CSE基因敲除小鼠的基因型鑒定方法

覃 明 ,王海燕 ,田 丹,鄭 靜,汪化軍,馮仁和,庹宇宇,張 悅,李妍霓，張浪浪，楊婷婷

(1.遵義醫(yī)科大學(xué) 基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)院免疫學(xué)教研室，貴州 遵義 563099；2.遵義醫(yī)科大學(xué) 公共衛(wèi)生學(xué)院流行病與衛(wèi)生統(tǒng)計(jì)學(xué)教研室 貴州 遵義 563099)

硫化氫(hydrogen sulfide， H2S)是繼一氧化氮和一氧化碳之后的第三個(gè)“氣體信號(hào)分子”[1]。目前認(rèn)為，哺乳動(dòng)物細(xì)胞主要依賴胱硫醚-γ-裂解酶(cystathionine-γ-lyase，CSE)和胱硫醚-β-合成酶(cystathionine-β-synthase，CBS)分別以L- 半胱氨酸和同型半胱氨酸為底物催化產(chǎn)生H2S[2]，以此參與機(jī)體內(nèi)源性H2S的合成。CSE和CBS表達(dá)具有不同的組織分布[3]，CBS主要表達(dá)于中樞神經(jīng)系統(tǒng)；CSE主要表達(dá)于心血管系統(tǒng)、呼吸系統(tǒng)、胃腸道等外周器官[4-5]。H2S功能諸多，一直是研究的熱點(diǎn)，H2S在心血管系統(tǒng)中有舒張血管、抑制血管重構(gòu)和保護(hù)心肌等重要調(diào)控作用，并與多種心血管疾病相關(guān)[6-7]；在免疫系統(tǒng)中與調(diào)節(jié)性T淋巴細(xì)胞的發(fā)育與功能密切相關(guān)[8]，還與結(jié)腸癌癌細(xì)胞的生長(zhǎng)、代謝密切相關(guān)[9]，本課題組近年來(lái)的工作也發(fā)現(xiàn)CSE通過(guò)調(diào)節(jié)內(nèi)源性H2S的合成在調(diào)控炎癥方面有重要作用[10-11 ]。雖然CSE和CBS基因敲除小鼠在這些研究中被大量應(yīng)用，但關(guān)于CSE基因敲除小鼠基因型鑒定方法的介紹都比較簡(jiǎn)略。因此，本研究介紹一種快速、較為準(zhǔn)確的具體鑒定方法，以期為應(yīng)用該動(dòng)物的實(shí)驗(yàn)研究提供參考。

1 材料與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物及倫理聲明 SPF級(jí)C57BL/6背景CSE雜合子小鼠(CSE+/-)由復(fù)旦大學(xué)藥學(xué)院朱依諄教授課題組惠贈(zèng)，雜合子小鼠交配繁殖后，隨機(jī)取其子代小鼠(6-8周齡)21只用于實(shí)驗(yàn)；野生C57BL/6小鼠購(gòu)買于長(zhǎng)沙市天勤生物技術(shù)有限公司，許可證號(hào)：SCXK(湘)2019-0013，隨機(jī)取3只(6～8周齡)用于實(shí)驗(yàn)；小鼠飼養(yǎng)環(huán)境溫度22 ℃，濕度50%，光照時(shí)間(明/暗 12 h)， 食物和水供應(yīng)充足，小鼠自由飲水、取食。雜合子小鼠繁殖(2雌1雄/籠)，其余小鼠雌雄分開(kāi)，8只/籠。實(shí)驗(yàn)方案符合《動(dòng)物福利行為指南》，并得到遵義醫(yī)科大學(xué)動(dòng)物實(shí)驗(yàn)倫理委員會(huì)的批準(zhǔn)。

1.2 方法

1.2.1 小鼠基因組DNA的提取 采用Mouse Direct PCR Kit試劑盒(B40013，Biotool)提取DNA，嚴(yán)格按照試劑盒說(shuō)明書(shū)操作。剪取所有小鼠的尾尖組織(約0.5 cm)于裂解液(100 μL Buffer L與2 μL Protease plus混勻)中，55 ℃水浴30 min，再95 ℃水浴10 min，12 000 r/min離心10 min，上清液中即含小鼠DNA組，可直接用于擴(kuò)增。

1.2.2 小鼠基因組DNA擴(kuò)增及電泳 設(shè)計(jì)野生型(wild type，WT)引物，序列如下：5'-CCTGGATATAAGCGCCAAAG -3'，5'-CGAGAATTCCATTGCTCAGG-3'；設(shè)計(jì)CSE基因敲除型(CSE-/-)引物，序列如下：5'-CCTGGATATAAGCGCCAAAG-3'， 5'- AGGAACCAGGGCGTATCTCT-3'。上述引物均由上海生工公司合成，按說(shuō)明書(shū)操作，每種引物均稀釋為10 μM。每種引物各加0.1 μL共0.4 μL。具體如下：總體系為20 μL，2×Mix 10 μL，DNA 1μL，DEPC H2O 8.6 μL，引物0.4 μL。擴(kuò)增條件：94 ℃預(yù)變性3 min后，94 ℃ 30 s，57 ℃ 30 s，72 ℃ 30 s，35個(gè)循環(huán)，72 ℃ 5 min后回溫至4 ℃。然后配制濃度為1.5 %(質(zhì)量/體積)瓊脂糖凝膠，按1∶10 000的比例加入EB替代物綠如藍(lán)，混勻，待膠凝固后，拔掉梳子，設(shè)置陽(yáng)性、陰性對(duì)照組，Marker孔加入DNA Marker 5 μL，樣本孔每孔加入7 μL擴(kuò)增后的DNA樣本，放入裝滿1×TAE溶液的電泳槽中，開(kāi)始電泳；提前30 min預(yù)熱凝膠成像系統(tǒng)，電泳完畢，把凝膠置于成像系統(tǒng)上拍照。

1.2.3 小鼠骨髓來(lái)源的巨噬細(xì)胞(BMDM)的分離與培養(yǎng) 處死小鼠后，置75%酒精中浸泡消毒3 min后取其完整具有雙側(cè)股骨與脛骨的后肢，用1 mL無(wú)菌醫(yī)用注射器預(yù)先吸入含10% FBS的1640培養(yǎng)液約0.5 mL，將針頭插入股骨、脛骨的一端，將骨髓細(xì)胞全部吹至新的100 mm平皿中，將全部收集到的骨髓細(xì)胞用200目無(wú)菌不銹鋼篩網(wǎng)過(guò)濾，再轉(zhuǎn)入無(wú)菌離心管，1 000 r/min室溫離心3 min，棄上清；將分離得到的細(xì)胞鋪于6孔板中，加入終濃度20 ng/mL的巨噬細(xì)胞集落刺激因子(315-03-50，Peprotech)，置于37℃ 含5% CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)，第3天換液，6天后即可開(kāi)始后續(xù)實(shí)驗(yàn)。

1.2.4 小鼠腸道組織取材 處死小鼠后，取其結(jié)腸組織(肛門至盲腸段)，用預(yù)冷的PBS沖洗干凈，保存?zhèn)溆谩?/p>

1.2.5 免疫印跡(Western blot)實(shí)驗(yàn) BMDM和腸道組織總蛋白提?。喊凑f(shuō)明書(shū)操作，用含1% PMSF的RIPA裂解液(R0010，Solarbio)裂解BMDM(6孔板，每孔加150 μL)，用移液器將細(xì)胞蛋白收集至EP管中，冰上置30 min，每10 min渦旋震蕩1次；每100 mg腸道組織加1 mL RIPA裂解液，然后勻漿。4 ℃條件下15 000 r/min離心15 min后的上清液即為細(xì)胞或組織總蛋白。采用BCA法測(cè)定細(xì)胞和組織蛋白濃度，分別調(diào)整BMDM、腸道組織蛋白濃度一致，加入1x蛋白上樣緩沖液，98 ℃變性10 min，然后配膠、上樣、轉(zhuǎn)膜、封膜、抗體膜結(jié)合反應(yīng)、顯影，即用免疫印跡法測(cè)定CSE蛋白的表達(dá)，內(nèi)參為GAPDH蛋白，CSE(12217-1-AP，Proteintech)，GAPDH(60004-1-AP，Proteintech)。

2 結(jié)果

2.1 小鼠基因型鑒定 分別提取3只野生型小鼠(CSE+/+)和21只CSE雜合子小鼠(CSE+/-)繁殖后的子代小鼠的基因組DNA，擴(kuò)增后，在瓊脂糖凝膠板上進(jìn)行電泳對(duì)小鼠基因型進(jìn)行鑒定。野生型小鼠DNA作為陽(yáng)性對(duì)照組，加入P泳道；陰性對(duì)照組不加小鼠DNA，用純水代替，加入N泳道。結(jié)果如圖1所示：陽(yáng)性對(duì)照組即野生鼠DNA只在167 bp處有表達(dá)條帶(CSE+/+)，如P泳道所示；陰性對(duì)照組如N泳道所示，在167 bp處、309 bp處均無(wú)表達(dá)條帶；子代小鼠的DNA在167 bp處、309 bp處均有表達(dá)條帶的為雜合子小鼠(CSE+/-)，如1-3、8-11及16泳道所示；其余泳道只在309 bp處有表達(dá)條帶，為CSE基因敲除鼠(CSE-/-)。

以小鼠DNA為模板PCR擴(kuò)增后的瓊脂糖電泳圖，M代表Marker，P代表陽(yáng)性對(duì)照，N代表陰性對(duì)照，1-21代表檢測(cè)樣本。陽(yáng)性對(duì)照只在167 bp處有表達(dá)條帶；陰性對(duì)照無(wú)表達(dá)；CSE+/-小鼠基因組DNA在167 bp處、309 bp處均有表達(dá)條帶；CSE-/-小鼠則只在309 bp處有表達(dá)條帶。圖1 小鼠基因型鑒定電泳

2.2 小鼠BMDM和腸道組織中CSE的蛋白表達(dá) 小鼠基因組DNA基因型鑒定后，隨機(jī)提取6只CSE基因敲除鼠(CSE-/-)骨髓來(lái)源的巨噬細(xì)胞(BMDM)蛋白和腸道組織蛋白，采用免疫印跡法(western blot)檢測(cè)CSE蛋白的表達(dá)并定量分析，3只野生型小鼠(CSE+/+)的對(duì)應(yīng)組織蛋白作為對(duì)照，結(jié)果如圖2所示：CSE-/-鼠腸道組織(圖2A)和BMDM(圖2B)中CSE蛋白表達(dá)顯著性降低(P<0.01)，證明CSE基因敲除后，小鼠相應(yīng)細(xì)胞和組織中CSE蛋白表達(dá)也明顯降低，與基因型鑒定結(jié)果一致，進(jìn)一步證實(shí)我們的小鼠CSE基因型鑒定方法是比較準(zhǔn)確可靠的。

A：腸道組織中CSE蛋白表達(dá)的代表性結(jié)果，WT代表野生型小鼠(n=3)，CSE-/-代表CSE基因敲除鼠與WT比較，P<0.01；B：BMDM中CSE蛋白表達(dá)的代表性結(jié)果，WT代表野生型小鼠(n=3)，CSE-/-代表CSE基因敲除鼠與WT比較，P<0.01。圖2 小鼠腸道組織和BMDM中的CSE蛋白表達(dá)

3 討論

H2S最早被認(rèn)為是污染環(huán)境的有毒氣體，隨著對(duì)H2S研究的深入，發(fā)現(xiàn)CSE是哺乳動(dòng)物機(jī)體內(nèi)源性H2S合成的主要酶之一，主要表達(dá)于外周組織[4-5]。因此，要進(jìn)一步研究H2S在外周組織中的功能，必然會(huì)觀察CSE基因及其蛋白的差異表達(dá)。當(dāng)前，常用的方法就是利用敲除/敲減或過(guò)表達(dá)技術(shù)改變相應(yīng)基因的表達(dá)，進(jìn)而觀察其后續(xù)蛋白表達(dá)差異或進(jìn)一步分析其相關(guān)生物學(xué)功能差異[12]。雖然大量文獻(xiàn)中利用CSE-/-小鼠作為研究動(dòng)物，但針對(duì)CSE基因敲除小鼠基因型鑒定的具體方法少見(jiàn)報(bào)道。因此，本文主要介紹一種具體鑒定方法。

不同策略的基因修飾鼠所用的基因鑒定方法各異，PCR結(jié)合凝膠電泳、PCR結(jié)合酶切或測(cè)序是比較常用的方法。小鼠基因型PCR法鑒定的基本原則是利用基因修飾小鼠基因組與野生型小鼠基因組的序列差異，以小鼠基因組DNA為模板進(jìn)行PCR，并以凝膠電泳對(duì)比不同基因型特異產(chǎn)物的大小(一般差異在100 bp以上)，根據(jù)電泳條帶表達(dá)位置的差異來(lái)區(qū)分小鼠的不同基因型。本研究通過(guò)PCR結(jié)合凝膠電泳的實(shí)驗(yàn)?zāi)軌蚯逦鷧^(qū)分CSE基因敲除小鼠的基因型，只在167 bp處有表達(dá)的是CSE+/+小鼠；在167 bp處、309 bp處均有表達(dá)的是CSE+/-小鼠；只在309 bp處有表達(dá)的是CSE-/-小鼠。

為了進(jìn)一步驗(yàn)證凝膠電泳實(shí)驗(yàn)結(jié)果，采用western blot檢測(cè)WT鼠與CSE-/-鼠腸道組織和巨噬細(xì)胞中CSE蛋白的表達(dá)。結(jié)果顯示，與WT小鼠相比，CSE-/-小鼠腸道組織和BMDM幾乎不表達(dá)CSE蛋白，且與凝膠電泳基因型檢測(cè)結(jié)果一致，證明我們的鑒定方法較為準(zhǔn)確。Ishii等[13]檢測(cè)了CSE-/-小鼠外周組織腎臟和肝臟中CSE蛋白的表達(dá)，相比WT鼠，CSE-/-小鼠肝、腎組織中CSE蛋白表達(dá)顯著性降低。此外，他們還檢測(cè)了CSE+/-小鼠腎臟和肝臟中CSE蛋白的表達(dá)，結(jié)果顯示其表達(dá)比WT鼠低，但遠(yuǎn)高于CSE-/-鼠。Liu等[1]也報(bào)道了CSE-/-小鼠心、肝、脾、肺、腎等臟器中CSE蛋白的表達(dá)，其結(jié)果與我們?cè)谀c道組織和BMDM中的檢測(cè)結(jié)果類似。類比這些研究報(bào)道，可見(jiàn)我們的方法對(duì)于CSE基因敲除小鼠的基因型鑒定是比較準(zhǔn)確可靠的。

綜上所述，為了鑒定CSE基因敲除小鼠的基因型，我們采用的PCR結(jié)合凝膠電泳的方法是一種快速且較為準(zhǔn)確的鑒定方法，可以為使用該動(dòng)物的實(shí)驗(yàn)研究節(jié)約經(jīng)濟(jì)成本和時(shí)間成本。