廠各環(huán)節(jié)水體病毒檢出情況

2.4水溫與病毒檢出率的相關(guān)性

通過(guò)相關(guān)性分析得出，水溫升高，NV G Ⅱ檢出率降低，反之水溫降低，NV G Ⅱ檢出率增加，二者呈顯著負(fù)相關(guān) (P<0.05)，其他種類的病毒與水溫并無(wú)明顯相關(guān)性. DO、TP、TN、COD濃度和EC、pH均與病毒檢出率無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)差異.

3 討論

污水中諾如病毒的污染狀況普遍存在，且檢出率差異很大. 鄧麗麗等[13]在廣西南寧市朝陽(yáng)溪中檢出諾如病毒，程莉等[14]在北方某市環(huán)境水體中檢出輪狀病毒，尉秀霞等[15]在北京市豐臺(tái)區(qū)環(huán)境污水監(jiān)測(cè)中發(fā)現(xiàn)腸道病毒. 筆者于2020年4—12月在江蘇省某市農(nóng)村河道水體和污水處理廠主要工藝環(huán)節(jié)(水樣和污泥樣品)中均有檢出病毒，其中以NV G Ⅱ(檢出率為36.67%)和EV(檢出率為30.00%)為主，提示這些水體中有潛在病毒暴露風(fēng)險(xiǎn).

該研究中富集病毒采用了最常用的病毒吸附洗脫法(VIRADEL)中的陰離子膜吸附洗脫法，相比鋁鹽沉淀、PEG沉淀等方法耗時(shí)更短，病毒富集過(guò)程中損失更小，成本相對(duì)較低，更適用于基層對(duì)水中病毒的監(jiān)測(cè)工作[16].

所采集樣品中NV G Ⅱ的檢出率為36.67%，NV G Ⅰ 的檢出率為6.67%，NV的總檢出率達(dá)到43.34%，提示NV G Ⅱ可能是引起該城市人群腹瀉的優(yōu)勢(shì)病毒. 據(jù)日本相關(guān)報(bào)道，NV在污水(未處理水)中的檢出率在90%以上，檢出率居第二位的就是腸道病毒(EV)，占到65%[17-18]；另外，美國(guó)相關(guān)研究報(bào)道，污水中NV的檢出率也在80%以上，EV檢出率在50%以上[19]. 這些結(jié)果與筆者得到的江蘇省某市農(nóng)村河道及污水處理廠水體中病毒檢出率的排序是一致的，表明NV和EV是在污水中最常見(jiàn)的兩種病毒，遠(yuǎn)超其他種類的腹瀉病毒. 由于我國(guó)該市樣品中包含了經(jīng)過(guò)水廠處理的水，所以檢出比率大大低于日本相關(guān)報(bào)道數(shù)據(jù)(其樣本中只包括了污水)，這一結(jié)果揭示了NV感染的重要來(lái)源.

此次研究中污水處理廠消毒出水中NV、EV和RV均有檢出，表明該污水處理廠目前使用的消毒處理工藝并不能完全去除病毒，這與張德友等[9]發(fā)現(xiàn)北京市污水處理廠再生水RV檢出率的結(jié)論類似. 美國(guó)科學(xué)家發(fā)現(xiàn)小于25 ppm的氯處理工藝對(duì)于水中病毒的去除效果有限[20]，周進(jìn)宏等研究顯示，城市污水處理廠對(duì)星狀病毒的去除率為93.15%[10]，如果加上離子吸附洗脫效果或者臭氧處理病毒去除效果更好[21-22].

此次研究結(jié)果也顯示，NV G Ⅱ的檢出率呈隨水溫的升高而降低的特點(diǎn). 這與NV感染腹瀉病冬春季高發(fā)的結(jié)論[23-24]相一致，有研究表明，諾如病毒是熱敏感的病毒，高溫能加速諾如病毒的失活或死亡[25-27].

此次研究開展于2019年4—12月，考慮2020年后新冠肺炎疫情發(fā)生，消毒劑大量使用以及殘留的消毒劑可能會(huì)滲透入土壤及進(jìn)入環(huán)境水體，今后的研究中應(yīng)考慮殘留消毒劑是否會(huì)對(duì)環(huán)境水體中病毒的檢出率產(chǎn)生影響，以及是否會(huì)對(duì)人體健康造成相關(guān)風(fēng)險(xiǎn)[28].

4 結(jié)論

a) 江蘇省某市農(nóng)村河道及污水處理廠主要工藝環(huán)節(jié)水樣、沉積物及污泥樣品中，諾如病毒G Ⅱ檢出率為36.67%，腸道病毒檢出率為30.00%，其他病毒檢出率均低于二者.

b) 水溫與諾如病毒G Ⅱ檢出率呈顯著負(fù)相關(guān)(P<0.05).

c) 江蘇省某市農(nóng)村河道水體中存在病毒污染，諾如病毒G Ⅱ?yàn)閮?yōu)勢(shì)毒株. 采集到的污水處理廠出水中有諾如病毒G Ⅱ、腸道病毒和輪狀病毒檢出，污水處理廠出水通常排入就近的城市河道中. 因此，夏季人群在接觸城市河道水體時(shí)，有潛在病毒暴露風(fēng)險(xiǎn).