肥兒散質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)研究

孔國勇，李慧雯，鄭惠韻，翁立冬

(1 廣州市番禺醫(yī)藥質(zhì)量管理協(xié)會，廣東 廣州 511400；2 南方醫(yī)科大學(xué)中醫(yī)藥學(xué)院，廣東 廣州 510515)

肥兒散由白術(shù)、甘草、山藥、茯苓、南山楂和雞內(nèi)金等6味藥材制成，具有健脾、消食、化積等作用，用于治療脾胃不和引起的脾虛泄瀉、消化不良、面黃肌瘦、疳積腹脹[1-2]。《中國藥典》2020版尚未收載該成藥，目前該成藥被收載于國家衛(wèi)生部中藥部頒標(biāo)準(zhǔn)21冊，標(biāo)準(zhǔn)編號為WS3-B-3885-98。原標(biāo)準(zhǔn)中只有顯微鑒別項，缺乏控制該制劑質(zhì)量的有關(guān)研究，準(zhǔn)確性、專屬性較低。本研究選用薄層色譜法鑒別方中白術(shù)、甘草、山藥、茯苓、南山楂和雞內(nèi)金，用高效液相色譜法對甘草酸進(jìn)行含量測定，研究如下。

1 儀器與試藥

PTY-124/105型十萬分之一電子天平，上海諾萱科學(xué)儀器有限公司；GoodLook-2000型全自動薄層色譜成像儀，上?？普苌萍加邢薰荆籆R-020S型超聲波清洗機，深圳市春霖清洗設(shè)備有限公司； 1260型高效液相色譜儀，美國Agilent；硅膠G薄層板，自制。

甘草酸銨對照品(批號110731-200513)及各對照藥材，均購自中國食品藥品檢定研究院；肥兒散(批號：20130701、20130920、20131025)，汕頭市時代制藥有限公司；乙腈為(色譜純)，德國默克；水為雙蒸水；其它試劑購自廣州化學(xué)試劑廠，為分析純。

2 實驗方法

2.1 薄層色譜鑒別

2.1.1 白術(shù)[3-4]

圖1 白術(shù)薄層色譜圖

取本品6 g，加醋酸乙酯30 mL超聲提取20 min，過濾，濾液揮干醋酸乙酯，剩余殘渣加環(huán)己烷1 mL溶解作為供試品溶液。取白術(shù)對照藥材1 g，加醋酸乙酯10 mL同上述處理制成對照藥材溶液。照薄層色譜法，吸取兩種溶液各10 μL，點于硅膠G薄層板上，用石油醚(60～90 ℃)-醋酸乙酯(7.5:0.5)比例作為展開劑，展開，取出，晾干，噴5%香草醛硫酸溶液，在105 ℃加熱至斑點顯色清晰。供試品色譜與白術(shù)對照藥材色譜相應(yīng)位置上，顯相同顏色的斑點。

2.1.2 山藥[5-6]

取本品6 g，加甲醇30 mL超聲提取30 min，過濾，濾液濃縮至約1 mL作為供試品溶液。取山藥對照藥材1 g，加甲醇 20 mL同上述處理制成對照藥材溶液。照薄層色譜法，吸取兩種溶液各10 μL，點于硅膠G薄層板上，用環(huán)己烷-丙酮(5:1.5)比例作為展開劑，展開，取出，晾干，噴10%硫酸乙醇溶液，在105 ℃加熱至斑點顯色清晰，然后置紫外光燈(365 nm)下檢視。供試品色譜與山藥對照藥材色譜相應(yīng)位置上，顯相同顏色的熒光斑點，見圖2。

圖2 山藥薄層色譜圖

2.1.3 甘草[7-8]

取本品6 g，加乙醚40 mL水浴加熱回流1 h，過濾，藥渣加甲醇30 mL加熱回流1 h，過濾，濾液蒸干，剩余殘渣加水20 mL溶解，用正丁醇萃取三次，每次20 mL，合并正丁醇液，用水洗滌3次，取正丁醇液蒸干，剩余殘渣加甲醇5 mL溶解作為供試品溶液。取甘草對照藥材1 g，同上述處理制成對照藥材溶液。照薄層色譜法，吸取兩種溶液各5 μL，點于硅膠G薄層板上，用石油醚(60～90 ℃)-甲苯-醋酸乙酯-冰乙酸(5:10:3.5:0.25)比例作為展開劑，展開，取出，晾干，噴10%硫酸乙醇溶液，在105 ℃加熱至斑點顯色清晰，置紫外光燈(365 nm)下檢視。供試品色譜與甘草對照藥材色譜相應(yīng)位置上，顯相同顏色的熒光斑點，見圖3。

圖3 甘草薄層色譜圖

2.1.4 南山楂[9-10]

取本品6 g，加醋酸乙酯30 mL超聲提取30 min，過濾，濾液蒸干，剩余殘渣加正己烷1 mL溶解作為供試品溶液。另取南山楂對照藥材1 g，加醋酸乙酯10 mL，同上述處理制成對照藥材溶液。照薄層色譜法，吸取供試品溶液10 μL、對照藥材溶液5 μL，點于硅膠G薄層板上，用甲苯-醋酸乙酯-甲酸(10: 2:0.25)比例作為展開劑，展開，取出，晾干，噴10%硫酸乙醇溶液，在80 ℃加熱至斑點顯色清晰。供試品色譜與南山楂對照藥材色譜相應(yīng)位置上，顯相同顏色的斑點；置紫外光燈(365 nm)下檢視，顯相同的橙黃色熒光斑點，見圖4。

圖4 南山楂薄層色譜圖

2.1.5 茯苓和雞內(nèi)金[11-12]

取本品6 g，加乙醚40 mL超聲提取30 min，過濾，濾液揮干，剩余殘渣加正己烷1 mL溶解作為供試品溶液。另分別取茯苓對照藥材和雞內(nèi)金對照藥材各1 g，各加乙醚20 mL同上述處理制成茯苓對照藥材溶液和雞內(nèi)金對照藥材溶液。照薄層色譜法，吸取供試品溶液10 μL、茯苓對照藥材溶液和雞內(nèi)金對照藥材溶液各5 μL，點于硅膠G薄層板上，用氯仿-醋酸乙酯-甲酸(5:0.5:0.1)比例作為展開劑，展開，取出，晾干，置紫外光燈(365 nm)下檢視。供試品色譜與茯苓、雞內(nèi)金對照藥材色譜相應(yīng)位置上，顯相同顏色的熒光斑點，見圖5。

圖5 茯苓、雞內(nèi)金薄層色譜圖

2.2 含量測定

2.2.1 溶液制備

2.2.1.1 對照品溶液

精密稱定甘草酸銨對照品16 mg，精密加入流動相溶液 500 mL，超聲使溶解，即得每1 mL含甘草酸銨32 μg的對照品標(biāo)準(zhǔn)液，相當(dāng)于每1 mL含甘草酸31.344 μg·mL-1。

2.2.1.2 供試品溶液

精密稱取本品約0.3 g，置具塞錐形瓶中，精密加入流動相溶液25 mL，密塞，稱重，浸泡1 h，再超聲處理30 min，放冷，稱重，用流動相溶液補足重量，搖勻，用微孔濾膜濾過，即得。

2.2.1.3 陰性溶液

按處方各味藥材比例，稱取除甘草外的其余藥材，先按制備工藝制得陰性樣品，再按供試品溶液制備方法制成陰性溶液。

2.2.2 色譜條件[13]

色譜柱：Agilent C18柱，250 mm × 4.6 mm，5 μm；流動相：乙腈-0.015 mol·L-1磷酸溶液(39:61)；柱溫：25 ℃；流速：1 mL·min-1；檢測波長：250 nm。

2.2.3 系統(tǒng)適應(yīng)性分析實驗

2.2.3.1 專屬性

取上述三種溶液注入色譜儀，進(jìn)樣量10 μL。甘草酸(銨)在10～11 min之間有特征吸收峰，說明該色譜條件的方法專屬性較好，見圖6。

圖6 甘草酸高效液相色譜圖

2.2.3.2 線性關(guān)系

分別精密吸取對照品標(biāo)準(zhǔn)液4、8、12、16、20 μL，注入色譜儀，以測得的甘草酸峰面積S為橫坐標(biāo)，含量m為縱坐標(biāo)，經(jīng)線性分析得回歸方程為：m=0.0014S+0.0018(R2=1)，結(jié)果表明甘草酸在0.125376～0.62688 μg范圍內(nèi)呈良好的線性關(guān)系，見表1。

表1 甘草酸線性關(guān)系

2.2.3.3 精密度

對照品標(biāo)準(zhǔn)液連續(xù)進(jìn)樣5次，每次10 μL，測定，計算峰面積的RSD為0.33%，表明儀器的精密度良好，結(jié)果見表2。

2.2.3.4 重復(fù)性

精密稱取樣品6份，按“2.2.1.2”項下制成6份溶液，以10 μL進(jìn)樣分析，測得峰面積，計算甘草酸的平均含量為3.7453 mg·g-1，RSD為0.72%，表明實驗重復(fù)性良好，結(jié)果見表2。

2.2.3.5 穩(wěn)定性

精密稱取樣品，按“2.2.1.2”項下制成溶液，分別設(shè)定時間為0，5，10，15，20，24 h時進(jìn)樣10 μL分析，計算峰面積的RSD為0.31%，表明供試品溶液在至少24 h內(nèi)測定時穩(wěn)定，結(jié)果見表2。

表2 精密度、重復(fù)性和穩(wěn)定性等實驗結(jié)果

2.2.3.6 加樣回收率試驗

分別取6份同一批已知甘草酸含量(3.7453 mg·g-1)的樣品0.15 g，精密稱重，置于6只具塞錐形瓶中，各精密加入含甘草酸的標(biāo)準(zhǔn)品溶液(31.344 μg/mL)18mL，再精密加入流動相溶液7 mL，密塞，稱重，浸泡1 h，再超聲處理30 min，放冷，稱重，用流動相溶液補足重量，搖勻，用微孔濾膜濾過，各以10 μL進(jìn)樣，計算含量、回收率和RSD，結(jié)果見表3。

表3 甘草酸加樣回收率試驗

2.2.4 含量測定結(jié)果

取樣品三批，按供試品溶液制備方法制備3份樣品，按色譜條件進(jìn)樣分析，測定甘草酸含量，三批肥兒散樣品中甘草酸的平均含量約為3.7087 mg·g-1，結(jié)果見表4。

表4 樣品含量測定結(jié)果

3 討 論

3.1 薄層色譜方法選擇

本次實驗中除雞內(nèi)金外其余白術(shù)、甘草、山藥、茯苓和山楂等藥材均在《中國藥典》2020年版一部中有收載薄層色譜鑒別方法[3，5，7，9，11]，亦參考了一些文獻(xiàn)報道的鑒別方法[4,6,8,10,12]，綜合分析之后選定了以上正文條件。其中白術(shù)鑒別時展開劑比例為石油醚(60～90 ℃)-醋酸乙酯(15:1)時較比例為石油醚(60～90 ℃)- 醋酸乙酯(50:1)能更好地達(dá)到分離鑒別；山藥鑒別采用文獻(xiàn)的提取及顯色方法比藥典的方法能更清晰地鑒別；茯苓及雞內(nèi)金二者因皆含有蛋白質(zhì)和氨基酸成分[14～15]，鑒別時陰性產(chǎn)生干擾，經(jīng)過多次試驗，最終決定采用雙陰性可達(dá)到進(jìn)行鑒別。

3.2 薄層色譜方法考察

對建立的薄層色譜方法進(jìn)行了色譜條件考察，通過不同薄層板(實驗室自制薄層板與青島海洋化工廠生產(chǎn)的預(yù)制板)進(jìn)行了對比，均可鑒別。亦選擇了不同的溫濕度進(jìn)行考察，亦均可鑒別。

3.3 流動相選擇

甘草藥材中的甘草酸是其特征成分，性質(zhì)較穩(wěn)定[16]，測定其含量可有效控制產(chǎn)品質(zhì)量。已有文獻(xiàn)報道過肥兒散中甘草酸銨的含量測定[13]，流動相為乙腈-0.015 mol·L-1磷酸(40:60)，但實驗發(fā)現(xiàn)，主峰拖尾嚴(yán)重。嘗試調(diào)節(jié)流動相的比例為乙腈-0.015 mol·L-1磷酸(39:61)時，效果較好，分離度、拖尾因子、塔板理論數(shù)都達(dá)到要求。