固定化離子液體分離石上柏穗花杉雙黃酮的應(yīng)用研究

李 剛，邱紹亮，張 鳳，李思慧，劉 超，秦桂芳，王 剛

(遵義醫(yī)科大學(xué) 藥學(xué)院，貴州 遵義 563099)

石上柏(Selaginelladoederleinii)是卷百科卷柏屬植物深綠卷柏全草，廣泛分布于貴州、云南、四川等地，其主莖直立，側(cè)枝密，分枝，具短刺尖，葉上面深綠色[1]。全草為藥，味甘，性平，具有清熱解毒、活血化瘀、祛風(fēng)除濕等功效[2]。臨床上主要用于治療鼻咽癌、肺癌、肝癌等[3]。雙黃酮類化合物廣泛存在于卷柏屬植物中，生物活性多樣，其中穗花杉雙黃酮(Amentoflavone，AME)是石上柏植物中主要活性成分，具有調(diào)節(jié)血糖、抗腫瘤、抗氧化、抗菌等作用[4-7]。傳統(tǒng)的雙黃酮提取方法包括回流提取法，滲漉法，堿溶酸沉法等，具有能耗高，環(huán)境危害大，提取率低的特點，制約了中藥現(xiàn)代化的發(fā)展。因此有必要尋找一種快速、高效、綠色的提取方法。石上柏鮮品及AME結(jié)構(gòu)見圖1。

圖1 石上柏鮮品與AME化學(xué)結(jié)構(gòu)式

離子液體又稱為室溫熔鹽、有機離子液體，主要是由有機陽離子和無機陰離子結(jié)合而形成的。離子液體在室溫下呈液態(tài)的物質(zhì)，具有不揮發(fā)、液程寬、溶解強、可設(shè)計調(diào)節(jié)等特性[8]。近年來離子液體受到很多研究者的關(guān)注和研究，因其具有較低的蒸氣壓，不揮發(fā)，不易燃特點，是傳統(tǒng)易燃易揮發(fā)的有機溶劑的理想替代品[9]。然而隨著對離子液體研究程度的不斷加深，發(fā)現(xiàn)離子在提取方面存在著缺陷，比如成本高，回收困難，與目標(biāo)化合物分離困難以及流失嚴(yán)重等。為克服這些缺陷，一項新的技術(shù)應(yīng)運而生。固定化離子液體技術(shù)(supported ionic liquids ，SILs)是離子液體與固體載體通過化學(xué)鍵相結(jié)合得到具有離子液體結(jié)構(gòu)的復(fù)合材料[10]。因SILs既有固體載體的特性又具有離子液體的獨特優(yōu)勢，通過改變離子液體的結(jié)構(gòu)可以得到多種具有不同性質(zhì)的材料，用于天然產(chǎn)物中活性成分的吸附分離研究。Tian等[11]合成硅膠固定化咪唑類離子液體并成功從丹參中提取隱丹參酮、丹參酮Ⅰ和丹參酮Ⅱa。余燕影等[12]應(yīng)用SILs技術(shù)從八角茴香人提取物中富集莽草酸，其富集率達(dá)到了80.34%。

咪唑類離子液體易于制備、成本較低、結(jié)構(gòu)可調(diào)控，對黃酮類化合物的提取效果好。基于課題組之前的研究，本文采用SILs技術(shù)將咪唑類離子液體固定到硅膠載體上形成離子液體共價鍵合硅膠材料，并將其應(yīng)用于吸附分離石上柏提取物中AME，并對吸附條件進(jìn)行優(yōu)化，提高AME的收率，為拓寬石上柏的綜合開發(fā)途徑提供理論依據(jù)。

1 材料和方法

1.1 材料與儀器 Agilent 1260-DAD-RID型高效液相色譜儀(美國安捷倫公司)；RV-210M型旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀(一恒科學(xué)儀器公司)；SHA-C型恒溫水浴震蕩儀(國宇儀器公司)；DF-101Z型恒溫磁力攪拌器(秋佐儀器公司)；FW177型粉碎機(一恒科學(xué)儀器有限公司)；FA1004N型電子天平(菁海儀器公司)。

3-氯丙基3甲氧基硅烷購自百靈威公司；硅膠購自青島海洋化工廠分廠；N-甲基咪唑、四氟硼酸鈉以及六氟磷酸鉀均購自阿拉丁試劑公司；AME標(biāo)準(zhǔn)品購自瑞芬思生物公司；石上柏采自貴州省遵義市鳳凰山，經(jīng)遵義醫(yī)科大學(xué)藥學(xué)院生藥學(xué)教研室張玉金副教授鑒定為卷柏科卷柏屬深綠卷柏(Selaginelladoederleinii)的全草。

1.2 試驗方法

1.2.1 SILs的合成

1.2.1.1 硅膠的活化 取硅膠(200-300目)加入液固比為20 g/mL的鹽酸-水(1∶3，v/v)溶液中，靜置 24 h后室溫下攪拌2 h，然后回流10 h，過濾，水洗至中性，再用丙酮洗滌，最后105 ℃真空干燥10 h備用?；罨枘z是為了增加硅膠表面硅羥基的數(shù)量以及消除金屬氧化物和含氮雜質(zhì)。

1.2.1.2 SILs的制備 根據(jù)文獻(xiàn)報道[13]，SILs的合成方法如下。取N-甲基咪唑和3-氯丙基三甲氧基硅烷(摩爾比為1∶1)于100 mL三頸燒瓶中，在100 ℃、N2保護(hù)下攪拌24 h，反應(yīng)完后用乙酸乙酯洗滌3次，然后將其置于65 ℃的真空干燥箱中干燥12 h，得到淡黃色粘稠狀液體(A)。

取A、活化硅膠和無水甲苯于圓底燒瓶，加熱回流24 h，過濾，產(chǎn)物分別用甲苯與丙酮洗滌，65 ℃真空干燥12 h，得到固定化咪唑氯鹽SiO2·Im﹢·Cl﹣。

SILs合成路線下圖2所示。

圖2 SILs制備路線

1.2.2 對照品溶液的制備 精密稱取對照品AME 7.8 mg，用95%乙醇稀釋定容至10 mL，得AME對照品溶液(0.78 mg/mL)。

1.2.3 供試品溶液的制備 取50.0 g過80目的石上柏粉末，加入600 mL的95 %乙醇回流提取3次，每次1 h，過濾，合并提取液，減壓濃縮，用95%乙醇定容至250 mL，得到石上柏提取物溶液。

1.2.4 色譜條件 色譜柱：DiK-ma Diamons C18色譜柱(250 mm×4.6 mm，5 μm)，流動相：乙腈(A)- 0.1%甲酸水(B)；檢測波長：330 nm；柱溫：25 ℃；流速：1.0 mL/min；進(jìn)樣量：10 μL，流動相梯度如表1所示[14]。

表1 HPLC梯度洗脫程序

分別精密吸取AME對照品溶液1、2、3、4、5、6 mL，分別置于10 mL 容量瓶中，加甲醇定容，搖勻，得系列對照品溶液。將對照品溶液按照上述色譜條件進(jìn)行HPLC分析，繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線，得到AME的回歸方程為：y=22116x-108，相關(guān)系數(shù)R2=0.9995，其中y和x分別代表AME標(biāo)準(zhǔn)品的吸光度值和濃度(mg/mL)(石上柏提取物及AME標(biāo)準(zhǔn)品HPLC圖如圖3所示)，表明AME在0.078～0.468 mg/mL范圍內(nèi)與峰面積積分值呈良好線性關(guān)系。

A:AME標(biāo)準(zhǔn)品；B：石上柏提取物，1：AME。圖3 石上柏提取物、AME標(biāo)準(zhǔn)品HPLC

1.2.5 靜態(tài)吸附與解析實驗

(1)

(2)

式中C0為吸附前AME的濃度 (mg/mL)；C1為吸附后AME的濃度(mg/mL)；V為樣液AME溶液的體積(mL)；m為吸附劑使用的質(zhì)量(g)。

1.2.5.2 單因素實驗考察 以AME為指標(biāo)，考察在不同吸附時間(10、20、30、40、50、60 min)，吸附溫度(10、20、30、40、50、60 ℃)，固液比 (0.25∶6，0.5∶6，0.75∶6，1∶6，1.25∶6，1.5∶6 g/mL)以及不同初始濃度(0.1、0.15、0.2、0.25、0.3 mg/mL)的條件下SILs對石上柏提取物中AME吸附率的影響。

1.2.5.3 靜態(tài)解吸實驗 將靜態(tài)吸附飽和的SILs和適量甲醇混合均勻，在30 ℃下震蕩30 min(150 r/min)，待SILs中AME充分解吸后，過濾，在“1.2.4”項色譜條件下測定濾液中AME的含量，根據(jù)公式(3)計算出解析率D %。

(3)

式中C0為吸附前AME的濃度(mg/mL)；C1為吸附后AME的濃度(mg/mL)； V1為樣液AME溶液的初始體積(mL)；C2為解析后AME的濃度(mg/mL)；V2為解析后AME溶液的體積(mL)。

1.2.6 動態(tài)吸附與脫附實驗

1.2.6.1 動態(tài)吸附實驗 取2.0 g SILs填充在玻璃柱(200 mm×10 mm)，將0.44 mg/mL的AME溶液以0.2 mL/min的流速通過吸附柱，收集流出液(每只試管收集4 mL流出液)，按照“1.2.4”項色譜條件下測定流出液中AME濃度。以上樣體積為橫坐標(biāo)，AME濃度為縱坐標(biāo)，繪制動態(tài)吸附曲線。

1.2.6.2 動態(tài)脫附實驗 吸附平衡后，將洗脫劑(甲醇)以0.2 mL/min流速通過吸附柱進(jìn)行洗脫，收集洗脫液(每只試管收集4 mL洗脫液)，按照“1.2.4”項色譜條件下測定洗脫液中AME濃度。以洗脫劑體積為橫坐標(biāo)，AME濃度為縱坐標(biāo)，繪制動態(tài)脫附曲線。

2 結(jié)果

2.1 靜態(tài)吸附與解析實驗

2.1.1 最佳SILs的篩選 3種固定化離子液體和硅膠對AME的效果如表2所示。從表2中可知，SiO2·Im﹢·Cl﹣的對AME的吸附效果最好，因此選擇SiO2·Im﹢·Cl﹣為最佳的SILs，下實驗選擇SiO2·Im﹢·Cl-作為吸附劑(圖4為提取液稀釋前后對比)。

表2 不同吸附劑對AME的吸附與解析能力

圖4 AME供試溶液吸附前 (Ⅰ) 和吸附后 (Ⅱ) 的照片對比

2.1.2 吸附時間的影響 不同時間(10，20，30，40，50，60 min)內(nèi)SiO2·Im﹢·Cl-對AME吸附率的影響如圖5所示。從圖5可知，當(dāng)吸附時間從10 min增加到30 min 時，吸附率從50.72%上升到80.01%；當(dāng)吸附時間超過30 min后，吸附率幾乎不再變化，說明此時吸附已經(jīng)達(dá)到飽和，因此選擇30 min為最佳吸附時間。

圖5 吸附時間對吸附率的影響

2.1.3 吸附溫度的影響 不同吸附溫度(10，20，30，40，50，60 ℃)下SiO2·Im﹢·Cl-對AME吸附率的影響如圖6所示。由圖6可知，當(dāng)吸附溫度從0升高到30 ℃時，吸附率從72.23%上升到83.00%；當(dāng)溫度達(dá)到30 ℃時吸附率最大，達(dá)到83.51%；當(dāng)溫度從30 ℃升高到60 ℃時，吸附率反而從83.00%降低至75.55%，這可能是由于溫度升高吸附物質(zhì)被氧化所致，因此選擇30 ℃為最佳吸附溫度。

圖6 吸附溫度對吸附率的影響

2.1.4 固-液比的影響 不同固液比(0.25∶6，0.5∶6，0.75∶6，1.0∶6，1.25∶6，1.5∶6 g/mL)下SiO2·Im﹢·Cl-對AME吸附率的影響如圖7所示。由圖7可知，當(dāng)固液比從0.25∶6 g/mL增加到1.0∶6 g/mL吸附率從 45.22%上升到87.54%；當(dāng)固液比超過1.0 g/mL后，吸附率幾乎不再隨著固液比的變化而變化，說明此時吸附已經(jīng)達(dá)到飽和，因此選擇1.0∶6 g/mL為最佳固液比。

圖7 固液比對吸附率的影響

2.1.5 提取物初始濃度的影響 不同初始濃度(0.1，0.15，0.2，0.25，0.3 mg/mL)下SiO2·Im﹢·Cl-對AME吸附率的影響如圖8所示。由圖8可知，提取物初始濃度0.1 mg/mL增加到0.2 mg/mL時,吸附率從75.06 %上升到88.81%；當(dāng)提取物初始濃度達(dá)到0.2 mg/mL時，吸附率最大達(dá)到88.81%；當(dāng)提取物初始濃度從0.2 mg/mL增加到0.3 mg/mL，吸附率反而從88.81%降至75.08%，這可能是由于上樣液AME濃度過大導(dǎo)致樣品分子間的距離減小，分子間作用力增大，阻礙SILs與樣品之間的作用力，因此選擇0.2 mg/mL為最佳初始濃度。

圖8 樣液濃度對吸附效率的影響

2.2 動態(tài)吸附與脫附實驗

2.2.1 動態(tài)吸附實驗 SiO2·Im﹢·Cl-對AME的動態(tài)吸附結(jié)果如圖9所示。由圖9可知，當(dāng)上樣體積從4mL增加到24 mL時流出液中AME濃度幾乎不變；上樣體積在 24 mL增加到72 mL時，流出液中AME濃度急劇上升；上樣體積達(dá)到72 mL時流出液中AME濃度達(dá)到最大為0.39 mg/mL，此時的AME的吸附率為88.63%；當(dāng)上樣體積存超過72 mL后，流出液中AME濃度幾乎不發(fā)變化，此時吸附達(dá)到飽和狀態(tài)。

圖9 SiO2·Im﹢·Cl﹣動態(tài)吸附曲線

2.2.2 動態(tài)脫附實驗 SiO2·Im﹢·Cl-對AME的動態(tài)脫附結(jié)果如圖10所示。由圖10可知，脫附曲線是對稱的，說明脫附性能良好；當(dāng)脫附劑體積達(dá)到24 mL 時，洗脫液中AME濃度達(dá)到最大，此時脫附率為89.72%；當(dāng)脫附劑體積超過64 mL后洗脫液中AME濃度幾乎不發(fā)生變化，此時洗脫完全。

圖10 SiO2·Im﹢·Cl﹣動態(tài)脫附曲線

2.3 重復(fù)利用SILs的考察 根據(jù)“1.2.5”項下實驗方法，SiO2·Im﹢·Cl-重復(fù)吸附AME兩次，其吸附率達(dá)到65.5%、62.3%，第3次重復(fù)使用時其吸附率下降到原來的一半，說明合成的SiO2·Im﹢·Cl-可重復(fù)使用。

3 討論

離子液體含有羥基、氨基、羧基等活性基團(tuán)，能夠通過的共軛作用、氫鍵作用、靜電作用等相互作用力與黃酮分子結(jié)合從而達(dá)到分離的目的。SILs技術(shù)是將離子液體固定到固體載體上形成復(fù)合材料，具有制備簡單、富集效率高、吸附容量高、pH 穩(wěn)定性好、識別位點多、萃取選擇性強、離子液體利用率高等優(yōu)點。將離子液體負(fù)載于硅膠后，有利于增強離子液體黃酮類分子識別能力以及增大離子液體與雙黃酮類分子接觸面積，因此能夠?qū)S酮類分子進(jìn)行選擇性吸附分離。隨著對SILs技術(shù)研究程度的不斷加深，其應(yīng)用范圍也不斷拓展。王志兵等[15]合成了3種SILs并通過固相分散法來分離蜂房中5中酚酸類和黃酮類物質(zhì)，結(jié)果發(fā)現(xiàn)固相分散法的最佳條件是：10% SiO2·[C6min]·Cl為分散劑，20 mL正己烷為淋洗劑，15mL甲醇為洗脫劑，樣品與分散劑的質(zhì)量比為1∶4，在此條件下5種化合物的分離效率分別為咖啡酸183.45±11.28 μg/g，阿魏酸119.01±9.47 μg/g，桑色素75.22±6.89 μg/g，白楊素392.10±12.21 μg/g，山奈素328.08±12.29 μg/g。

本文合成并篩選的SILs對石上柏提取物中AME進(jìn)行吸附分離，并考察了吸附過程中吸附時間、溫度、液固比及初始濃度對AME吸附率的影響以及SILs重復(fù)使用性能，動態(tài)吸附與脫附實驗結(jié)果表明SiO2·Im﹢·Cl﹣具有良好的吸附和脫附能力。對于0.44 mg/mL的溶液樣品，曲線穿透點在上樣體積為72 mL時其吸附量為72 mg/g，動態(tài)脫附以甲醇作為脫附劑，使用24 mL的甲醇，AME洗脫率可達(dá)89.72%。結(jié)果表明，SILs分離AME效果好，可重復(fù)使用，拓寬了天然產(chǎn)物中活性成分的分離純化研究思路。