馬鈴薯品種‘并薯6號(hào)’遺傳轉(zhuǎn)化體系的建立

宋倩娜，梅 超，霍利光，王慧杰，馮瑞云

（山西農(nóng)業(yè)大學(xué)農(nóng)學(xué)院/作物遺傳與分子改良山西省重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，山西 太原 030031）

馬鈴薯（Solanum tuberosum L.）為茄科茄屬一年生同源四倍體草本植株，是中國(guó)繼小麥、玉米和水稻后的第四大糧食作物[1]。馬鈴薯營(yíng)養(yǎng)豐富、適應(yīng)性強(qiáng)、產(chǎn)量高、生育期短、經(jīng)濟(jì)效益高等特點(diǎn)使其成為重要的糧食作物，也是工業(yè)加工各種產(chǎn)品的原料[2]。近年來(lái)，隨著糧食問(wèn)題日益地嚴(yán)峻，馬鈴薯產(chǎn)業(yè)成為了中國(guó)糧食安全戰(zhàn)略中不可或缺的一部分。馬鈴薯的產(chǎn)量、品質(zhì)是影響中國(guó)馬鈴薯產(chǎn)業(yè)的最根本問(wèn)題，只有積極的開(kāi)展種質(zhì)資源創(chuàng)新和新品種選育才能逐步解決這些問(wèn)題[3]。目前馬鈴薯品種改良的主要手段包括傳統(tǒng)育種和植物基因工程育種。

馬鈴薯基因型復(fù)雜、自交衰退性等特點(diǎn)導(dǎo)致傳統(tǒng)育種周期長(zhǎng)和效率低[4]。而植物基因工程育種手段則可以大大的縮短育種周期、提高育種效率[5,6]。農(nóng)桿菌介導(dǎo)的遺傳轉(zhuǎn)化是植物基因工程育種中的必要環(huán)節(jié)。近幾年來(lái)，人們利用此方法將外源優(yōu)良基因轉(zhuǎn)入到馬鈴薯內(nèi)進(jìn)行抗性及品質(zhì)的改良并取得了一定的進(jìn)展[7]。但是，根癌農(nóng)桿菌介導(dǎo)的馬鈴薯遺傳轉(zhuǎn)化受到各種因素的影響，如基因型[8-10]、外植體類(lèi)型[11,12]、培養(yǎng)基成分和培養(yǎng)條件[13]、農(nóng)桿菌類(lèi)型及濃度、農(nóng)桿菌與外植體的共培養(yǎng)時(shí)間及農(nóng)桿菌侵染時(shí)間[14]等。雖然許多馬鈴薯品種的遺傳轉(zhuǎn)化體系已經(jīng)建立，但是這些體系是相對(duì)獨(dú)立的，不同的體系適合不同的品種。

馬鈴薯‘并薯6 號(hào)’是由山西農(nóng)業(yè)大學(xué)農(nóng)學(xué)院（山西省農(nóng)業(yè)科學(xué)院作物科學(xué)研究所）選育而成的品種，其具有生長(zhǎng)勢(shì)強(qiáng)、抗病性強(qiáng)、抗旱性強(qiáng)、產(chǎn)量高等優(yōu)點(diǎn)，但是也存在芽眼較深等缺點(diǎn)。因此，‘并薯6 號(hào)’的改良對(duì)山西省馬鈴薯產(chǎn)業(yè)發(fā)展具有重要的意義。本研究以‘并薯6 號(hào)’為研究材料，通過(guò)對(duì)遺傳轉(zhuǎn)化和再生過(guò)程中的外植體培養(yǎng)、植物激素的種類(lèi)及配比、抑菌劑的種類(lèi)及濃度和篩選劑的濃度進(jìn)行研究，建立‘并薯6 號(hào)’的農(nóng)桿菌介導(dǎo)的遺傳轉(zhuǎn)化及再生體系，為馬鈴薯基因功能的驗(yàn)證和品質(zhì)改良提供一定的理論基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 試驗(yàn)材料

1.1.1 植物材料

試驗(yàn)以馬鈴薯品種‘并薯6 號(hào)’的無(wú)菌試管苗為材料。無(wú)菌試管苗由本研究單位提供，由本課題組植物組織培養(yǎng)間培養(yǎng)并保存。

1.1.2 農(nóng)桿菌菌株及植物表達(dá)載體

農(nóng)桿菌類(lèi)型為根癌農(nóng)桿菌（Agrobacterium tumefaciens），菌株為GV3101。農(nóng)桿菌中含有的植物表達(dá)載體為基因過(guò)表達(dá)載體pMDC85，此載體上攜帶有潮霉素抗性基因Hyg（圖1），并由本課題組保存。

圖1 pMDC85載體圖Figure 1 pMDC85 vector

1.1.3 培養(yǎng)基及其成分

目前，關(guān)于馬鈴薯愈傷組織誘導(dǎo)及再生所用的激素主要包括生長(zhǎng)素類(lèi)（IAA、NAA 和2,4-D）、細(xì)胞分裂素類(lèi)（6-BA 和 ZT）以及 GA3等[15,16]。以已發(fā)表的研究報(bào)道為基礎(chǔ)，設(shè)計(jì)了以下的試驗(yàn)。本試驗(yàn)所用的基本培養(yǎng)基為MS（Murashige ＆ Skoog Medium），各種培養(yǎng)基的命名以及包含的成分見(jiàn)表1。

表1 培養(yǎng)基成分Table 1 Medium components

1.2 試驗(yàn)方法及培養(yǎng)條件

1.2.1 無(wú)菌試管苗的擴(kuò)繁

剪取帶有一個(gè)或者兩個(gè)腋芽的‘并薯6 號(hào)’的莖段作為外植體，將其形態(tài)學(xué)下端插入到MS 固體培養(yǎng)基（4.43 g/L MS 粉末、30 g/L 蔗糖和 7 g/L 瓊脂，pH 5.8），每個(gè)350 mL 培養(yǎng)瓶中插入的莖段數(shù)為8 個(gè)。將培養(yǎng)瓶置于組織培養(yǎng)間內(nèi)進(jìn)行培養(yǎng)，培養(yǎng)條件為光照強(qiáng)度2 000 lx，溫度（25 ± 2）℃，光照周期為16 h/8 h（光照/黑暗）。待苗齡為4 周后，按照上述相同的方法和培養(yǎng)條件繼續(xù)進(jìn)行擴(kuò)繁培養(yǎng)。

1.2.2 農(nóng)桿菌菌液的制備

挑取含有pMDC85 質(zhì)粒的GV3101 農(nóng)桿菌單菌落，接種于含有50 g/L 卡那霉素和50 g/L 利福平的LB 液體培養(yǎng)基中（10 g/L 胰蛋白胨、5 g/L 酵母提取物和5 g/L 氯化鈉，pH 7.4），置于搖床內(nèi)，28℃，220 r/min，黑暗條件下過(guò)夜培養(yǎng)至生長(zhǎng)對(duì)數(shù)期。將培養(yǎng)好的農(nóng)桿菌菌液于3 000 r/min 離心10 min，棄掉上清液。用MS 液體培養(yǎng)基（4.43 g/L MS 粉末和30 g/L 蔗糖，pH 5.8）重懸農(nóng)桿菌沉淀物，并稀釋至濃度為OD600=0.6，用于后續(xù)外植體的浸染。

1.2.3 外植體的預(yù)培養(yǎng)

以生長(zhǎng)周期約為4周的無(wú)菌苗為對(duì)象，剪取不帶有腋芽的、長(zhǎng)度約為1 cm的莖段為外植體，置于預(yù)培養(yǎng)培養(yǎng)基上進(jìn)行預(yù)培養(yǎng)（表1）。培養(yǎng)條件與上述相同，預(yù)培養(yǎng)時(shí)間設(shè)置為0，1，2，3和4 d。每組預(yù)培養(yǎng)試驗(yàn)的莖段數(shù)為20個(gè)/培養(yǎng)皿，3次重復(fù)。

1.2.4 外植體的浸染及共培養(yǎng)

收集預(yù)培養(yǎng)處理后的莖段外植體，將其置于提前準(zhǔn)備好的農(nóng)桿菌菌液中浸泡10 min，在此期間輕柔的搖晃混勻幾次，使外植體與農(nóng)桿菌菌液充分接觸。浸染結(jié)束后，將外植體轉(zhuǎn)移至多層無(wú)菌濾紙上，吸干多余農(nóng)桿菌菌液。將外植體以平鋪方式接種到共培養(yǎng)培養(yǎng)基上進(jìn)行共培養(yǎng)（表1），黑暗條件下，28℃共培養(yǎng)2 d。

1.2.5 外植體愈傷組織誘導(dǎo)培養(yǎng)基的篩選

將共培養(yǎng)后的外植體莖段轉(zhuǎn)移到不同的愈傷組織誘導(dǎo)培養(yǎng)基上。以MS 培養(yǎng)基為基礎(chǔ)培養(yǎng)基，激素組合有6-BA、NAA、2,4-D、KT 和GA3。將不同的激素種類(lèi)及配比進(jìn)行組合，共設(shè)計(jì)了4 種培養(yǎng)基，分別為CIM1、CIM2、CIM3 和CIM4（表2）。每組試驗(yàn)的莖段數(shù)為20 個(gè)/培養(yǎng)皿，3 次重復(fù)。培養(yǎng)條件同上述的試管苗擴(kuò)繁，4 周之后統(tǒng)計(jì)愈傷組織形成率。愈傷組織形成率（%）=（愈傷組織形成數(shù)/外植體總數(shù)）×100。確定愈傷組織誘導(dǎo)的最佳培養(yǎng)基配方以CIM 命名。

表2 5種激素配比對(duì)愈傷組織誘導(dǎo)影響的試驗(yàn)（mg/L）Table 2 Tests on ratios of five phytohormones for callus induction

1.2.6 愈傷組織分化培養(yǎng)基的篩選

將上述不同愈傷組織誘導(dǎo)培養(yǎng)基中的莖段再次分別轉(zhuǎn)移到愈傷組織分化培養(yǎng)基上。以MS 培養(yǎng)基為基礎(chǔ)培養(yǎng)基，激素組合有6-BA、ZT 和GA3。將不同的激素種類(lèi)及配比進(jìn)行組合，共設(shè)計(jì)了2 種培養(yǎng)基，分別為SIM1 和SIM2（表3）。每組試驗(yàn)的莖段數(shù)為20 個(gè)/培養(yǎng)皿，3 次重復(fù)。培養(yǎng)條件同上述的試管苗擴(kuò)繁，6 周之后統(tǒng)計(jì)出芽率。出芽率（%）=（再生芽數(shù)/愈傷組織總數(shù)）×100。確定愈傷組織分化的最佳培養(yǎng)基配方以SIM命名。

表3 3種激素配比對(duì)愈傷組織分化出芽影響的試驗(yàn)（mg/L）Table 3 Tests on ratios of three phytohormones for shoot induction

1.2.7 愈傷組織誘導(dǎo)和芽分化抗生素的篩選

將共培養(yǎng)2 d 后的外植體莖段置于愈傷組織誘導(dǎo)培養(yǎng)基上，待愈傷組織形成后轉(zhuǎn)移至含有不同濃度潮霉素（0，5，10，15，30 和40 mg/L）的SIM1 培養(yǎng)基上誘導(dǎo)愈傷組織，每?jī)芍芨鼡Q一次培養(yǎng)基直至出芽，每組試驗(yàn)的莖段數(shù)為20 個(gè)/培養(yǎng)皿，3 次重復(fù)。培養(yǎng)條件同上述的試管苗擴(kuò)繁，統(tǒng)計(jì)出苗率。出苗率（%）=（再生植株數(shù)/愈傷組織總數(shù)）×100。

1.2.8 生根培養(yǎng)時(shí)抗生素濃度的篩選

將未轉(zhuǎn)化的含有腋芽的馬鈴薯外植體扦插到含有不同濃度潮霉素（0，5，10，15，30 和40 mg/L）的RIM 培養(yǎng)基中進(jìn)行生根處理，每個(gè)培養(yǎng)瓶中放入10 株，3 次重復(fù)。培養(yǎng)條件同上述的試管苗擴(kuò)繁，大約3 周之后統(tǒng)計(jì)生根率。生根率（%）=（生根外植體數(shù)/外植體總數(shù)）×100。

1.2.9 最佳抑菌抗生素種類(lèi)及濃度的篩選

將共培養(yǎng)2 d 后的外植體莖段置于含有不同抗生素種類(lèi)及濃度的CIM3 培養(yǎng)基上進(jìn)行愈傷組織的誘導(dǎo)。抗生素的種類(lèi)包括頭孢霉素（Cefotaxime，Cef）和特美汀（Timentin， TMT），濃度分別為0，100，200和300 mg/L。每組試驗(yàn)的莖段數(shù)為20個(gè)/培養(yǎng)皿，3 次重復(fù)。培養(yǎng)條件同上述的試管苗擴(kuò)繁，15 d后統(tǒng)計(jì)觀察抑菌情況及愈傷組織生長(zhǎng)狀態(tài)。

1.2.10 轉(zhuǎn)化再生植株的PCR檢測(cè)

采用CTAB 法提取再生馬鈴薯植株葉片的基因組DNA。以載體上的序列及基因組上的序列為基 礎(chǔ) 設(shè) 計(jì) 引 物 序 列 F： 5′-AGGTGGCTCCTACAAATGCCACT-3′；R：5′-GTGTCACTGATGAGAAGCCAAAATGACCTTTC-3′，PCR 擴(kuò) 增 產(chǎn) 物 的 大小為1 000 bp。PCR 擴(kuò)增的反應(yīng)程序?yàn)椋?5℃預(yù)變性3 min；95℃變性30 s，60℃退火30 s；72℃延伸30 s，35 個(gè)循環(huán)；72℃延伸 10 min。PCR 產(chǎn)物用1.2%瓊脂糖凝膠電泳進(jìn)行檢測(cè)。

2 結(jié)果與分析

2.1 最佳預(yù)培養(yǎng)時(shí)間的確定

為了探究‘并薯6 號(hào)’的最佳預(yù)培養(yǎng)時(shí)間，共設(shè)置了5 個(gè)預(yù)培養(yǎng)的時(shí)間梯度，分別為0，1，2，3 和 4 d。用 OD 值為 0.6 的農(nóng)桿菌菌液浸染 10 min，共培養(yǎng)2 d 后置于愈傷組織誘導(dǎo)培養(yǎng)基上，培養(yǎng)5周后觀察愈傷組織的生長(zhǎng)狀態(tài)，并統(tǒng)計(jì)愈傷組織形成率。然后將上述的愈傷組織轉(zhuǎn)移到愈傷組織分化培養(yǎng)基上，大約7 周后統(tǒng)計(jì)出苗率及轉(zhuǎn)化頻率。結(jié)果表明，不同預(yù)培養(yǎng)時(shí)間對(duì)外植體形成愈傷組織存在一定的差異。未經(jīng)過(guò)預(yù)培養(yǎng)的外植體易發(fā)生白化或褐化最后死亡的現(xiàn)象，很難形成愈傷組織。經(jīng)過(guò)預(yù)培養(yǎng)后的外植體都可以形成愈傷組織。其中預(yù)培養(yǎng)2 d 外植體的愈傷組織形成率、出苗率及轉(zhuǎn)化頻率均最高，預(yù)培養(yǎng)3 和2 d 外植體的愈傷組織形成率和出苗率差異不大，轉(zhuǎn)化頻率次之。而預(yù)培養(yǎng)1 和4 d 外植體的愈傷組織形成率、出苗率及轉(zhuǎn)化頻率較低（表4）。因此，最佳的預(yù)培養(yǎng)時(shí)間為2 d。

表4 預(yù)培養(yǎng)時(shí)間對(duì)愈傷組織形成和分化的影響Table 4 Effects of pre-culture time on callus induction and differentiation

2.2 不同激素種類(lèi)及配比對(duì)外植體愈傷組織形成的影響

將外植體預(yù)培養(yǎng)2 d 后，用OD 值為0.6 的農(nóng)桿菌菌液浸染10 min，共培養(yǎng)2 d 后置于愈傷組織誘導(dǎo)培養(yǎng)基CIM1、CIM2、CIM3 和CIM4 上，培養(yǎng)5 周后，觀察愈傷組織的狀態(tài)并統(tǒng)計(jì)愈傷組織形成率（表5）。結(jié)果表明，CIM3 的愈傷組織形成率最高，外植體傷口處膨大形成白色的愈傷組織，且形態(tài)較緊密；外植體表面幾乎沒(méi)有白色須狀物和毛狀根。CIM4 的愈傷組織形成率次之，多數(shù)外植體傷口處膨大形成白色的愈傷組織，外植體表面幾乎沒(méi)有白色須狀物和毛狀根。CIM1 和CIM2的愈傷組織形成率較低。CIM1 的一些外植體傷口處膨大形成愈傷組織，且表面白色須狀物和毛狀根較多。CIM2 的外植體傷口處膨大，且表面的白色須狀物較多（圖2）。

表5 不同激素種類(lèi)及配比對(duì)莖段愈傷組織誘導(dǎo)的影響Table 5 Effects of different hormones and ratios on callus induction

圖2 在不同類(lèi)型培養(yǎng)基上外植體愈傷組織誘導(dǎo)及分化的過(guò)程Figure 2 Callus induction and differentiation processes of explants on different media

2.3 不同激素種類(lèi)及配比對(duì)愈傷組織分化的影響

將上述處于 CIM1、CIM2、CIM3 和 CIM4 培養(yǎng)基上的愈傷組織分別平移于愈傷組織分化培養(yǎng)基SIM1 和SMI2 上，愈傷組織的體積逐漸的增大。培養(yǎng)3 周后，愈傷組織的底部可見(jiàn)綠色芽點(diǎn)的分化。待培養(yǎng)時(shí)間達(dá)到7 周后，在愈傷組織的芽點(diǎn)處分化出帶有葉子的芽并從底部延伸出來(lái)。不同激素種類(lèi)及配比對(duì)愈傷組織的分化具有一定的影響（表6）。與SIM2培養(yǎng)基相比較，SIM1培養(yǎng)基誘導(dǎo)愈傷組織分化的效果最佳，分化出的苗較粗壯，長(zhǎng)勢(shì)良好，且有些外植體上有多個(gè)芽的分化。其中CIM3+SIM1的愈傷組織分化的效率最高（圖2）。

表6 不同激素種類(lèi)及配比對(duì)莖段愈傷組織分化出苗的影響Table 6 Effects of different hormones and ratios on callus differentiation and shoot induction

2.4 不同潮霉素濃度對(duì)植株再生的影響

利用上述篩選出來(lái)的最佳愈傷組織誘導(dǎo)及分化的最佳培養(yǎng)基組合CIM3 + SIM1，對(duì)芽分化階段的最佳抗生素濃度進(jìn)行篩選。將預(yù)培養(yǎng)2 d 的外植體經(jīng)過(guò)農(nóng)桿菌浸染及共培養(yǎng)后置于愈傷組織誘導(dǎo)培養(yǎng)基CIM3 上，生長(zhǎng)約5 周后，誘導(dǎo)形成愈傷組織。將形成的愈傷組織轉(zhuǎn)移到含有不同潮霉素濃度的SIM1 培養(yǎng)基上，誘導(dǎo)芽的分化，每?jī)芍軗Q一次培養(yǎng)基。大約培養(yǎng)7 周后，統(tǒng)計(jì)再生芽的數(shù)目并計(jì)算出苗率及轉(zhuǎn)化頻率（表7）。當(dāng)潮霉素的濃度為0 和5 mg/L 時(shí)，愈傷組織生長(zhǎng)正常，對(duì)芽的分化也沒(méi)有太大的影響，無(wú)法起到篩選的作用。當(dāng)潮霉素的濃度為10 mg/L 時(shí)，部分愈傷組織的生長(zhǎng)受到抑制，出芽也明顯受到抑制（圖3），潮霉素起到了一定的篩選作用，因此轉(zhuǎn)化頻率較高。當(dāng)潮霉素的濃度達(dá)到15 和30 mg/L 時(shí)，經(jīng)過(guò)一段時(shí)間的培養(yǎng)后，大部分的愈傷組織生長(zhǎng)受到抑制并逐漸褐化，出苗率很低且再生苗長(zhǎng)勢(shì)較弱甚至畸形，高濃度的潮霉素對(duì)外植體起到了毒害作用。當(dāng)潮霉素的濃度達(dá)到40 mg/L 時(shí)，愈傷組織幾乎全部趨于死亡，無(wú)法得到再生芽。由此可知，當(dāng)潮霉素的濃度為10 mg/L 時(shí)，即能保證產(chǎn)生抗性芽，又能保證出苗率及轉(zhuǎn)化頻率，是最佳的植株再生篩選的抗生素濃度。

圖3 不同潮霉素濃度下再生植株的生長(zhǎng)狀態(tài)Figure 3 Growth status of regenerated shoots under different hygromycin B concentrations

表7 不同潮霉素濃度對(duì)再生的影響Table 7 Effects of different hygromycin B concentrations on regeneration

2.5 不同潮霉素濃度對(duì)再生苗生根的影響

為了確定最適的再生苗生根的潮霉素濃度，將野生型的含有腋芽的馬鈴薯莖段扦插到含有不同潮霉素濃度的RIM培養(yǎng)基中進(jìn)行培養(yǎng)，大約8周后統(tǒng)計(jì)生根率（表8）。當(dāng)潮霉素的濃度為0和5 mg/L時(shí)，馬鈴薯植株都可以生根。當(dāng)潮霉素的濃度高于或等于10 mg/L 時(shí)，馬鈴薯植株都無(wú)法生根，并最后趨于死亡（圖4）。因此，當(dāng)潮霉素的濃度為10 mg/L 時(shí)，未轉(zhuǎn)化的再生苗無(wú)法生根而死亡，轉(zhuǎn)化的再生苗具有一定的抗性可以正常的生根而生長(zhǎng)。所以，10 mg/L 的潮霉素為再生苗生根的最佳篩選濃度。

圖4 不同潮霉素濃度下再生植株的生根狀態(tài)Figure 4 Growth status of rooting of regenerated shoots under different hygromycin B concentrations

表8 不同潮霉素濃度對(duì)再生苗生根的影響Table 8 Effects of different hygromycin B concentrations on rooting of regenerated shoots

2.6 不同抑菌劑的種類(lèi)及濃度對(duì)轉(zhuǎn)化的影響

當(dāng)農(nóng)桿菌菌液浸染外植體后，后續(xù)的試驗(yàn)需要進(jìn)行抑菌處理。適宜的抑菌劑濃度不僅可以抑制農(nóng)桿菌的生長(zhǎng)，同時(shí)也不會(huì)毒害植株。將共培養(yǎng)2 d 后的莖段置于愈傷組織誘導(dǎo)培養(yǎng)基上，培養(yǎng)2周后觀察抑菌情況和愈傷組織生長(zhǎng)情況（表9）。當(dāng)選用的抑菌劑為頭孢霉素時(shí)，不論其濃度為100、200 或300 mg/L 都無(wú)法抑制農(nóng)桿菌的生長(zhǎng)，外植體也無(wú)法正常的進(jìn)行愈傷組織的誘導(dǎo)。當(dāng)選用的抑菌劑為100 mg/L特美汀時(shí)，無(wú)法有效的抑制農(nóng)桿菌的生長(zhǎng)；當(dāng)特美汀的濃度達(dá)到200 mg/L 時(shí)，可以有效的抑制農(nóng)桿菌的生長(zhǎng)，并且可以正常的進(jìn)行愈傷組織誘導(dǎo)及芽的分化；當(dāng)特美汀的濃度為300 mg/L 時(shí)，可以有效的抑制農(nóng)桿菌的生長(zhǎng)，但是抑菌劑濃度過(guò)高對(duì)愈傷組織誘導(dǎo)及芽的分化有一定的影響（圖5）。因此，選用200 mg/L 的特美汀為最佳的遺傳轉(zhuǎn)化的抑菌劑濃度。

圖5 不同抑菌抗生素種類(lèi)和濃度下愈傷組織的生長(zhǎng)狀態(tài)Figure 5 Growth status of callus under different antibiotics and concentrations

表9 不同抑菌抗生素種類(lèi)及濃度的抑菌試驗(yàn)Table 9 Results of antimicrobial tests for different antibiotics and concentrations

2.7 再生植株的陽(yáng)性檢測(cè)

通過(guò)上述對(duì)預(yù)培養(yǎng)時(shí)間、愈傷組織誘導(dǎo)及分化階段不同激素組合的篩選，確定了再生率較高的培養(yǎng)基類(lèi)型。根據(jù)上述試驗(yàn)得到的最適條件進(jìn)行新的遺傳轉(zhuǎn)化，最終共得到了58 株再生馬鈴薯植株。將獲得的再生植株轉(zhuǎn)移到生根培養(yǎng)基上進(jìn)行篩選后得到了22 株抗性植株。提取再生抗性植株的葉片基因組DNA，經(jīng)過(guò)PCR 擴(kuò)增后，共有6株植株的基因組DNA 可以擴(kuò)增出1 000 bp 的條帶，與陽(yáng)性對(duì)照擴(kuò)增條帶大小一致。因此，馬鈴薯‘并薯6號(hào)’的遺傳轉(zhuǎn)化效率約為27.3%（圖6）。

圖6 再生植株的PCR陽(yáng)性檢測(cè)Figure 6 Positive detection of regenerated plants by PCR

3 討 論

外植體經(jīng)過(guò)預(yù)培養(yǎng)后通過(guò)調(diào)整其生理狀態(tài)，減輕脅迫傷害，促進(jìn)細(xì)胞分裂，使細(xì)胞處于易轉(zhuǎn)化狀態(tài)，有利于整合外源基因組，從而可以提高遺傳轉(zhuǎn)化的效率[16]。熊偉等[17]和葉明旺等[18]以馬鈴薯品種‘PB04’和二倍體馬鈴薯為材料，預(yù)培養(yǎng)2 d 后的外植體抗性愈傷組織誘導(dǎo)率最高。張西英等[19]研究表明，預(yù)培養(yǎng)2 d 的馬鈴薯外植體分化率和轉(zhuǎn)化率最高。因此，預(yù)培養(yǎng)對(duì)外植體的再生及遺傳轉(zhuǎn)化具有一定的影響。本研究結(jié)果表明，未經(jīng)過(guò)預(yù)培養(yǎng)的外植體易發(fā)生白化或褐化最后死亡的現(xiàn)象，很難形成愈傷組織。預(yù)培養(yǎng)2 d 外植體的愈傷組織形成率和出苗率最高，預(yù)培養(yǎng)3 和2 d 外植體的愈傷組織形成率和出苗率差異不大，而預(yù)培養(yǎng)1 和4 d 外植體的愈傷組織形成率和出苗率較低。因此，本試驗(yàn)中，馬鈴薯外植體的最佳預(yù)培養(yǎng)時(shí)間為2 d。未經(jīng)過(guò)預(yù)培養(yǎng)的外植體浸染農(nóng)桿菌后容易死亡，預(yù)培養(yǎng)時(shí)間過(guò)長(zhǎng)導(dǎo)致外植體傷口處的愈傷組織已經(jīng)形成，影響農(nóng)桿菌的浸染，進(jìn)而影響遺傳轉(zhuǎn)化的效率[19]。

馬鈴薯的組織再生受到外植體類(lèi)型及基因型的影響，不同的外植體類(lèi)型及基因型所需的最適再生體系是不同的。羅源[20]研究結(jié)果表明，以‘克新13號(hào)’‘克新12號(hào)’‘東農(nóng)303’和‘早大白’的莖段作為外植體，最適的愈傷組織誘導(dǎo)培養(yǎng)基為MS+30 g/L 蔗糖+8 g/L 瓊脂+2 mg/L 6-BA+1 mg/L 2,4-D 和 MS + 30 g/L 蔗 糖 + 8 g/L 瓊 脂 + 2 mg/L 6-BA+0.5 mg/L 2,4-D；最適愈傷組織分化培養(yǎng)基為MS+6-BA 4.0 mg/L+NAA 0.1 mg/L+GA31.0 mg/L，MS+6-BA 2.0 mg/L+NAA 0.5 mg/L+GA31.0 mg/L，MS+6-BA 2.0 mg/L+NAA 0.1 mg/L+GA31.5 mg/L和MS+6-BA 2.0 mg/L+NAA 0.5 mg/L+GA31.0 mg/L。邱礽等[21]研究結(jié)果表明，以‘夏坡蒂’和‘費(fèi)烏瑞它’的莖段作為外植體，最適的愈傷組織誘導(dǎo)培養(yǎng)基分別為MS + 6-BA 2.0 mg/L + NAA 0.5 mg/L + GA30.5 mg/L 和MS+ZT 2.0 mg/L+0.1 mg/L NAA+GA30.5 mg/L；不定芽誘導(dǎo)最佳培養(yǎng)基分別為MS+ZT 2.0 mg/L + 0.1 mg/L NAA + GA35 mg/L 和MS +6-BA 2.0 mg/L+ZT 2.0 mg/L+GA35 mg/L。張之為等[22]研究結(jié)果表明，以‘底西瑞’‘費(fèi)烏瑞它’‘紫花白‘’夏坡蒂‘’大西洋’和‘虎頭’6 個(gè)品種的葉片為外植體，6-BA 和GA3對(duì)馬鈴薯葉片愈傷組織生長(zhǎng)量和不定芽分化率有影響。李晶[23]研究結(jié)果表明，以馬鈴薯‘東農(nóng)303’的莖段和薯塊為外植體，莖段最佳愈傷組織誘導(dǎo)培養(yǎng)基為MS+0.1 mg/L 2,4-D+1 mg/L BA，薯塊最佳愈傷組織誘導(dǎo)及分化培養(yǎng)基均為MS+2 mg/L ZT+1 mg/L IAA。以莖段作為外植體時(shí)，相同濃度下，2,4-D 誘導(dǎo)愈傷組織的能力優(yōu)于NAA[24]。在愈傷組織分化過(guò)程中，6-BA 起到主要作用，但其濃度過(guò)高則會(huì)影響芽的分化[25]。GA3對(duì)馬鈴薯幼苗的分化和伸長(zhǎng)具有明顯的促進(jìn)作用[26]。另外，在培養(yǎng)基中加入ZT 對(duì)‘東農(nóng)303’莖段的芽誘導(dǎo)具有很好的效果[27]。在本研究中，利用植物激素6-BA、NAA、2,4-D、KT 和GA3對(duì)‘并薯6號(hào)’愈傷組織誘導(dǎo)研究發(fā)現(xiàn)，利用2,4-D 有利于愈傷組織的誘導(dǎo)，利用ZT 有利于叢生芽的分化。當(dāng)生長(zhǎng)素與細(xì)胞分裂素的濃度及比例適合時(shí)，愈傷組織的誘導(dǎo)率和分化率較高。

在農(nóng)桿菌介導(dǎo)的植物遺傳轉(zhuǎn)化的各個(gè)階段中，需要向培養(yǎng)基中添加各類(lèi)抗生素，但是添加的抗生素往往會(huì)影響外植體愈傷組織的誘導(dǎo)和分化，因此抗生素的種類(lèi)及濃度是植物遺傳轉(zhuǎn)化過(guò)程中的重要環(huán)節(jié)。抑制農(nóng)桿菌生長(zhǎng)的抗生素一般都是頭孢霉素（Cef）和羧芐青霉素（Carb）。但是由于馬鈴薯對(duì)Carb 毒害的忍受力較弱，所以在馬鈴薯遺傳轉(zhuǎn)化過(guò)程中最常使用的是Cef[28]。在本研究中使用的抑菌劑為Cef 和特美?。═MT），通過(guò)研究發(fā)現(xiàn)，同樣濃度下，TMT 的抑菌效果優(yōu)于Cef，并且較低濃度的TMT 就可以達(dá)到較好的抑菌效果。抑菌劑不僅可以抑制農(nóng)桿菌的生長(zhǎng)，同樣也會(huì)影響植物的正常生長(zhǎng)和分化。選擇合適種類(lèi)的抑菌劑及其濃度在達(dá)到抑菌效果的同時(shí)又對(duì)植物再生影響較小，從而也可以提高植物的遺傳轉(zhuǎn)化效率。

農(nóng)桿菌介導(dǎo)的植物遺傳轉(zhuǎn)化是一個(gè)復(fù)雜的過(guò)程。由于不同植物的基因型存在顯著差異，因此不同植物對(duì)遺傳轉(zhuǎn)化過(guò)程中的各種因素的敏感度也不同，遺傳轉(zhuǎn)化的效率存在很大的差異[29]。雖然農(nóng)桿菌介導(dǎo)的馬鈴薯愈傷再生轉(zhuǎn)化體系已經(jīng)比較成熟，并且在馬鈴薯分子育種中也得到了一定應(yīng)用。但是對(duì)于不同基因型馬鈴薯遺傳轉(zhuǎn)化效率問(wèn)題仍存在很大差異。在馬鈴薯育種過(guò)程中，馬鈴薯基因型復(fù)雜性及自交不親和性等問(wèn)題限制了雜交育種的進(jìn)程。因此通過(guò)將優(yōu)異外源基因?qū)氲今R鈴薯中來(lái)實(shí)現(xiàn)品種改良是一種很好的選擇，而不同基因型馬鈴薯遺傳轉(zhuǎn)化再生體系的建立是非常必要的[30]。本研究通過(guò)對(duì)馬鈴薯品種‘并薯6號(hào)’愈傷再生轉(zhuǎn)化體系建立各個(gè)階段的影響因素進(jìn)行研究，初步建立該馬鈴薯品種的農(nóng)桿菌介導(dǎo)的遺傳轉(zhuǎn)化體系，為馬鈴薯基因功能驗(yàn)證、分子育種和品質(zhì)改良奠定了基礎(chǔ)。