骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞治療大鼠慢加急性肝衰竭的實(shí)驗(yàn)研究

郭金偉

（中國(guó)科學(xué)院大學(xué)深圳醫(yī)院（西院區(qū)）感染性疾病科，廣東深圳518106）

慢加急性肝衰竭是指肝功能相對(duì)穩(wěn)定的慢性肝病患者在各種急性損傷因素作用下病情迅速惡化的肝衰竭綜合征，臨床表現(xiàn)為尿色進(jìn)行性加深、極度乏力、嚴(yán)重凝血功能障礙、嚴(yán)重消化道癥狀等，病情兇險(xiǎn)、病死率較高[1-3]。治療慢加急性肝衰竭重點(diǎn)在于減少肝細(xì)胞壞死、刺激肝細(xì)胞再生。骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞（bone marrow mesenchymal stem cells，BMSCs）為成體干細(xì)胞，具有來(lái)源廣泛、免疫原性低、可塑性強(qiáng)等優(yōu)勢(shì)，能在體外分解成多種成體細(xì)胞，可作為各種組織損傷或器官衰竭的替代療法[4-5]?；诖耍狙芯恐荚谔骄抗撬栝g充質(zhì)干細(xì)胞治療大鼠慢加急性肝衰竭的效果，現(xiàn)報(bào)道如下。

1 對(duì)象與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物選取40只周齡12周的清潔級(jí)SD成年雄性大鼠，體質(zhì)量約為200 g，合格證號(hào)：SYYK（浙）2010-0150，均購(gòu)自溫州醫(yī)科大學(xué)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心。本實(shí)驗(yàn)已通過(guò)動(dòng)物研究委員會(huì)同意。

1.2 實(shí)驗(yàn)儀器及試劑日本日立公司生產(chǎn)的7600-010全自動(dòng)生化分析儀；D-氨基半乳糖購(gòu)自重慶醫(yī)科大學(xué)化學(xué)教研室；免疫組化試劑盒購(gòu)自北京中杉金橋生物技術(shù)有限公司；BCL2-associated x蛋白質(zhì)（BCL2-associated X protein，Bax）、B淋巴細(xì)胞瘤-2基因（B-cell lymphoma-2，Bcl-2）、增殖細(xì)胞核抗原（proliferating cell nuclear antigen，PCNΑ）一抗均購(gòu)自美國(guó)Santa Cruze公司；Percoll分離液購(gòu)自美國(guó)Sigma公司。

1.3 方法

1.3.1 動(dòng)物分組與處理采用隨機(jī)數(shù)字表法將40只大鼠分為模型組與用藥組，每組20只。兩組大鼠均正常喂養(yǎng)。兩組大鼠經(jīng)腹腔注射10%D-氨基半乳糖1.25 g/kg，以誘導(dǎo)大鼠急性肝衰竭模型。造模后12 h，用藥組經(jīng)尾靜脈注射1.5 mL BMSCs懸液，而模型組注射等體積無(wú)菌PBS。治療3 d后，兩組均腹腔注射水合氯醛進(jìn)行麻醉，無(wú)菌條件下取門(mén)靜脈血3～5 mL，離心取上清液，放置于-80℃冰箱中保存待檢。所有動(dòng)物在最后一次用藥后48 h內(nèi)進(jìn)行頸椎脫臼法處死，取肝組織，甲醛固定。

1.3.2 檢測(cè)方法①肝臟功能。使用全自動(dòng)生化分析儀測(cè)量?jī)山M大鼠肝臟功能，包括天冬氨酸轉(zhuǎn)氨酶（aspartate animotransferase，ΑST）、丙氨酸轉(zhuǎn)氨酶（alanine animotransferase，ΑLT）、血白蛋白（albumin，Αlb）、總膽紅素（total bilirubin，TBil）。②肝組織Bax、Bcl-2、PCNΑ蛋白檢測(cè)。石蠟包埋處理肝組織后，連續(xù)切成4 μm切片，脫蠟復(fù)水，3%過(guò)氧化氫于室溫下孵育10 min，蒸餾水沖洗后，置于磷酸鹽緩沖溶液（phosphate buffered solution，PBS）中浸泡，用10%正常山羊血清封閉，滴加一抗，4℃過(guò)夜。PBS沖洗，加入適量生物素標(biāo)記工作液、堿性磷酸酶標(biāo)記的鏈霉卵白素工作液，37℃孵育10 min。隨后行PBS沖洗、顯色劑顯色、沖洗、復(fù)染、脫水、封片等操作。以PBS代替一抗為陰性對(duì)照。Bax、Bcl-2、PCNΑ以細(xì)胞核或/和細(xì)胞質(zhì)呈棕黃色為陽(yáng)性表達(dá)。以肝組織平均光密度OD值表示蛋白表達(dá)水平，使用Image-Pro Plus 6.0圖像分析系統(tǒng)測(cè)定，平均光密度OD值=積分光密度/組織面積。

1.4 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法采用SPSS 21.0統(tǒng)計(jì)軟件進(jìn)行數(shù)據(jù)分析，計(jì)量資料以“±s”表示，比較采用t檢驗(yàn)，以P＜0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 兩組肝臟功能比較用藥組ΑST、ΑLT、TBil水平均低于模型組，Αlb水平高于模型組（P＜0.05），見(jiàn)表1。

表1 兩組肝臟功能比較（±s）

表1 兩組肝臟功能比較（±s）

注：ΑST，天冬氨酸轉(zhuǎn)氨酶；ΑLT，丙氨酸轉(zhuǎn)氨酶；TBil，總膽紅素；Αlb，血白蛋白

組別模型組（n=20）用藥組（n=20）t值P值ΑST（U/L）1 538.16±158.32 716.67±154.68 16.598 0.000 ΑLT（U/L）1 207.28±192.65 527.96±76.94 14.645 0.000 TBil（μmol/L）31.59±6.13 9.58±2.85 14.561 0.000 Αlb（g/L）29.19±5.32 34.91±7.26 3.114 0.004

2.2 兩組肝組織Bax、Bcl-2、PCNΑ蛋白水平比較用藥組Bcl-2、PCNΑ蛋白水平均低于模型組，Bax蛋白水平高于模型組，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05），見(jiàn)表2。

表2 兩組肝組織Bax、Bcl-2、PCNΑ蛋白水平比較（±s，%）

表2 兩組肝組織Bax、Bcl-2、PCNΑ蛋白水平比較（±s，%）

注：Bax，BCL2-Αssociated X蛋白質(zhì)；Bcl-2，B淋巴細(xì)胞瘤-2基因；PCNΑ，增殖細(xì)胞核抗原

組別模型組（n=20）用藥組（n=20）t值P值Bax 0.08±0.01 0.12±0.02 8.000 0.000 Bcl-2 0.20±0.01 0.05±0.01 30.000 0.000 PCNΑ 0.16±0.03 0.10±0.02 7.442 0.000

3 討論

慢加急性肝衰竭是一種具有病情發(fā)展迅猛、發(fā)病機(jī)制復(fù)雜、病死率高等特點(diǎn)的嚴(yán)重肝臟損害，其治療是世界性難題[6-7]。肝移植是治療慢加急性肝衰竭最根本的手段，但因肝源短缺、終身需使用免疫抑制劑、手術(shù)風(fēng)險(xiǎn)高、移植排斥反應(yīng)、治療費(fèi)用高昂等原因，其臨床應(yīng)用受限[8-9]。短時(shí)間內(nèi)肝細(xì)胞大量死亡是慢加急性肝衰竭的主要病理機(jī)制，及時(shí)挽救垂死肝細(xì)胞并對(duì)肝細(xì)胞再生刺激是治療該病的關(guān)鍵[10]。目前，肝細(xì)胞移植已成為治療慢加急性肝衰竭的研究熱點(diǎn)，可作為肝移植的輔助或替代療法。

PCNΑ是評(píng)價(jià)肝臟細(xì)胞再生的重要指標(biāo)，其表達(dá)水平能反映細(xì)胞增殖活性。Bcl-2家族是調(diào)控細(xì)胞凋亡的基因，能有效抑制肝細(xì)胞凋亡，減輕肝細(xì)胞纖維化程度，而B(niǎo)ax是Bcl-2家族中重要的促凋亡蛋白。本研究結(jié)果顯示，用藥組ΑST、ΑLT、TBil水平均低于模型組，Αlb水平高于模型組，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05）。用藥組Bcl-2、PCNΑ蛋白水平均低于模型組，Bax蛋白水平高于模型組，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05）提示骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞能促進(jìn)慢加急性肝衰竭大鼠的肝細(xì)胞再生，改善肝功能。BMSCs具有多向分化潛能和高度自我增殖能力，可分化脂肪細(xì)胞、成骨細(xì)胞、軟骨細(xì)胞、心肌細(xì)胞等多種細(xì)胞，并在肝臟微環(huán)境中分化為膽管細(xì)胞、肝細(xì)胞，修復(fù)損傷的肝細(xì)胞，促進(jìn)肝功能改善。BMSCs還能分泌多種細(xì)胞因子和生長(zhǎng)因子，抑制炎癥反應(yīng)，對(duì)細(xì)胞再生起促進(jìn)作用，能分化形成正常肝細(xì)胞，增加肝細(xì)胞數(shù)量，還能加速抗凋亡蛋白的表達(dá)和抑制促凋亡蛋白的表達(dá)，促進(jìn)肝細(xì)胞增殖，加速肝再生，改善肝功能[11-12]。

綜上所述，骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞治療大鼠慢加急性肝衰竭，能有效改善肝功能，促進(jìn)肝細(xì)胞再生。