miR-7155-3p在乳腺癌患者血清中的表達及對乳腺癌細(xì)胞增殖和侵襲的影響

咼 月，黃玉琴，張玉毅，許乃寒，胡 波

(湖北醫(yī)藥學(xué)院附屬襄陽市第一人民醫(yī)院 腫瘤科，湖北 襄陽 441000)

乳腺癌是全球女性最常見的惡性腫瘤之一，其發(fā)病率呈逐年增加的趨勢，嚴(yán)重危害女性身體健康[1]。手術(shù)切除、放療、化療、內(nèi)分泌治療是乳腺癌的主要治療方式，大多數(shù)乳腺癌患者的預(yù)后較好，然而仍有部分晚期患者的治療效果很差[2-3]。探究新的診斷標(biāo)志物和治療靶點對提供全球乳腺癌診療水平具有重要意義。微小 RNA(microRNA，miRNA)是一類由19至26個核苷酸構(gòu)成的非編碼單鏈RNA，通過與下游靶基因的信使RNA(mRNA)3’非翻譯區(qū)互補配對，降解靶基因mRNA或直接抑制其翻譯[4]。miRNA是近年來細(xì)胞生物學(xué)研究的熱點，通過影響腫瘤細(xì)胞的生長和轉(zhuǎn)移等病理過程，參與調(diào)控惡性腫瘤的發(fā)生、發(fā)展[5]。miR-7155-3p是一個新發(fā)現(xiàn)的miRNA，僅有研究表明miR-7155-3p在急性心肌梗死患者血清中異常低表達[6]。miR-7155-3p在腫瘤特別是乳腺癌中的表達、功能及作用機制尚未明確。本研究旨在觀察miR-7155-3p在乳腺癌患者血清及乳腺癌細(xì)胞系中的表達，探討其對乳腺癌細(xì)胞增殖和侵襲的影響及其作用機制，為乳腺癌的分子診斷和基因靶向治療提供一定的實驗依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 臨床標(biāo)本 收集2018年9月至2019年5月本院住院的乳腺癌患者40例，術(shù)前采集靜脈血，所有患者術(shù)后均經(jīng)病理檢查確診為乳腺浸潤性導(dǎo)管癌，術(shù)前均未進行放療、化療藥物治療。40例乳腺癌患者按TNM分期為Ⅰ期9例、Ⅱ期14例、Ⅲ期15例、Ⅳ期2例。選取體檢健康女性40例，采集靜脈血。本研究經(jīng)醫(yī)院倫理委員會批準(zhǔn)，所有受試者均簽署知情同意書。

1.2 細(xì)胞與試劑 乳腺癌細(xì)胞系MCF7、HCC1937、MB-MDA-468、SKBR3和人永生化正常乳腺上皮細(xì)胞MCF-10A購于美國ATCC細(xì)胞庫；RPMI-1640培養(yǎng)基、DMEM/F12培養(yǎng)基及胎牛血清購于美同Hyclone公司；Lipofectamine 3000購于美國Invitrogen公司；雙熒光素酶報告實驗試劑盒購于美國Promega公司；Transwell小室購于美國Millipore公司；野生型TRIB1基因3′端非翻譯區(qū)熒光素酶質(zhì)粒及其突變型質(zhì)粒購于美國Promega公司；聚合酶鏈反應(yīng)(Real-time PCR，RT-PCR)試劑盒購于武漢博士德生物工程有限公司；miR-NC(陰性對照序列)和miR-7155-3p 模擬物由上海吉凱生物工程有限公司合成；MTT試劑盒購于上海碧云天生物科技有限公司；Matrigel基質(zhì)膠購于美國BD公司；抗體(β-Tubulin、TRIB1、p-Ras、p-Raf、p-MEK、p-ERK1/2)購于美國CST公司。

1.3 細(xì)胞培養(yǎng)與轉(zhuǎn)染 MCF7、HCC1937、SKBR3接種于含10%胎牛血清、100 U/mL青霉素、100 U/mL鏈霉素的RPMI-1640培養(yǎng)基，MB-MDA-468、MCF-10A接種于含10%胎牛血清、100 U/L青霉素、100 U/mL鏈霉素的DMEM/F12培養(yǎng)基，在37°C 5% CO2培養(yǎng)箱中進行培養(yǎng)。由于miR-7155-3p在SKBR3細(xì)胞中表達最低，取對數(shù)生長期的SKBR3細(xì)胞接種于6孔板，待細(xì)胞融合度為40%～60%時，按Lipofectamine 3000說明書配制轉(zhuǎn)染體系，分別轉(zhuǎn)染miR-NC和miR-7155-3p模擬物，命名為miR-NC組和miR-7155-3p組。轉(zhuǎn)染8 h后更換為新鮮培養(yǎng)基。

1.4 RT-PCR檢測miR-7155-3p和TRIB1的表達 Trizol法提取血清和細(xì)胞中總RNA，采用紫外分光光度計檢測RNA純度和濃度，取500 ng總RNA逆轉(zhuǎn)錄為cDNA。按試劑盒說明書，配制RT-PCR反應(yīng)體系。分別以GAPDH和U6為內(nèi)參，檢測TRIB1和miR-7155-3p的表達。miR-7155-3p上游引物：5’- GGTCTGAGGTCTTGGG-3’，下游引物：5’-CAGTGCGTGTCGTGGAGT-3’。β-Tubulin上游引物：5’-TGGTGGACTTAGAGCCAGG-3’，下游引物：5’-CCCTTTCGCCCAGTTGTTC-3’。U6上游引物：5’-CTCGCTTCGGCAGCACA-3’，下游引物：5’-AACGCTTCACGAATTTGCGT-3’。TRIB1上游引物：5’-GCTGCAAGGTGTTTCCCATTA-3’，下游引物：5’- TCCCCAAAGTCCTTCTCAAAGA-3’。設(shè)定擴增條件：95 ℃變性5 min、95 ℃ 10 s、60 ℃ 25 s、70 ℃ 25 s，40個循環(huán)。采用2-ΔΔCt法進行計算。

1.5 生物信息學(xué)軟件預(yù)測及雙熒光素酶報告實驗驗證 采用生物信息學(xué)軟件miRTarBase和miRDB預(yù)測，miR-7155-3p的下游靶基因可能是TRIB1。將對數(shù)生長期SKBR3細(xì)胞接種于6孔板，隨機分為4組：野生型+miR-NC組(轉(zhuǎn)入野生型質(zhì)粒+miR-NC)、野生型+miR-7155-3p組(轉(zhuǎn)入野生型質(zhì)粒+miR-7155-3p)、突變型+miR-NC組(轉(zhuǎn)入突變型質(zhì)粒+miR-NC)、突變型+miR-7155-3p組(轉(zhuǎn)入突變型質(zhì)粒+miR-7155-3p)。采用雙熒光素酶報告實驗試劑盒檢測每組螢火蟲熒光素酶活性和海腎熒光素酶活性，以兩者的比值代表相對熒光素酶活性。

1.6 Western blot 收集轉(zhuǎn)染72 h的SKBR3細(xì)胞，采用RIPA裂解液裂解，檢測蛋白濃度。采用十二烷基硫酸鈉-聚丙烯酰胺凝膠電泳分離蛋白，硝酸纖維素膜轉(zhuǎn)膜，封閉液在室溫下封閉。以1∶1 000稀釋相應(yīng)一抗，在4 °C下孵育過夜。以1∶5 000稀釋相應(yīng)二抗，在室溫下孵育。滴加ECL顯影液，在凝膠成像系統(tǒng)中曝光顯影。

1.7 MTT檢測SKBR3細(xì)胞增殖能力 收集轉(zhuǎn)染72 h的SKBR3細(xì)胞，接種到新的96孔板。MTT檢測時，加入50 μL/孔 MTT試劑，培養(yǎng)箱中培養(yǎng)4 h。加入150 μL/孔二甲基亞砜，搖床振蕩，采用酶標(biāo)儀檢測在470 nm處每孔的吸光度(A)值。每天檢測1次，連續(xù)檢測5次。實驗重復(fù)4次。

1.8 Transwell侵襲實驗檢測SKBR3細(xì)胞侵襲能力 采用不含血清的培養(yǎng)基稀釋Matrigel基質(zhì)膠，加入100 μL/孔包被Transwell小室上室面，培養(yǎng)箱內(nèi)凝固后放入24孔板。收集轉(zhuǎn)染72 h的SKBR3細(xì)胞，采用不含血清的培養(yǎng)基調(diào)整細(xì)胞密度(4×106個/mL)，接種3×104個細(xì)胞至小室上室，24孔板每孔加入500 μL含血清的培養(yǎng)基。培養(yǎng)箱中培養(yǎng)24 h后，采用甲醇固定10 min，0.1%結(jié)晶紫染色10 min，棉簽擦去上室面多余細(xì)胞，沖洗多余染色。在100倍倒置顯微鏡下觀察、計數(shù)穿膜細(xì)胞數(shù)，實驗重復(fù)4次。

2 結(jié)果

2.1 miR-7155-3p在乳腺癌患者血清中的表達 RT-PCR結(jié)果顯示，乳腺癌患者血清和正常人血清中miR-7155-3p表達量分別為(1.03±0.17)和(4.99±0.67)。與正常人血清相比，乳腺癌患者血清中miR-7155-3p的表達明顯降低(見圖1)。

*：與正常人血清相比，P<0.01。 圖1 miR-7155-3p在乳腺癌患者血清和正常人血清中的表達

2.2 miR-7155-3p在乳腺癌細(xì)胞系中的表達 RT-PCR結(jié)果顯示，與MCF-10A細(xì)胞相比，乳腺癌細(xì)胞系中miR-7155-3p的表達較低。SKBR3細(xì)胞中miR-7155-3p的表達最低，故選擇SKBR3細(xì)胞進行研究(見圖2)。

*：與MCF-10A細(xì)胞相比，P<0.01。 圖2 miR-7155-3p在乳腺癌細(xì)胞和正常乳腺上皮細(xì)胞中的表達

2.3 RT-PCR檢測轉(zhuǎn)染后miR-7155-3p的表達 RT-PCR的結(jié)果表明，miR-7155-3p組乳腺癌SKBR3細(xì)胞中miR-7155-3p的表達水平(8.52±1.96)明顯高于miR-NC組(1.08±0.23)，提示外源性miR-7155-3p在SKBR3細(xì)胞中成功表達。

2.4TRIB1基因3’非翻譯區(qū)與miR-7155-3p配對序列 采用生物信息學(xué)軟件miRTarBase和miRDB預(yù)測，miR-7155-3p的下游靶基因可能是TRIB1。如圖3，miR-7155-3p種子區(qū)存在與TRIB1基因mRNA的3’非翻譯區(qū)互補配對的序列。

圖3 miR-7155-3p與 TRIB1 3′UTR互補配對的序列

2.5 雙熒光素酶報告實驗 與野生型+miR-NC組相比，野生型+miR-7155-3p組相對熒光素酶活性較低(見圖4)，表明miR-7155-3p可有效抑制野生型質(zhì)粒熒光素酶活性。因此，miR-7155-3p可有效與野生型質(zhì)粒3′-UTR區(qū)結(jié)合。

A：野生型+miR-NC；B：野生型+miR-7155-3p；C：突變型+miR-NC；D：突變型+miR-7155-3p；*：與野生型+miR-NC相比，P<0.01。圖4 雙熒光素酶報告實驗

2.6 RT-PCR檢測轉(zhuǎn)染后TRIB1的表達 RT-PCR的結(jié)果表明，miR-7155-3p組乳腺癌SKBR3細(xì)胞中TRIB1的表達水平(0.31±0.07)明顯低于miR-NC組(1.02±0.14)，表明miR-7155-3p可下調(diào)SKBR3細(xì)胞中TRIB1的表達。

2.7 miR-7155-3p對乳腺癌SKBR3細(xì)胞TRIB1及MAPK信號通路蛋白表達的影響 Western blot結(jié)果顯示(見圖5)，與miR-NC組相比，miR-7155-3p組的TRIB1表達水平降低，MAPK信號通路蛋白p-Ras、p-Raf、p-MEK、p-ERK1/2蛋白表達水平降低。

圖5 轉(zhuǎn)染miR-7155-3p對乳腺癌SKBR3細(xì)胞中TRIB1及MAPK信號通路蛋白表達的影響

2.8 miR-7155-3p對乳腺癌SKBR3細(xì)胞增殖的影響 MTT法檢測結(jié)果顯示(見圖6)，與 miR-NC組相比，miR-7155-3p組的SKBR3細(xì)胞增殖活力明顯降低。

*：與miR-NC組相比，P<0.05；**：與miR-NC組相比，P<0.01。 圖6 轉(zhuǎn)染miR-7155-3p對乳腺癌SKBR3細(xì)胞增殖的影響

2.9 miR-7155-3p對乳腺癌SKBR3細(xì)胞侵襲的影響 由圖7可見，miR-7155-3p組穿透濾膜的細(xì)胞數(shù)(31.49±7.60)個明顯少于轉(zhuǎn)染miR-NC組穿透濾膜的細(xì)胞數(shù)(80.14±8.92)個。Transwell實驗的結(jié)果顯示過表達miR-7155-3p可抑制乳腺癌細(xì)胞SKBR3的侵襲能力。

*：與miR-NC組相比，P<0.01。 圖7 轉(zhuǎn)染miR-7155-3p對乳腺癌SKBR3細(xì)胞侵襲的影響

3 討論

miRNA 在腫瘤細(xì)胞中的異常表達與腫瘤的發(fā)生、發(fā)展顯著相關(guān)，參與腫瘤生長、轉(zhuǎn)移、血管生成等多種病理過程，miRNA為腫瘤的分子診斷、靶向治療提供了新的方向[7-8]。越來越多的miRNA被證明在乳腺癌中表達上調(diào)或下調(diào)，起著“癌基因”或“抑癌基因”的作用[9-11]。You等[12]研究報道，miR-106a在乳腺癌組織中異常高表達，上調(diào)miR-106a可顯著增強乳腺癌細(xì)胞的增殖、遷移和侵襲能力，同時miR-106a過表達可顯著降低乳腺癌細(xì)胞對順鉑的敏感性。Zhang等[13]研究報道，在體內(nèi)和體外實驗中，上調(diào)miR-135b-5p均可增加乳腺癌細(xì)胞對阿霉素的敏感性。Huang等[14]研究報道，miR-370在乳腺癌中異常高表達，且其表達水平與乳腺癌患者的預(yù)后不良有關(guān)，miR-370可促進乳腺癌細(xì)胞的生長。miR-7155-3p作為一種新發(fā)現(xiàn)的miRNA，在急性心肌梗死患者血清中異常低表達，血清中miR-7155-3p的表達模式可能對疾病的診斷具有一定的指導(dǎo)意義[6]。miR-7155-3p在乳腺癌中的研究尚未見報道。

本研究結(jié)果表明，與健康人血清相比，miR-7155-3p在乳腺癌患者血清中明顯低表達，提示miR-7155-3p可能在乳腺癌中具有分子診斷標(biāo)志物價值。與正常乳腺上皮細(xì)胞相比，miR-7155-3p在乳腺癌細(xì)胞系中明顯低表達，提示miR-7155-3p可能參與乳腺癌的發(fā)生、發(fā)展。采用生物信息學(xué)軟件miRTarBase和miRDB預(yù)測，miR-7155-3p的下游靶基因可能是TRIB1，miR-7155-3p種子區(qū)存在與TRIB1基因mRNA的3’非翻譯區(qū)互補配對的序列。TRIB1是一種Tribbles同源蛋白，包含N端結(jié)構(gòu)域、C端結(jié)構(gòu)域和中心假激酶結(jié)構(gòu)域[15]。TRIB1具有激酶活性，參與調(diào)解多種信號通路的轉(zhuǎn)導(dǎo)[16]。TRIB1在包括結(jié)直腸癌、前列腺癌、在內(nèi)的多種惡性腫瘤中異常高表達，作為癌基因顯著促進腫瘤細(xì)胞的生長和轉(zhuǎn)移[17-18]。TRIB1的異常高表達可促進乳腺癌細(xì)胞的增殖，與乳腺癌患者的不良預(yù)后顯著相關(guān)[19]。雙熒光素酶報告實驗進一步證明，miR-7155-3p可與TRIB1基因mRNA的3′ 非翻譯區(qū)互補配對。RT-PCR和Western blot顯示，在乳腺癌細(xì)胞SKBR3中上調(diào)miR-7155-3p后，TRIB1基因表達降低，表明miR-7155-3p可抑制TRIB1基因的表達。絲裂原活化蛋白激酶(MAPK)信號通路在乳腺癌細(xì)胞增殖和侵襲等過程中發(fā)揮重要作用[20]。Western blot顯示，乳腺癌細(xì)胞SKBR3中TRIB1基因表達降低后，MAPK信號通路蛋白如p-Ras、p-Raf、p-MEK、p-ERK1/2表達降低，提示乳腺癌細(xì)胞MAPK信號通路被阻滯。MTT實驗和Transwell實驗進一步證明，miR-7155-3p過表達可明顯抑制SKBR3細(xì)胞的增殖和侵襲能力。

綜上所述，miR-7155-3p在乳腺癌患者血清和細(xì)胞系中表達顯著降低，miR-7155-3p可能通過靶向下調(diào)TRIB1的表達，阻滯MAPK信號通路，抑制乳腺癌的增殖和侵襲能力。miR-7155-3p可能在乳腺癌分子診斷和基因靶向治療中具有一定的研究意義。