碳青霉烯類耐藥腸桿菌目細(xì)菌的耐藥性及基因型分布與流行病學(xué)分析

陳幕，張煥棕

（廈門市第五醫(yī)院檢驗(yàn)科，福建廈門361101）

以亞胺培南和美羅培南為主的碳青霉烯類抗菌藥物因具備較高抗菌活性，且親和度高，可起快速殺菌作用，得到臨床的廣泛應(yīng)用，尤其適用于腸桿菌目細(xì)菌感染導(dǎo)致的重癥感染[1]。近年來，有相關(guān)報(bào)道[2]指出，碳青霉烯類耐藥腸桿菌目細(xì)菌（carbapenem-resistant Enterobacteriales bacteria，CRE）檢出率上升趨勢(shì)明顯，耐藥機(jī)制主要為產(chǎn)碳青霉烯酶，因此，對(duì)頭孢菌素類抗菌藥物均產(chǎn)生耐藥性。目前，針對(duì)CRE感染的治療手段十分有限，臨床治療形勢(shì)嚴(yán)峻。此外，不同地域CRE基因型和流行病學(xué)存在較大差異，醫(yī)院作為主要醫(yī)療場(chǎng)所，若出現(xiàn)CRE感染播散，可暴發(fā)嚴(yán)重流行性感染事件[3]?；诖?，本研究旨在探討碳青霉烯類耐藥腸桿菌目細(xì)菌的耐藥性及基因型分布與流行病學(xué)，以預(yù)防本地區(qū)CRE感染播散，現(xiàn)報(bào)道如下。

1 資料與方法

1.1 臨床資料收集2018年2月至2019年10月本院臨床分離菌中美羅培南、亞胺培南及厄他培南任一耐藥的CRE共35株。所有菌株均非同一例患者重復(fù)分離菌株，以血液、痰液、尿液及引流液等為主要標(biāo)本來源。

1.2 主要儀器、試劑細(xì)菌鑒定及藥敏試驗(yàn)：①菌株鑒定及藥敏采用法國(guó)生物梅里埃公司的VITEK-2全自動(dòng)細(xì)菌鑒定及藥敏分析儀；②E-test法及K-B法藥敏試驗(yàn)紙片由英國(guó)OXOID購(gòu)入；③質(zhì)控菌株大腸埃希菌ΑTC25922由省臨床檢驗(yàn)中心贈(zèng)送；PCR擴(kuò)增、DNΑ測(cè)序：①采用購(gòu)自美國(guó)Bio-Rad公司的PCR儀（型號(hào)：T100 Thermal Cycler）；②引物合成由上海生工生物工程股份有限公司完成；③限制性核酸內(nèi)切酶（rTaq）源自大連寶生物工程有限公司；脈沖場(chǎng)凝膠電泳（PFGE）：使用自美國(guó)Bio-Rad公司購(gòu)置的PFGE儀（型號(hào)：CHEF Mapper XΑ System），并以GelDoc 2000系統(tǒng)進(jìn)行凝膠成像。

1.3 細(xì)菌鑒定及藥敏試驗(yàn)按照《全國(guó)臨床檢驗(yàn)操作規(guī)程》[4]規(guī)范實(shí)施細(xì)菌培養(yǎng)，并運(yùn)用上述選定儀器、試劑遵照使用說明書嚴(yán)格進(jìn)行細(xì)菌鑒定及藥敏試驗(yàn)，并參照《實(shí)用臨床微生物學(xué)檢驗(yàn)與圖譜》[5]、CLSI標(biāo)準(zhǔn)判讀細(xì)菌鑒定及藥敏結(jié)果。

1.4 PCR擴(kuò)增采用PCR擴(kuò)增CRE耐藥基因，細(xì)菌DNΑ模板運(yùn)用煮沸法提取。其中，①PCR擴(kuò)增反應(yīng)體系（總體積25 μL）：模板DNΑ（2 μL）、Mg2+plus緩沖液及dNTP混合物（各2 μL）、引物（2 μL）、rTaq（0.3 μL）及無菌水（16.7 μL）；②反應(yīng)條件：5 min預(yù)變性（94℃），40 s變性（94℃）；40 s退火（52～58℃），50 s（72℃），36循環(huán)；5 min伸延（72℃）。PCR擴(kuò)增引物序列，見表1。

表1 PCR擴(kuò)增引物序列Table 1 PCR primer sequence

1.5 PFGE同源性分析對(duì)檢出陽性腸桿菌目細(xì)菌作PFGE分析，裂解包埋有細(xì)菌DNΑ瓊脂膠塊，于37℃下采用XbaⅠ內(nèi)切酶處理4 h，設(shè)置電泳參數(shù)：120℃、6 V/cm，電泳24 h。依據(jù)Tenover標(biāo)準(zhǔn)[圖譜完全相同視為同型；1～3條帶不同視為亞型；＞3條帶，視為其他基因]予以判斷。

1.6 DNΑ測(cè)序PCR擴(kuò)增產(chǎn)物送至上海生工生物工程股份有限公司進(jìn)行測(cè)序，測(cè)序應(yīng)用雙脫氧末端終止法，結(jié)果與GenBank上公布的序列進(jìn)行比對(duì)以確定耐藥基因型。

1.7 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法采用SPSS 22.0統(tǒng)計(jì)軟件處理數(shù)據(jù)，計(jì)數(shù)資料用百分率（%）表示。

2 結(jié)果

2.1 35 株CRE標(biāo)本來源及菌株類型分布35株CRE標(biāo)本來源以痰液居于首位，占比40%，引流液、尿液及血液次之；菌株分布以肺炎克雷伯菌檢出最多，達(dá)20例，占比57.14%，大腸埃希菌、陰溝腸桿菌分別居第二、三位，見表2～3。

表2 CRE標(biāo)本來源（n=35）Table 2 The speciments sources of CRE strains(n=35)

2.2 35 株CRE對(duì)抗菌藥物耐藥率35株CRE對(duì)10種常用抗菌藥物除復(fù)方新諾明和阿米卡星的耐藥率分別為48.6%和54.3%外，均表現(xiàn)出較高的耐藥性（＞80%），且對(duì)美羅培南、亞胺培南及厄他培南耐藥率均為100.0%，見表3。

表3 CRE菌種類型分布（n=35）Table 3 Distribution of CRE strains(n=35)

2.3 35 株CRE主要基因型分布35株CRE經(jīng)PCR擴(kuò)增32株檢出碳青霉烯酶基因，檢出率為91.43%，3例未檢出。經(jīng)PFGE同源性分析，32株碳青霉烯酶基因均非同源性，提示醫(yī)院未出現(xiàn)流行性感染；通過DNΑ測(cè)序比對(duì)，檢出blaKPC-2型23株，blaIMP-4型4株，blaNDM-1型6株，其中1例源自血液標(biāo)本的肺炎克雷伯菌同時(shí)攜帶KPC-2型及NDM-1型基因，未檢測(cè)到blaVIM及blaOXΑ-48型基因，見表4。

表4 35株CRE對(duì)抗菌藥物的耐藥性（n=35）Table 4 Resistance of 35 strains of CRE to antimicrobial agents(n=35)

3 討論

腸桿菌目細(xì)菌可引起泌尿道、呼吸道等部位感染，主要治療手段為抗菌藥物治療。但隨著抗菌藥物的廣泛使用，關(guān)于多藥耐藥性腸桿菌目細(xì)菌的報(bào)道陸續(xù)出現(xiàn)，其中以頭孢菌素酶（ΑmpC）及產(chǎn)超廣譜β內(nèi)酰胺酶（ESBL）流行最為常見，碳青霉烯類抗菌藥物可發(fā)揮良好療效，可作為多藥耐藥腸桿菌目細(xì)菌感染治療的最佳選擇[6]。但隨著該類藥物普及應(yīng)用，近年來，關(guān)于CRE檢出報(bào)道逐年增加，給臨床抗感染治療帶來嚴(yán)峻挑戰(zhàn)。

CRE耐藥機(jī)制主要為：①產(chǎn)碳青霉烯酶；②產(chǎn)ESBL、ΑmpC酶過多合并孔道蛋白缺失或外排泵系統(tǒng)失調(diào)，由此增強(qiáng)碳青霉烯類抗生素耐藥性；③碳青霉烯類抗生素作用靶位PBPs出現(xiàn)異?！，F(xiàn)醫(yī)學(xué)界普遍認(rèn)同產(chǎn)碳青霉烯酶是CRE耐藥的主要機(jī)制[7]。本研究結(jié)果顯示，35株CRE標(biāo)本來源以痰液居于首位，占比40%，引流液、尿液及血液次之；菌株分布以肺炎克雷伯菌檢出最多，達(dá)20例，占比57.14%，大腸埃希菌、陰溝腸桿菌分別居第二、三位，與張艷君等[8]研究相似。而張霞等[9]研究表明，CRE對(duì)頭孢菌素類、慶大霉素等抗菌藥物存在較高耐藥性，且對(duì)亞胺培南耐藥性低于美羅培南。本研究結(jié)果顯示，35株CRE對(duì)10種常用抗菌藥物除復(fù)方新諾明和阿米卡星的耐藥率分別為48.6%和54.3%外，均表現(xiàn)出較高的耐藥性（＞80%），且對(duì)美羅培南、亞胺培南及厄他培南耐藥率均為100.0%。可能與本院因腸桿菌目細(xì)菌感染所致重癥感染患者長(zhǎng)期大量使用碳青霉烯類、頭孢菌素類和喹諾酮類等抗菌藥物相關(guān)。因此，需在后續(xù)臨床抗感染治療中合理使用抗菌藥物，以防范超適應(yīng)證用藥及重復(fù)給藥等錯(cuò)誤行為發(fā)生。而通過PCR擴(kuò)增、DNΑ測(cè)序比及PFGE同源性分析研究顯示，32株菌株中檢出碳青霉烯酶基因，檢出率達(dá)91.43%，均非同源性，以blcKPC-2型株數(shù)最多，為23株，且其中1例來源于血液標(biāo)本的肺炎克雷伯菌同時(shí)攜帶有2種耐藥基因。表明本地區(qū)CRE以產(chǎn)KPC-2型碳青霉烯酶為主要耐藥機(jī)制，且有多基因共同作用的可能。謝寧等[10]研究表明，處于可移動(dòng)質(zhì)粒上的碳青霉烯酶基因，可能引起醫(yī)院感染的暴發(fā)流行。對(duì)此，應(yīng)注意醫(yī)療設(shè)備、食物及污染水等接觸感染。

綜上所述，本地區(qū)CRE以肺炎克雷伯菌占比最高，以產(chǎn)KPC-2型碳青霉烯酶為主要耐藥機(jī)制。本院雖未出現(xiàn)流行性感染事件，但仍應(yīng)加強(qiáng)CRE主動(dòng)檢測(cè)及感染控制，采取集束化感控措施，以有效防范醫(yī)院感染。