胃癌組織中LncRNA NBAT1的表達(dá)及意義

陳 禺，李 軍，余壯明，李 合，周曉華，黃 亮

(海南醫(yī)學(xué)院第一附屬醫(yī)院 普通外科，海南 ?？?570102)

胃癌為較常見的惡性腫瘤，雖然手術(shù)聯(lián)合放化療可改善早期胃癌患者預(yù)后，但對于晚期胃癌，患者預(yù)后往往較差[1-2]，因此，探究胃癌的分子生物學(xué)特點，明確其早期診療靶標(biāo)意義重大。長鏈非編碼RNA(LncRNA)為不編碼蛋白質(zhì)RNA，其主要表達(dá)于真核細(xì)胞[3]。成神經(jīng)細(xì)胞瘤相關(guān)轉(zhuǎn)錄本1(Neuroblastoma associated transcript 1,NBAT1)為新近鑒定的功能性LncRNA，其可作為生物標(biāo)記物預(yù)測神經(jīng)母細(xì)胞瘤患者預(yù)后[4]。本課題組前期利用譜芯片對人胃癌細(xì)胞系HGC-27腫瘤球細(xì)胞與貼壁細(xì)胞中的LncRNA NBAT1進(jìn)行檢測，發(fā)現(xiàn)其表達(dá)存在差異性。因此，本研究進(jìn)一步探討胃癌組織中LncRNA NBAT1的表達(dá)及意義，報道如下。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 一般材料 將2018年7月至2019年12月期間，本院收治的88例經(jīng)手術(shù)病理確診的原發(fā)性胃癌患者納入研究，年齡37～72歲，平均年齡(59.13±4.29)；臨床分期：I期～I(xiàn)I期30例，III期～Ⅳ期58例；51例出現(xiàn)淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移；33例發(fā)生深層浸潤。所有患者均簽署知情同意書，符合醫(yī)院倫理要求。收集術(shù)后胃癌組織及癌旁組織(距癌組織>2 cm)作為樣本，癌旁組織經(jīng)病理證實為正常胃組織。采集新鮮樣本后，經(jīng)液氮冷凍，置于-80℃冰箱。

1.1.2 主要試劑與設(shè)備 RNA提取試劑盒、逆轉(zhuǎn)錄試劑盒購自美國ABI公司； qRT-PCR檢測試劑盒購自廣州銳博生物科技有限公司；實時熒光定量PCR儀購自ABI公司；紫外分光光度計購自賽默飛公司；LncRNA NBAT1引物及內(nèi)參β-ACTIN委托上海生工生物工程公司合成。

1.2 方法

1.2.1 RNA提取及逆轉(zhuǎn)錄 根據(jù)RNA提取試劑盒(生產(chǎn)廠家：美國Invitrogen公司)說明書操作，取5m3樣本超聲勻漿，經(jīng)DEPC水溶解后檢測RNA純度及濃度，另取1 μL RNA檢測完整性。根據(jù)逆轉(zhuǎn)錄試劑盒(生產(chǎn)廠家：美國Invitrogen公司)說明書操作(反應(yīng)體系20μL)：RNA樣品 2 μL、引物1 μL、逆轉(zhuǎn)錄酶1 μL、5×RT 緩沖液4 μL、GAPDH 反向引物1μL、RNase 抑制劑 0.5μL、dNTP 混合物(10 mM)1 μL、不含RNase的 H2O 9.5 μL。反應(yīng)條件：42 ℃ 30 s，35 ℃ 15 min，92℃ 1min，4 ℃ 5 min，產(chǎn)物置于-20 ℃。

1.2.2 實時定量聚合酶鏈反應(yīng) 根據(jù)試劑盒說明書操作(反應(yīng)體系25 μL)：引物2 μL、稀釋的cDNA2 μL、SYBR 12.5 μL、ddH2O 8.5 μL。反應(yīng)條件：45 ℃ 1 min，92 ℃ 30 s，55℃ 1 min，72 ℃ 20 s，40個循環(huán)。LncRNA NBAT1上游引物：5’-CGGCTCCAACGATCTGTTCT-3’，下游引物：5’-ACTCATAATCATGCTGCGCG-3’；β-ACTI上游引物：5’-AGCGGTTGTAGGACGTTGATG-3’，下游引物：5’-GGTCGGGTATGTGGACCAA-3’。LncRNA NBAT1的相對表達(dá)量根據(jù)公式 2-ΔΔCt值(LncRNA NBAT1)- 2-ΔΔCt值(β-ACTIN)計算[5]。

2 結(jié)果

2.1 胃癌組織中LncRNA NBAT1的表達(dá)量分析 胃癌組織中LncRNA NBAT1的相對表達(dá)量為(2.35±0.51)，明顯低于癌旁組織(5.03±0.74)，二者比較差異具有統(tǒng)計學(xué)意義(t=27.974，P<0.001)，如圖1所示。

*：與癌旁組織組相比，P<0.001。圖1 組織中LncRNA NBAT1的相對表達(dá)量

2.2 LncRNA NBAT1的表達(dá)量與胃癌患者臨床特征的關(guān)系 LncRNA NBAT1的表達(dá)與胃癌臨床分期、浸潤程度、淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移及脈管癌栓有關(guān)(P<0.05，見表1)。

表1 LncRNA NBAT1的表達(dá)量與臨床特征的關(guān)系

2.3 ROC曲線分析 以LncRNA NBAT1表達(dá)量為連續(xù)變量，以是否為胃癌組織為因變量，繪制ROC曲線，NBAT1臨界值為2.35。由ROC曲線可知，LncRNA NBAT1診斷胃癌的曲線下面積為0.805(95%CI：0.741～0.926)，約登指數(shù)為0.427，診斷特異度為81.54%，敏感度為90.08%，如圖2所示。

圖2 LncRNA NBAT1診斷胃癌的ROC曲線

3 討論

臨床研究顯示，LncRNA普遍表達(dá)于真核細(xì)胞中，其具有豐富的生物學(xué)功能[6]。有文獻(xiàn)報道，胃癌組織中多種LncRNA表達(dá)異常，提示LncRNA可能參與胃癌的發(fā)生進(jìn)展[7-8]。胃癌為臨床常見的惡性腫瘤，盡管胃癌治療規(guī)范己逐步完善，但總體治療效果并不理想[9-10]。因此，探尋胃癌的分子生物學(xué)機制，明確其早期診療靶標(biāo)尤為重要。本課題組前期利用Affymetrix LncRNA表達(dá)譜芯片檢測了人胃癌細(xì)胞系HGC-27腫瘤球細(xì)胞與貼壁細(xì)胞存在差異表達(dá)的LncRNA NBAT1。有研究報道， NBAT1可能是一種腫瘤抑制因子，可通過調(diào)控Arget抑制細(xì)胞增殖和侵襲，并可通過激活NRSF/REST影響神經(jīng)元分化[11]。本研究發(fā)現(xiàn)，胃癌組織中LncRNA NBAT1的相對表達(dá)量明顯低于癌旁組織，LncRNA NBAT1在胃癌組織中呈低表達(dá)。結(jié)果表明，NBAT1可能與胃癌惡性程度有關(guān)， NBAT1表達(dá)的缺失可能會促進(jìn)胃癌進(jìn)展。因此，臨床監(jiān)測胃癌組織中LncRNA NBAT1的表達(dá)有助于判斷胃癌的發(fā)生進(jìn)展，可為臨床治療方式的選擇提供參考。

非小細(xì)胞肺癌組織中NBAT1的表達(dá)顯著降低，其表達(dá)水平有助于評價腫瘤進(jìn)展和預(yù)后，可能是非小細(xì)胞肺癌新治療靶點[12]。邵鳳平[13]研究發(fā)現(xiàn)，LncRNA NBAT1在膀胱癌細(xì)胞株中呈低表達(dá)，下調(diào)NBAT1基因表達(dá)，可提高膀胱癌細(xì)胞增殖活力，促進(jìn)細(xì)胞遷移及侵襲。Mondal等[14]學(xué)者研究發(fā)現(xiàn)，NBAT1為腫瘤抑制因子，其在神經(jīng)母細(xì)胞瘤組織中表達(dá)異常。由以上研究推測，LncRNA NBAT1可能是惡性腫瘤的治療靶點。本研究進(jìn)一步分析了LncRNA NBAT1的表達(dá)量與胃癌患者臨床特征的關(guān)系，結(jié)果提示，LncRNA NBAT1的表達(dá)與胃癌臨床分期、浸潤程度、淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移及脈管癌有關(guān)，且臨床分期越高、浸潤程度越深、發(fā)生淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移及脈管癌的組織中LncRNA NBAT1表達(dá)越低，表明LncRNA NBAT1的表達(dá)與胃癌的發(fā)生、轉(zhuǎn)移有關(guān)，其可能在胃癌中發(fā)揮抑癌作用，其可能對評估胃癌的發(fā)生進(jìn)展有一定臨床價值。有學(xué)者研究報道，NBAT1在胃癌組織中顯著下調(diào)，其表達(dá)下降與分化不良、腫瘤分期及淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移有關(guān)[15]。由以上研究結(jié)果推測，LncRNA NBAT1可作為胃癌臨床診療的潛在生物學(xué)標(biāo)記物。

ROC曲線分析提示，LncRNA NBAT1診斷胃癌的曲線下面積為0.805(95%CI：0.741～0.926)，約登指數(shù)為0.427，診斷敏感度為90.08%，特異度為81.54%。結(jié)果提示，LncRNA NBAT1對胃癌的診斷敏感性和特異性均較高，其表達(dá)與胃癌的惡性程度密切相關(guān)。王順等[16]學(xué)者通過對68例肝癌患者進(jìn)行研究，結(jié)果顯示肝癌組織中LncRNA NBAT1表達(dá)下調(diào)，可能與肝癌的發(fā)生進(jìn)展有關(guān)。Weidle等[17]學(xué)者發(fā)現(xiàn)，包括LncRNA NBAT1在內(nèi)的多種LncRNA都具有體外和體內(nèi)轉(zhuǎn)移相關(guān)的數(shù)據(jù)及臨床意義。另有學(xué)者報道，NBAT1在腎癌細(xì)胞中顯著下調(diào)，可抑制腎癌細(xì)胞增殖，遷移和侵襲[18]。由此可知，LncRNA NBAT1在多種惡性腫瘤的發(fā)生發(fā)展過程中扮演重要角色。

綜上所述，胃癌組織中LncRNA NBAT1呈低表達(dá)，且其表達(dá)水平可能與胃癌的發(fā)生進(jìn)展有關(guān)，LncRNA NBAT1可能在胃癌的發(fā)生進(jìn)展過程中發(fā)揮抑癌作用。