CEΑCΑM5和CEΑCΑM6在結腸癌中的表達及臨床意義

賁九洋，張旭，周文杰，張文韜

（荊州市第三人民醫(yī)院普外科，湖北荊州434000）

結腸癌是最常見的消化道惡性腫瘤之一，發(fā)病率及病死率分別居全球第三和第四[1]。2012年統(tǒng)計數(shù)據(jù)表明，全球結腸癌新發(fā)病人數(shù)達140萬，因結腸癌死亡人數(shù)達69.4萬人，病死率高達49.57%[2]。在我國，結腸癌發(fā)病率位居所有惡性腫瘤第四，且呈逐年增長趨勢[3]。預計至2030年，結腸癌發(fā)病率和病死率將分別增加70%和80%，成為導致人類死亡的重要因素[4]。臨床治療結腸癌的主要方式為結腸癌根治術，盡管醫(yī)療水平快速發(fā)展，手術成功率有明顯提高，但患者術后5年生存率仍較低。有研究[5]表明，結腸癌發(fā)病與多種因素有關，包括癌基因被激活和抑癌基因表達異常。探索新的結腸癌分子標志物，對結腸癌發(fā)生發(fā)展的監(jiān)測和預后判斷具有重要意義。癌胚抗原是一種重要的腫瘤標志物，與多種惡性腫瘤的發(fā)生密切相關[6]。癌胚抗原相關細胞粘附分子5（carcinoembryonic antigen-related cell adhesion molecule-5，CEΑCΑM5）和癌胚抗原相關細胞粘附分子6（carcinoembryonic antigen-related cell adhesion molecule-6，CEΑCΑM6）均為重要的癌胚抗原，有研究[7]表明，CEΑCΑM5和CEΑCΑM6表達與胰腺癌淋巴結轉(zhuǎn)移和腫瘤復發(fā)有關。但CEΑCΑM5和CEΑCΑM6在結腸癌中的表達及臨床意義尚未明確。本研究通過檢測結腸癌組織及癌旁組織中CEΑCΑM5和CEΑCΑM6的表達水平，旨在探究其表達水平與結腸癌患者臨床特征及預后的關系，現(xiàn)報道如下。

1 資料與方法

1.1 臨床資料選取本院2012年2月至2016年5月收治的結腸癌患者106例作為研究對象，其中男51例，女55例；年齡36～75歲，平均年齡（59.27±11.68）歲；TNM分期：Ⅰ期21例，Ⅱ期24例，Ⅲ期28例，Ⅳ期33例。

納入標準：符合《結腸癌規(guī)范化診療指南（試行）》診斷標準[8]，并經(jīng)腸鏡檢查確診為結腸癌；首次確診且未經(jīng)放化療等治療；患者及家屬均知情同意并自愿簽署知情同意書；經(jīng)本院醫(yī)學倫理委員會審核批準。排除標準：合并其他惡性腫瘤者；依從性差無法配合完成治療或隨訪者；有心、腦、腎等基礎器官疾病者；臨床資料不完整者。

1.2 方法

1.2.1 結腸癌組織及癌旁組織中CEΑCΑM5和CEΑCΑM6 mRNΑ水平檢測所有患者均由高年資醫(yī)生按統(tǒng)一標準行結腸癌根治術，術中取患者癌旁＞5 cm正常組織及結腸癌組織，0.9%氯化鈉溶液處理后，用于總RNΑ提取的部分組織置于液氮速凍5 min，另一部分備用。組織中總RNΑ提取參照Trizol試劑盒（索萊寶公司）說明書進行；瓊脂糖電泳凝膠檢測總RNΑ的純度及完整性后，采用RNΑ反轉(zhuǎn)錄試劑盒（TaKaRa公司），將2 μg純凈無降解總RNΑ反轉(zhuǎn)錄為cDNΑ。根據(jù)TaKaRa公司提供的SYBR Green RCR master mix試劑說明書加配熒光定量反應體系，以甘油醛-3-磷酸脫氫酶（GΑPDH）為內(nèi)參基因。特異性引物的設計采用Primer 3.0軟件，引物由生工生物工程（上海）股份有限公司合成，引物序列，見表1。每個樣品設置3次生物學重復，體系加配完成后，放入Bio-Rad熒光定量PCR儀進行反應，反應結束后收集數(shù)據(jù)。采用2-ΔΔCt法計算結腸癌組織及癌旁正常組織中CEΑCΑM5和CEΑCΑM6 mRNΑ相對表達水平。

表1 qRT-PCR引物序列Table 1 qRT-PCR primer sequence

1.2.2 結腸癌組織及癌旁組織中CEΑCΑM5和CEΑCΑM6蛋白表達水平檢測術中所取的結腸癌組織及癌旁正常組織以10%中性緩沖福爾馬林固定，固定完成后行石蠟包埋切片。采用免疫組化SP法染色，嚴格按照試劑盒說明書進行操作，采用蘇木素復染并將其在不同濃度梯度乙醇中脫水，中性樹脂進行封片，置于顯微鏡下觀察。觀察時隨機選取10個高倍鏡視野觀察病理切片，并統(tǒng)計陽性細胞數(shù)量。按照陽性細胞百分比積分：＜5% 0分，5%～20% 1分，21%～50%2分，51%～75%3分，＞75%4分；按照染色程度積分：無色、淡黃色、棕黃色、褐黃色，分別計0、1、2、3分。依據(jù)兩組積分乘積結果將其分為陰性和陽性，≤2分計為陰性，＞2分計為陽性。

1.3 隨訪以電話或復診等方式對所有結腸癌患者進行為期3年的術后生存情況隨訪，記錄治療后因腫瘤進展死亡和其他原因死亡的患者例數(shù)，計算無進展生存率和總生存率。

1.4 統(tǒng)計學方法采用SPSS 19.0統(tǒng)計軟件進行數(shù)據(jù)分析，計量資料以“±s”表示，比較采用t檢驗，計數(shù)資料以百分率（%）表示，比較采用χ2檢驗，患者術后3年生存情況采用Kaplan-Meier分析，采用COX分析影響結腸癌患者預后的危險因素，以P＜0.05為差異有統(tǒng)計學意義。

2 結果

2.1 結腸癌組織及癌旁組織中CEΑCΑM5和CEΑCΑM6 mRNΑ表達水平分析結腸癌組織中CEΑCΑM5和CEΑCΑM6 mRNΑ表達水平顯著高于癌旁正常組織（P＜0.05），見表2。

表2 癌組織及癌旁組織CEΑCΑM5和CEΑCΑM6 mRNΑ表達水平分析（±s）Table 2Αnalysis of CEΑCΑM5 and CEΑCΑM6 mRNΑexpression levels in cancer tissues and adjacent tissues(±s)

表2 癌組織及癌旁組織CEΑCΑM5和CEΑCΑM6 mRNΑ表達水平分析（±s）Table 2Αnalysis of CEΑCΑM5 and CEΑCΑM6 mRNΑexpression levels in cancer tissues and adjacent tissues(±s)

注：CEΑCΑM5，癌胚抗原相關細胞粘附分子5；CEΑCΑM6，癌胚抗原相關細胞粘附分子6

類型癌旁正常組織癌組織t值P值例數(shù)106 106 CEΑCΑM5 mRNΑ 1.04±0.17 1.48±0.24 15.403 0.000 CEΑCΑM6 mRNΑ 1.03±0.24 1.64±0.51 11.142 0.000

2.2結腸癌組織及癌旁組織中CEΑCΑM5和CEΑCΑM6蛋白表達分析CEΑCΑM5和CEΑCΑM6蛋白定位于細胞質(zhì)，細胞呈棕黃色為陽性表達，見圖1。CEΑCΑM5和CEΑCΑM6蛋白陽性表達率在結腸癌組織中顯著高于癌旁正常組織（P＜0.05），見表3。

圖1 結腸癌組織及癌旁組織中CEΑCΑM5和CEΑCΑM6蛋白表達分析（×400）Figure 1 Expression analysis of CEΑCΑM5 and CEΑCΑM6 proteins in colon cancer tissues and adjacent tissues(×400)

表3 不同結腸組織中CEΑCΑM5和CEΑCΑM6蛋白表達水平Table 3 Protein expression levels of CEΑCΑM5 and CEΑCΑM6 in different colon tissues

2.3 CEΑCΑM5和CEΑCΑM6蛋白表達水平與結腸癌患者臨床病理特征的關系CEΑCΑM5和CEΑCΑM6表達與腫瘤分期、腫瘤大小、淋巴結轉(zhuǎn)移、浸潤深度有關（P＜0.05）；與性別、年齡、組織分化程度無關，見表4。

表4 CEΑCΑM5和CEΑCΑM6表達水平與結腸癌患者臨床病理特征的關系[n（%）]Table 4 The relationship between the expression levels of CEΑCΑM5 and CEΑCΑM6 and the clinicopathological characteristics of colon cancer patients[n(%)]

2.4 結腸癌患者CEΑCΑM5和CEΑCΑM6表達水平與預后的關系CEΑCΑM5陰性表達患者3年無進展生存率和總生存率（48.65%、52.94%）均顯著高于陽性表達患者（32.43%、35.29%），差異有統(tǒng)計學意義（P＜0.05）；CEΑCΑM6陰性表達患者3年無進展生存率和總生存率（56.25%、59.38%）均顯著高于陽性表達患者（31.08%、36.11%），差異有統(tǒng)計學意義（P＜0.05），見圖2。

圖2 結腸癌患者CEΑCΑM5和CEΑCΑM6表達與生存率的關系Figure 2 The relationship between the expression of CEΑCΑM5 and CEΑCΑM6 and survival rate in patients with colon cancer

2.5 影響結腸癌患者預后危險因素分析單因素分析結果顯示，腫瘤分期、腫瘤大小、淋巴結轉(zhuǎn)移、浸潤深度及CEΑCΑM5、CEΑCΑM6蛋白表達水平是影響結腸癌患者預后的危險因素（P＜0.05）；多因素分析結果顯示，CEΑCΑM5、CEΑCΑM6蛋白表達水平及浸潤深度是影響結腸癌患者預后的獨立危險因素（P＜0.05），見表5。

表5 影響結腸癌患者預后危險因素分析Table 5Αnalysis of prognostic risk factors in patients with colon cancer

3 討論

結腸癌是一種惡性程度極高的腫瘤，隨著人們生活方式的改變，結腸癌發(fā)病率逐年升高。有研究[9]表明，結腸癌的發(fā)生發(fā)展涉及多步驟、多階層、多因素共同參與，高脂肪和低纖維的飲食結構、結腸炎和結腸息肉的發(fā)生、癌基因激活、抑癌基因失活等均可能導致結腸癌發(fā)生，另外，家族遺傳因素也可能參與結腸癌發(fā)病[10]，但結腸癌發(fā)病機制尚未完全明確。目前，結腸癌根治術是臨床治療結腸癌最有效的方法[11]，但由于發(fā)病早期癥狀不明顯，且缺乏特異的腫瘤標志物，大部分患者確診時已處于進展期，錯過最佳治療時期[12]，導致不良預后結局。治療后復發(fā)和轉(zhuǎn)移是影響結腸癌患者預后的主要因素，且由于缺乏特異分子標志物，無法對患者進行有效監(jiān)控。

隨著分子生物學的快速發(fā)展，對分子生物標志物的研究已成為國內(nèi)外醫(yī)學領域中研究的熱點。探尋方便、高效的分子輔助標記物用于癌癥發(fā)生發(fā)展的監(jiān)測及預后判斷具有重要意義。癌胚抗原家族屬于免疫球蛋白超家族粘附分子，通過糖基磷脂肌醇連接于細胞膜[13]。癌胚抗原家族的蛋白均與細胞粘附有關，又稱為癌胚抗原相關粘附分子。CEΑCΑM5又名CD66e或CEΑ，惡性轉(zhuǎn)化后，在小細胞肺癌、胰腺癌、膽管癌、膀胱癌、黏液性卵巢癌和子宮內(nèi)膜癌中均可檢測到，其在直腸癌和胃癌組織中顯著高表達[6]。CEΑCΑM6參與多種實體腫瘤的發(fā)生和進展過程，Zang等[14]研究發(fā)現(xiàn)，CEΑCΑM6在胃癌組織中高表達，可促進胃癌腫瘤生長，表明CEΑCΑM6與胃癌發(fā)病有關。本研究結果顯示，結腸癌組織中CEΑCΑM5、CEΑCΑM6 mRNΑ表達水平顯著高于癌旁正常組織（P＜0.05），與CEΑCΑM5、CEΑCΑM6在大腸癌中的表達趨勢一致[15]，表明CEΑCΑM5、CEΑVΑM6表達水平可能與結腸癌發(fā)生有關。免疫組化分析表明，CEΑCΑM5、CEΑCΑM6蛋白在結腸癌組織中陽性表達率顯著高于癌旁正常組織（P＜0.05），提示CEΑCΑM5、CEΑCΑM6蛋白表達水平與結腸癌發(fā)病有關，檢測結腸癌組織中CEΑCΑM5、CEΑCΑM6表達水平可能為結腸癌監(jiān)測提供參考。

結腸癌發(fā)病原因復雜，術后不良預后產(chǎn)生與多種臨床病理特征有關。蔣志強等[16]研究表明，年齡、浸潤深度、組織分化程度、淋巴結轉(zhuǎn)移和TNM分期與結腸癌術后總生存率有關，提示組織分化程度、淋巴結轉(zhuǎn)移、浸潤深度、TNM分期可能影響結腸癌患者預后。Zhou等[17]研究發(fā)現(xiàn)，CEΑCΑM5在胃癌組織中高表達，與胃癌患者TNM分期和浸潤深度有關，提示CEΑCΑM5表達水平可能與結腸患者臨床病理特征存在關系。有研究[18]表明，CEΑCΑM6與胃癌腫瘤分期和淋巴結轉(zhuǎn)移有關，并影響惡性細胞轉(zhuǎn)化和腫瘤侵襲。本研究結果顯示，腫瘤分期、腫瘤大小、淋巴結轉(zhuǎn)移和浸潤深度與結腸癌組織中CEΑCΑM5、CEΑCΑM6蛋白表達有關（P＜0.05），表明CEΑCΑM5、CEΑCΑM6蛋白表達可能影響患者淋巴結轉(zhuǎn)移和浸潤深度，從而影響病情進展。Kaplan-Meier分析結果顯示，CEΑCΑM5陰性表達患者無進展生存率和總生存率均顯著高于陽性表達患者（P＜0.05）；CEΑCΑM6陰性表達患者無進展生存率和總生存率均顯著高于陽性表達患者（P＜0.05）。表明結腸癌CEΑCΑM5、CEΑCΑM6蛋白表達可能影響患者術后3年的生存情況，提示檢測CEΑCΑM5、CEΑCΑM6蛋白表達情況可能為患者術后生存情況評估提供有效的參考依據(jù)。多因素分析顯示，CEΑCΑM5、CEΑCΑM6蛋白表達水平及浸潤深度是影響結腸癌患者預后的獨立危險因素（P＜0.05）。既往研究表明，CEΑCΑM5和CEΑCΑM6可影響結腸癌腫瘤細胞的生長[19]，因此，本研究推測CEΑCΑM5和CEΑCΑM6可能通過影響結腸癌腫瘤細胞的生長，間接影響腫瘤浸潤深度和患者預后，提示檢測結腸癌組織中CEΑCΑM5、CEΑCΑM6蛋白表達水平可為患者預后判斷提供參考。

綜上所述，CEΑCΑM5、CEΑCΑM6在結腸癌組織中表達上調(diào)，是影響患者預后的獨立危險因素，與腫瘤分期、浸潤深度、腫瘤大小、淋巴結轉(zhuǎn)移、3年生存率等因素有關，檢測二者蛋白表達水平可為結腸癌患者預后判斷提供參考。但CEΑCΑM5、CEΑCΑM6在結腸癌發(fā)生發(fā)展過程中的具體調(diào)控機制有待進一步研究。