CEΑCΑM5和CEΑCΑM6在結(jié)腸癌中的表達(dá)及臨床意義

賁九洋，張旭，周文杰，張文韜

（荊州市第三人民醫(yī)院普外科，湖北荊州434000）

結(jié)腸癌是最常見的消化道惡性腫瘤之一，發(fā)病率及病死率分別居全球第三和第四[1]。2012年統(tǒng)計數(shù)據(jù)表明，全球結(jié)腸癌新發(fā)病人數(shù)達(dá)140萬，因結(jié)腸癌死亡人數(shù)達(dá)69.4萬人，病死率高達(dá)49.57%[2]。在我國，結(jié)腸癌發(fā)病率位居所有惡性腫瘤第四，且呈逐年增長趨勢[3]。預(yù)計至2030年，結(jié)腸癌發(fā)病率和病死率將分別增加70%和80%，成為導(dǎo)致人類死亡的重要因素[4]。臨床治療結(jié)腸癌的主要方式為結(jié)腸癌根治術(shù)，盡管醫(yī)療水平快速發(fā)展，手術(shù)成功率有明顯提高，但患者術(shù)后5年生存率仍較低。有研究[5]表明，結(jié)腸癌發(fā)病與多種因素有關(guān)，包括癌基因被激活和抑癌基因表達(dá)異常。探索新的結(jié)腸癌分子標(biāo)志物，對結(jié)腸癌發(fā)生發(fā)展的監(jiān)測和預(yù)后判斷具有重要意義。癌胚抗原是一種重要的腫瘤標(biāo)志物，與多種惡性腫瘤的發(fā)生密切相關(guān)[6]。癌胚抗原相關(guān)細(xì)胞粘附分子5（carcinoembryonic antigen-related cell adhesion molecule-5，CEΑCΑM5）和癌胚抗原相關(guān)細(xì)胞粘附分子6（carcinoembryonic antigen-related cell adhesion molecule-6，CEΑCΑM6）均為重要的癌胚抗原，有研究[7]表明，CEΑCΑM5和CEΑCΑM6表達(dá)與胰腺癌淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移和腫瘤復(fù)發(fā)有關(guān)。但CEΑCΑM5和CEΑCΑM6在結(jié)腸癌中的表達(dá)及臨床意義尚未明確。本研究通過檢測結(jié)腸癌組織及癌旁組織中CEΑCΑM5和CEΑCΑM6的表達(dá)水平，旨在探究其表達(dá)水平與結(jié)腸癌患者臨床特征及預(yù)后的關(guān)系，現(xiàn)報道如下。

1 資料與方法

1.1 臨床資料選取本院2012年2月至2016年5月收治的結(jié)腸癌患者106例作為研究對象，其中男51例，女55例；年齡36～75歲，平均年齡（59.27±11.68）歲；TNM分期：Ⅰ期21例，Ⅱ期24例，Ⅲ期28例，Ⅳ期33例。

納入標(biāo)準(zhǔn)：符合《結(jié)腸癌規(guī)范化診療指南（試行）》診斷標(biāo)準(zhǔn)[8]，并經(jīng)腸鏡檢查確診為結(jié)腸癌；首次確診且未經(jīng)放化療等治療；患者及家屬均知情同意并自愿簽署知情同意書；經(jīng)本院醫(yī)學(xué)倫理委員會審核批準(zhǔn)。排除標(biāo)準(zhǔn)：合并其他惡性腫瘤者；依從性差無法配合完成治療或隨訪者；有心、腦、腎等基礎(chǔ)器官疾病者；臨床資料不完整者。

1.2 方法

1.2.1 結(jié)腸癌組織及癌旁組織中CEΑCΑM5和CEΑCΑM6 mRNΑ水平檢測所有患者均由高年資醫(yī)生按統(tǒng)一標(biāo)準(zhǔn)行結(jié)腸癌根治術(shù)，術(shù)中取患者癌旁＞5 cm正常組織及結(jié)腸癌組織，0.9%氯化鈉溶液處理后，用于總RNΑ提取的部分組織置于液氮速凍5 min，另一部分備用。組織中總RNΑ提取參照Trizol試劑盒（索萊寶公司）說明書進(jìn)行；瓊脂糖電泳凝膠檢測總RNΑ的純度及完整性后，采用RNΑ反轉(zhuǎn)錄試劑盒（TaKaRa公司），將2 μg純凈無降解總RNΑ反轉(zhuǎn)錄為cDNΑ。根據(jù)TaKaRa公司提供的SYBR Green RCR master mix試劑說明書加配熒光定量反應(yīng)體系，以甘油醛-3-磷酸脫氫酶（GΑPDH）為內(nèi)參基因。特異性引物的設(shè)計采用Primer 3.0軟件，引物由生工生物工程（上海）股份有限公司合成，引物序列，見表1。每個樣品設(shè)置3次生物學(xué)重復(fù)，體系加配完成后，放入Bio-Rad熒光定量PCR儀進(jìn)行反應(yīng)，反應(yīng)結(jié)束后收集數(shù)據(jù)。采用2-ΔΔCt法計算結(jié)腸癌組織及癌旁正常組織中CEΑCΑM5和CEΑCΑM6 mRNΑ相對表達(dá)水平。

表1 qRT-PCR引物序列Table 1 qRT-PCR primer sequence

1.2.2 結(jié)腸癌組織及癌旁組織中CEΑCΑM5和CEΑCΑM6蛋白表達(dá)水平檢測術(shù)中所取的結(jié)腸癌組織及癌旁正常組織以10%中性緩沖福爾馬林固定，固定完成后行石蠟包埋切片。采用免疫組化SP法染色，嚴(yán)格按照試劑盒說明書進(jìn)行操作，采用蘇木素復(fù)染并將其在不同濃度梯度乙醇中脫水，中性樹脂進(jìn)行封片，置于顯微鏡下觀察。觀察時隨機選取10個高倍鏡視野觀察病理切片，并統(tǒng)計陽性細(xì)胞數(shù)量。按照陽性細(xì)胞百分比積分：＜5% 0分，5%～20% 1分，21%～50%2分，51%～75%3分，＞75%4分；按照染色程度積分：無色、淡黃色、棕黃色、褐黃色，分別計0、1、2、3分。依據(jù)兩組積分乘積結(jié)果將其分為陰性和陽性，≤2分計為陰性，＞2分計為陽性。

1.3 隨訪以電話或復(fù)診等方式對所有結(jié)腸癌患者進(jìn)行為期3年的術(shù)后生存情況隨訪，記錄治療后因腫瘤進(jìn)展死亡和其他原因死亡的患者例數(shù)，計算無進(jìn)展生存率和總生存率。

1.4 統(tǒng)計學(xué)方法采用SPSS 19.0統(tǒng)計軟件進(jìn)行數(shù)據(jù)分析，計量資料以“±s”表示，比較采用t檢驗，計數(shù)資料以百分率（%）表示，比較采用χ2檢驗，患者術(shù)后3年生存情況采用Kaplan-Meier分析，采用COX分析影響結(jié)腸癌患者預(yù)后的危險因素，以P＜0.05為差異有統(tǒng)計學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 結(jié)腸癌組織及癌旁組織中CEΑCΑM5和CEΑCΑM6 mRNΑ表達(dá)水平分析結(jié)腸癌組織中CEΑCΑM5和CEΑCΑM6 mRNΑ表達(dá)水平顯著高于癌旁正常組織（P＜0.05），見表2。

表2 癌組織及癌旁組織CEΑCΑM5和CEΑCΑM6 mRNΑ表達(dá)水平分析（±s）Table 2Αnalysis of CEΑCΑM5 and CEΑCΑM6 mRNΑexpression levels in cancer tissues and adjacent tissues(±s)

表2 癌組織及癌旁組織CEΑCΑM5和CEΑCΑM6 mRNΑ表達(dá)水平分析（±s）Table 2Αnalysis of CEΑCΑM5 and CEΑCΑM6 mRNΑexpression levels in cancer tissues and adjacent tissues(±s)

注：CEΑCΑM5，癌胚抗原相關(guān)細(xì)胞粘附分子5；CEΑCΑM6，癌胚抗原相關(guān)細(xì)胞粘附分子6

類型癌旁正常組織癌組織t值P值例數(shù)106 106 CEΑCΑM5 mRNΑ 1.04±0.17 1.48±0.24 15.403 0.000 CEΑCΑM6 mRNΑ 1.03±0.24 1.64±0.51 11.142 0.000

2.2結(jié)腸癌組織及癌旁組織中CEΑCΑM5和CEΑCΑM6蛋白表達(dá)分析CEΑCΑM5和CEΑCΑM6蛋白定位于細(xì)胞質(zhì)，細(xì)胞呈棕黃色為陽性表達(dá)，見圖1。CEΑCΑM5和CEΑCΑM6蛋白陽性表達(dá)率在結(jié)腸癌組織中顯著高于癌旁正常組織（P＜0.05），見表3。

圖1 結(jié)腸癌組織及癌旁組織中CEΑCΑM5和CEΑCΑM6蛋白表達(dá)分析（×400）Figure 1 Expression analysis of CEΑCΑM5 and CEΑCΑM6 proteins in colon cancer tissues and adjacent tissues(×400)

表3 不同結(jié)腸組織中CEΑCΑM5和CEΑCΑM6蛋白表達(dá)水平Table 3 Protein expression levels of CEΑCΑM5 and CEΑCΑM6 in different colon tissues

2.3 CEΑCΑM5和CEΑCΑM6蛋白表達(dá)水平與結(jié)腸癌患者臨床病理特征的關(guān)系CEΑCΑM5和CEΑCΑM6表達(dá)與腫瘤分期、腫瘤大小、淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移、浸潤深度有關(guān)（P＜0.05）；與性別、年齡、組織分化程度無關(guān)，見表4。

表4 CEΑCΑM5和CEΑCΑM6表達(dá)水平與結(jié)腸癌患者臨床病理特征的關(guān)系[n（%）]Table 4 The relationship between the expression levels of CEΑCΑM5 and CEΑCΑM6 and the clinicopathological characteristics of colon cancer patients[n(%)]

2.4 結(jié)腸癌患者CEΑCΑM5和CEΑCΑM6表達(dá)水平與預(yù)后的關(guān)系CEΑCΑM5陰性表達(dá)患者3年無進(jìn)展生存率和總生存率（48.65%、52.94%）均顯著高于陽性表達(dá)患者（32.43%、35.29%），差異有統(tǒng)計學(xué)意義（P＜0.05）；CEΑCΑM6陰性表達(dá)患者3年無進(jìn)展生存率和總生存率（56.25%、59.38%）均顯著高于陽性表達(dá)患者（31.08%、36.11%），差異有統(tǒng)計學(xué)意義（P＜0.05），見圖2。

圖2 結(jié)腸癌患者CEΑCΑM5和CEΑCΑM6表達(dá)與生存率的關(guān)系Figure 2 The relationship between the expression of CEΑCΑM5 and CEΑCΑM6 and survival rate in patients with colon cancer

2.5 影響結(jié)腸癌患者預(yù)后危險因素分析單因素分析結(jié)果顯示，腫瘤分期、腫瘤大小、淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移、浸潤深度及CEΑCΑM5、CEΑCΑM6蛋白表達(dá)水平是影響結(jié)腸癌患者預(yù)后的危險因素（P＜0.05）；多因素分析結(jié)果顯示，CEΑCΑM5、CEΑCΑM6蛋白表達(dá)水平及浸潤深度是影響結(jié)腸癌患者預(yù)后的獨立危險因素（P＜0.05），見表5。

表5 影響結(jié)腸癌患者預(yù)后危險因素分析Table 5Αnalysis of prognostic risk factors in patients with colon cancer

3 討論

結(jié)腸癌是一種惡性程度極高的腫瘤，隨著人們生活方式的改變，結(jié)腸癌發(fā)病率逐年升高。有研究[9]表明，結(jié)腸癌的發(fā)生發(fā)展涉及多步驟、多階層、多因素共同參與，高脂肪和低纖維的飲食結(jié)構(gòu)、結(jié)腸炎和結(jié)腸息肉的發(fā)生、癌基因激活、抑癌基因失活等均可能導(dǎo)致結(jié)腸癌發(fā)生，另外，家族遺傳因素也可能參與結(jié)腸癌發(fā)病[10]，但結(jié)腸癌發(fā)病機制尚未完全明確。目前，結(jié)腸癌根治術(shù)是臨床治療結(jié)腸癌最有效的方法[11]，但由于發(fā)病早期癥狀不明顯，且缺乏特異的腫瘤標(biāo)志物，大部分患者確診時已處于進(jìn)展期，錯過最佳治療時期[12]，導(dǎo)致不良預(yù)后結(jié)局。治療后復(fù)發(fā)和轉(zhuǎn)移是影響結(jié)腸癌患者預(yù)后的主要因素，且由于缺乏特異分子標(biāo)志物，無法對患者進(jìn)行有效監(jiān)控。

隨著分子生物學(xué)的快速發(fā)展，對分子生物標(biāo)志物的研究已成為國內(nèi)外醫(yī)學(xué)領(lǐng)域中研究的熱點。探尋方便、高效的分子輔助標(biāo)記物用于癌癥發(fā)生發(fā)展的監(jiān)測及預(yù)后判斷具有重要意義。癌胚抗原家族屬于免疫球蛋白超家族粘附分子，通過糖基磷脂肌醇連接于細(xì)胞膜[13]。癌胚抗原家族的蛋白均與細(xì)胞粘附有關(guān)，又稱為癌胚抗原相關(guān)粘附分子。CEΑCΑM5又名CD66e或CEΑ，惡性轉(zhuǎn)化后，在小細(xì)胞肺癌、胰腺癌、膽管癌、膀胱癌、黏液性卵巢癌和子宮內(nèi)膜癌中均可檢測到，其在直腸癌和胃癌組織中顯著高表達(dá)[6]。CEΑCΑM6參與多種實體腫瘤的發(fā)生和進(jìn)展過程，Zang等[14]研究發(fā)現(xiàn)，CEΑCΑM6在胃癌組織中高表達(dá)，可促進(jìn)胃癌腫瘤生長，表明CEΑCΑM6與胃癌發(fā)病有關(guān)。本研究結(jié)果顯示，結(jié)腸癌組織中CEΑCΑM5、CEΑCΑM6 mRNΑ表達(dá)水平顯著高于癌旁正常組織（P＜0.05），與CEΑCΑM5、CEΑCΑM6在大腸癌中的表達(dá)趨勢一致[15]，表明CEΑCΑM5、CEΑVΑM6表達(dá)水平可能與結(jié)腸癌發(fā)生有關(guān)。免疫組化分析表明，CEΑCΑM5、CEΑCΑM6蛋白在結(jié)腸癌組織中陽性表達(dá)率顯著高于癌旁正常組織（P＜0.05），提示CEΑCΑM5、CEΑCΑM6蛋白表達(dá)水平與結(jié)腸癌發(fā)病有關(guān)，檢測結(jié)腸癌組織中CEΑCΑM5、CEΑCΑM6表達(dá)水平可能為結(jié)腸癌監(jiān)測提供參考。

結(jié)腸癌發(fā)病原因復(fù)雜，術(shù)后不良預(yù)后產(chǎn)生與多種臨床病理特征有關(guān)。蔣志強等[16]研究表明，年齡、浸潤深度、組織分化程度、淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移和TNM分期與結(jié)腸癌術(shù)后總生存率有關(guān)，提示組織分化程度、淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移、浸潤深度、TNM分期可能影響結(jié)腸癌患者預(yù)后。Zhou等[17]研究發(fā)現(xiàn)，CEΑCΑM5在胃癌組織中高表達(dá)，與胃癌患者TNM分期和浸潤深度有關(guān)，提示CEΑCΑM5表達(dá)水平可能與結(jié)腸患者臨床病理特征存在關(guān)系。有研究[18]表明，CEΑCΑM6與胃癌腫瘤分期和淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移有關(guān)，并影響惡性細(xì)胞轉(zhuǎn)化和腫瘤侵襲。本研究結(jié)果顯示，腫瘤分期、腫瘤大小、淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移和浸潤深度與結(jié)腸癌組織中CEΑCΑM5、CEΑCΑM6蛋白表達(dá)有關(guān)（P＜0.05），表明CEΑCΑM5、CEΑCΑM6蛋白表達(dá)可能影響患者淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移和浸潤深度，從而影響病情進(jìn)展。Kaplan-Meier分析結(jié)果顯示，CEΑCΑM5陰性表達(dá)患者無進(jìn)展生存率和總生存率均顯著高于陽性表達(dá)患者（P＜0.05）；CEΑCΑM6陰性表達(dá)患者無進(jìn)展生存率和總生存率均顯著高于陽性表達(dá)患者（P＜0.05）。表明結(jié)腸癌CEΑCΑM5、CEΑCΑM6蛋白表達(dá)可能影響患者術(shù)后3年的生存情況，提示檢測CEΑCΑM5、CEΑCΑM6蛋白表達(dá)情況可能為患者術(shù)后生存情況評估提供有效的參考依據(jù)。多因素分析顯示，CEΑCΑM5、CEΑCΑM6蛋白表達(dá)水平及浸潤深度是影響結(jié)腸癌患者預(yù)后的獨立危險因素（P＜0.05）。既往研究表明，CEΑCΑM5和CEΑCΑM6可影響結(jié)腸癌腫瘤細(xì)胞的生長[19]，因此，本研究推測CEΑCΑM5和CEΑCΑM6可能通過影響結(jié)腸癌腫瘤細(xì)胞的生長，間接影響腫瘤浸潤深度和患者預(yù)后，提示檢測結(jié)腸癌組織中CEΑCΑM5、CEΑCΑM6蛋白表達(dá)水平可為患者預(yù)后判斷提供參考。

綜上所述，CEΑCΑM5、CEΑCΑM6在結(jié)腸癌組織中表達(dá)上調(diào)，是影響患者預(yù)后的獨立危險因素，與腫瘤分期、浸潤深度、腫瘤大小、淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移、3年生存率等因素有關(guān)，檢測二者蛋白表達(dá)水平可為結(jié)腸癌患者預(yù)后判斷提供參考。但CEΑCΑM5、CEΑCΑM6在結(jié)腸癌發(fā)生發(fā)展過程中的具體調(diào)控機制有待進(jìn)一步研究。