松柏醇的化學(xué)合成及抗炎鎮(zhèn)痛活性研究

王朝群，白育軍，楊 燕，何希瑞

(1.遵義醫(yī)科大學(xué) 珠海校區(qū)生物工程系，廣東 珠海 519041；2.西北大學(xué) 生命科學(xué)與醫(yī)學(xué)部藥學(xué)院，陜西 西安 710069)

炎癥是生物體在創(chuàng)傷、感染等有害刺激下產(chǎn)生的一種防御反應(yīng)，有利于炎癥因子的識(shí)別和消除。當(dāng)免疫失衡時(shí)，生物體對炎癥因子的反應(yīng)減弱或增強(qiáng)，從而導(dǎo)致多種疾病[1-2]。目前治療炎癥的藥物主要有非甾體類抗炎藥如阿司匹林，及甾體抗炎藥如糖皮質(zhì)激素類[3-4]。其中，非甾體抗炎藥具有強(qiáng)效抗炎、鎮(zhèn)痛和解熱活性，是目前使用最廣泛的藥物之一。一般認(rèn)為，其核心機(jī)制之一是抑制環(huán)氧化酶的活性。然而，這些藥物在臨床使用過程中常出現(xiàn)一些不良反應(yīng)，極大限制了其廣泛使用[5-6]。如非甾體抗炎藥與胃腸道、腎臟和心血管不良反應(yīng)的風(fēng)險(xiǎn)增加密切相關(guān)。因此，安全高效抗炎藥物的研究與開發(fā)一直是生物醫(yī)學(xué)領(lǐng)域的重要課題。天然產(chǎn)物由于具有化學(xué)結(jié)構(gòu)新穎、多靶點(diǎn)、活性多樣、副作用相對小的特點(diǎn)及優(yōu)勢，一直以來廣受科研人員的重視[7-8]。尋求具有高效抗炎鎮(zhèn)痛活性的植物源化合物具有重要意義。

松柏醇(Coniferyl alcohol，CA)，又名4-羥基-3-甲氧基肉桂醇，是松柏苷的去葡萄糖化產(chǎn)物[9]。其廣泛存在于蛇菰、問荊、黃柏、枳殼、銀杏和柑橘等許多植物中。在藥物應(yīng)用領(lǐng)域，CA是抗肝炎藥物水飛薊賓合成的關(guān)鍵中間體。水飛薊賓是由紫杉葉素和CA按1∶1的比例偶合而成，具有抗炎、肝保護(hù)等多種藥理作用，是目前發(fā)現(xiàn)的最具保肝療效的類黃酮[10-11]，但迄今針對松柏醇本身的生物活性研究較少。本文以阿魏酸為原料，經(jīng)酯化還原獲得目標(biāo)化合物CA。然后，以LPS誘導(dǎo)的小鼠RAW264.7巨噬細(xì)胞為研究對象，運(yùn)用MTT、ELISA等方法探究CA對LPS致RAW264.7細(xì)胞損傷的保護(hù)作用及作用機(jī)制；構(gòu)建炎癥及疼痛動(dòng)物模型，探討松柏醇的在體抗炎鎮(zhèn)痛活性。

1 材料與方法

1.1 材料 松柏醇(實(shí)驗(yàn)室合成，純度≥98%)；RAW264.7小鼠巨噬細(xì)胞系(中國醫(yī)學(xué)科學(xué)院)；DMEM高糖、胰蛋白酶和胎牛血清等購自Gibco，100 U/ml青霉素、硫酸鏈霉素DMSO等購自百靈威；ELISA試劑盒購自南京建成生物工程研究所；阿魏酸、DIBAL-H等原料或試劑購自阿拉?。淮姿?中國泰山新寧制藥公司)；角叉菜膠(日本和田純化工)。

KM雄性小鼠[SCXK(粵)2020-0051，24-26 g]，8周齡，飼養(yǎng)環(huán)境：12 h的光/暗循環(huán)，室溫22±2℃，自由獲取食物和水。

1.2 儀器 CO2恒溫培養(yǎng)箱(Thermo，美國)；ThermoK3全自動(dòng)酶標(biāo)儀(Thermo，美國)；電子數(shù)顯卡尺(樂清市禾有限公司)；質(zhì)譜(HPLC-6520 Q-TOF，美國)；核磁[Gemini 2000 (VnmrS600 MHz)，美國]；紅外光譜(NICOLET 5700，美國)；熔點(diǎn)儀(WRS- 1B，上海易測)。

1.3 方法

1.3.1 松柏醇的合成與結(jié)構(gòu)表征

(1)合成路線

松柏醇的合成路線如圖1所示[12]：

圖1 松柏醇2的合成

(2)合成步驟

① 阿魏酸乙酯1的合成 于250 mL三口瓶中加入阿魏酸 (10.0 g,51.5 mmol),無水乙醇 120 mL,攪拌下冰浴降溫至5 °C，分批加入氯化亞砜(36.8 g,309.3 mmol)。升高溫度至78 °C，反應(yīng)8 h后室溫冷卻，減壓濃縮除去雜質(zhì)，殘留物經(jīng)水沖洗兩次。然后選用乙酸乙酯(100 mL)萃取3次，有機(jī)相經(jīng)干燥，濃縮得淺黃色固體粉末。粗品經(jīng)硅膠柱層析[洗脫劑∶二氯甲烷∶乙酸乙酯(3∶1～1 ∶1)]得到純品。

② 松柏醇2的合成 取阿魏酸乙酯 (2.22 g,10.0 mmol) 加入100 mL三口瓶中，加入50 mL甲苯溶解，氮?dú)獗Ｗo(hù)下降低反應(yīng)液的溫度至-70 °C。20 min內(nèi)滴加1.5 mol/L DIBAL-H 20 mL，控制反應(yīng)液溫度不低于-60 °C。滴加完畢后自然狀態(tài)下升溫至-20 °C，維持20 min。TLC檢測反應(yīng)進(jìn)程(若反應(yīng)未徹底完成，則繼續(xù)滴加適量的DIBAL-H)。降溫至-60 °C后滴加稀堿液淬滅反應(yīng)，攪拌均勻，滴加稀酸，調(diào)節(jié)PH至4-5。用硅土過濾，然后依次用乙酸乙酯，乙酸乙酯：甲醇(8∶1)洗滌，濾液濃縮得1.2 g粗產(chǎn)物。粗產(chǎn)物經(jīng)硅膠柱層析分離得到純品[洗脫劑為石油醚∶乙酸乙酯(2∶1～1∶2)]。所得樣品采用紅外、質(zhì)譜、核磁并結(jié)合熔點(diǎn)測試進(jìn)行結(jié)構(gòu)確證。

1.3.2 抗炎鎮(zhèn)痛活性研究

(1)細(xì)胞培養(yǎng) 將RAW264.7巨噬細(xì)胞從液氮中快速取出。復(fù)蘇后，將細(xì)胞加入到含有胎牛血清的DMEM培養(yǎng)基中，置于CO2恒溫培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。當(dāng)RAW264.7細(xì)胞完全貼壁生長至80%時(shí)，用胰蛋白酶消化，按1:3的比例傳代，繼續(xù)培養(yǎng)直至細(xì)胞完全貼壁生長至80%時(shí)，用于后續(xù)的實(shí)驗(yàn)。

(2)細(xì)胞分組與干預(yù) 將RAW264.7細(xì)胞分為正常對照組、模型對照組(LPS，1 μg/mL)、CA低、中、高劑量組(4、8、16 μmol/L)。除正常對照組外，各組均給予1 μg/mL的LPS構(gòu)建炎癥模型。

(3)細(xì)胞活性測定 采用MTT法檢測RAW264.7細(xì)胞活力。取RAW264.7細(xì)胞接種于96孔板中，每孔的細(xì)胞密度為4×104個(gè)。置于5% CO2恒溫(37℃)培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。12 h后，棄去培養(yǎng)液，用不同濃度的CA(1、2、4、8、16、32 μmol/L)處理細(xì)胞并在相同的條件下孵育 12 h，加入 10 μL MTT后繼續(xù)置于培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。4 h后，棄去培養(yǎng)基，于每孔中加入100 μL DMSO。使用全自動(dòng)酶標(biāo)儀測量每孔在450 nm處吸光度值，計(jì)算細(xì)胞活力。此外，評價(jià)CA對LPS誘導(dǎo)的RAW264.7細(xì)胞損傷保護(hù)作用時(shí)，用不同濃度的松柏醇(4、8和16 μmol/L)處理細(xì)胞并在相同的條件下孵育 12 h。4 h后，除正常對照組外，各組均加入1 μg/mL的LPS。然后在相同的條件下繼續(xù)孵育，24 h后，測定細(xì)胞活力。

(4) NO含量和PGE2測定 RAW264.7細(xì)胞接種及培養(yǎng)條件同上。用不同濃度的CA(4、8、16 μmol/L)處理細(xì)胞并在相同的條件下孵育。4 h后，除正常對照組外，各組均加入1 μg/mL的LPS。然后在相同的條件下繼續(xù)孵育，24 h后，格里斯試劑法測定NO的產(chǎn)生量。具體方法為：分別吸取50 μL上清液，轉(zhuǎn)移到另一個(gè)96孔板中，并加入50 μL格里斯試劑A，充分混勻。在室溫下放置5分鐘后，加入100 μL 格里斯試劑B，充分混勻。5分鐘后，使用酶標(biāo)儀測量每孔樣品在540 nm處的吸光度。采用酶聯(lián)免疫吸附法測定試劑盒測定細(xì)胞液中PGE2的生成水平，酶標(biāo)儀上的測定波長為405 nm。

(5)TNF-α、IL-6和IL- 1β含量測定 分組及細(xì)胞處理同上，取細(xì)胞培養(yǎng)液，按照酶聯(lián)免疫吸附測定試劑盒說明書所列方法測定細(xì)胞液中TNF-α、IL-6及IL- 1β的含量。用于測定TNF-α、IL-6、和IL-1β的樣品至于酶標(biāo)儀中，測定450 nm處吸光度，并計(jì)算含量。

(6)角叉菜膠誘導(dǎo)小鼠足腫脹實(shí)驗(yàn) 本研究采用角叉菜膠致小鼠后足水腫模型評價(jià)CA的在體抗炎活性。將小鼠隨機(jī)分為生理鹽水(10 ml/kg，i.p.)、吲哚美辛(INDO，40 mg/kg，i.p.)及松柏醇(20、40和80 mg/kg，i.p.)組。給藥前，先用電子數(shù)顯卡尺測定每只小鼠后腳趾的初始厚度。腹腔給藥30 min后，將濃度為2%的角叉菜膠溶液皮下注射到小鼠右后爪。分別于注射角叉菜膠后60、120、180 min用電子數(shù)顯卡尺測量小鼠右足趾厚度，計(jì)算抑制率。

(7) 醋酸致小鼠扭體法 采用0.7 %醋酸致小鼠扭體實(shí)驗(yàn)?zāi)Ｐ驮u價(jià)CA的在體鎮(zhèn)痛活性。分組和給藥與“1.3.2-(6)”項(xiàng)下類似。給藥30 min后，每只小鼠腹腔注射0.7 %醋酸溶液(0.1 mL/10 g)。記錄每只小鼠在0～30 min內(nèi)腹部收縮或拉伸的次數(shù)，評價(jià)鎮(zhèn)痛作用強(qiáng)弱。

1.3.3 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理 抗炎及鎮(zhèn)痛活性數(shù)據(jù)均以“均值±標(biāo)準(zhǔn)差”的形式展示。使用GraphPad Prism 5進(jìn)行分析并繪制圖形。計(jì)量資料采用單因素方差(One way ANOVA)分析， Newman-Keuls 法進(jìn)行多重比較；率的比較采用卡方檢驗(yàn)。以P<0.05為有統(tǒng)計(jì)學(xué)差異。

2 結(jié)果

2.1 松柏醇的結(jié)構(gòu)表征 本研究共合成中間體阿魏酸乙酯(淺黃色固體產(chǎn)物)10.3 g (收率 89.4%)。經(jīng)核磁確認(rèn)和已報(bào)道的阿魏酸乙酯結(jié)構(gòu)相符合；共合成1.1 g 松柏醇純品(白色固體產(chǎn)物)，收率為61.1%。經(jīng)核磁、質(zhì)譜等確認(rèn)和已報(bào)道的CA的結(jié)構(gòu)相符。阿魏酸乙酯1及CA 2的理化性質(zhì)和波譜數(shù)據(jù)如下：

2.2 松柏醇對 RAW264.7 巨噬細(xì)胞活力的影響 本實(shí)驗(yàn)中，采用MTT考察了不同濃度的CA預(yù)處理RAW264.7細(xì)胞的生長情況。結(jié)果表明，與正常對照組相比，CA在1,2,4,8,16和32 μmol/L劑量下對RAW264.7細(xì)胞的生長無顯著抑制作用(P=0.8356)，見圖2A。其在32 μmol/L也沒有明顯的細(xì)胞毒性(細(xì)胞存活率>85%)，表明在該濃度范圍內(nèi)，CA對RAW264.7細(xì)胞無細(xì)胞毒性。由圖2B所示，與正常對照組相比，1 μg/mL LPS可顯著抑制RAW264.7細(xì)胞生長(P<0.05)。與LPS組相比，CA在4,8 和16 μmol/L濃度下可提高LPS誘導(dǎo)的RAW264.7細(xì)胞活力，且呈現(xiàn)明顯的劑量依賴性。其中，CA在16 μmol/L時(shí)顯著提高LPS刺激RAW264.7細(xì)胞的存活率(P<0.05)。因此，CA對 LPS 誘導(dǎo)的 RAW264.7 細(xì)胞損傷具有較好的保護(hù)作用。

#：與正常組相比，P<0.05；*:與模型組相比，P<0.05。圖2 不同濃度CA對 RAW264.7 細(xì)胞活力的影響

2.3 松柏醇對NO釋放和PGE2生成的影響 如圖3A所示，CA在濃度為4、8和16 μmol/L時(shí)表現(xiàn)出不同程度的NO抑制作用。值得注意的是，CA在8和16 μmol/L時(shí)對NO釋放的抑制率分別為38.28%和52.56%。如圖3B所示，在 LPS 刺激后，PGE2生成量顯著增加(P<0.001)。與LPS組相比，CA可劑量依賴性地降低PGE2水平，其在4，8和16 μmol/L時(shí)的抑制率分別為17.77%，38.94%和48.54%。

###:與正常組相比，P<0.001；*、**、***:分別與模型組相比，P<0.05，P<0.01，P<0.001。圖3 CA對NO釋放和PGE2生成的影響

2.4 松柏醇對TNF-α、IL-1β和IL-6水平的影響 通過ELISA法檢測CA對LPS誘導(dǎo)RAW264.7細(xì)胞培養(yǎng)液中TNF-α、IL-1β和IL-6含量的變化。結(jié)果表明，與正常對照組相比，LPS誘導(dǎo)組細(xì)胞培養(yǎng)液中TNF-α、IL-1β和IL-6含量均顯著升高(P<0.001)。如圖4A所示，CA對TNF-α的含量影響不大，僅在16 μmol/L時(shí)降低TNF-α水平(P<0.05)。如圖4B所示，CA(4、8 μmol/L)干預(yù)后細(xì)胞培養(yǎng)液中的IL-1β含量有所降低，但差異不顯著(P>0.05)，而CA(16 μmol/L)組IL-1β含量降低具有極顯著的統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.001)。如圖4C所示，與模型組相比，CA在8 和16 μmol/L的劑量干預(yù)后可明顯下調(diào)細(xì)胞上清液中IL-6的水平。結(jié)果表明，松柏醇可抑制炎癥細(xì)胞因子和介質(zhì)，如TNF-α,IL-6等。

###：與正常組相比，P<0.001；**、***:分別與模型組相比，P<0.01，P<0.001。圖4 CA對TNF-α、IL-1β和IL-6水平的影響

2.5 松柏醇對角叉菜膠誘導(dǎo)小鼠足腫脹程度的影響 在體實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，與模型組相比，腹腔注射松柏醇(20、40 mg/kg)能顯著減少角叉菜膠致小鼠1 h、2 h和3 h時(shí)的足腫脹程度，且顯示出一定的時(shí)間和劑量依賴性(見圖5A)。由圖5B所示，模型組小鼠注射角叉菜膠后1 h、2 h和3 h的足腫脹率分別為31.21%、45.83%和50.42%。陽性藥吲哚美辛(10 mg/kg)小鼠1 h、2 h和3 h足腫脹率分別為18.27%，24.76%和 29.97%。CA與陽性藥作用類似，CA(40 mg/kg)給藥后小鼠在1 h、2 h和3 h時(shí)的足腫脹率分別為10.28%，14.19%和 21.74%，顯示出較好的抗炎活性。

*、**、***：分別與模型組相比，P<0.05，P<0.01，P<0.001。圖5 CA對角叉菜膠誘導(dǎo)小鼠足腫脹程度的影響

2.6 松柏醇對醋酸致小鼠扭體反應(yīng)的影響 在醋酸誘導(dǎo)的小鼠扭體反應(yīng)實(shí)驗(yàn)中，與模型組比較，CA在20和40 mg/kg劑量下顯著減少小鼠扭體次數(shù)(見表1)，抑制率分別為48.49 %(P<0.01)和61.53%(P<0.01)。陽性藥吲哚美辛(20 mg/kg)也顯示出類似的抑制作用，抑制率為85.27%(P<0.001)。

表1 CA對醋酸致小鼠扭體反應(yīng)的影響

3 討論

本研究首先以阿魏酸為原料，合成了1.1 g松柏醇純品，并采用RAW264.7細(xì)胞和小鼠炎癥及疼痛模型評價(jià)了松柏醇的抗炎鎮(zhèn)痛活性。動(dòng)物實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，與非甾體抗炎藥吲哚美辛相似，松柏醇具有顯著的在體抗炎鎮(zhèn)痛活性。體外活性研究揭示，松柏醇能提高LPS刺激RAW264.7細(xì)胞存活率，且顯著減少炎癥因子產(chǎn)生，從而發(fā)揮抗炎作用，這為松柏醇在抗炎方面的研究或應(yīng)用提供實(shí)驗(yàn)支持。

炎癥在組織的防御反應(yīng)中起著重要作用，用以應(yīng)對病原體、外源性物質(zhì)、輻照甚至應(yīng)對受損細(xì)胞[13]。巨噬細(xì)胞活化在多種炎癥性疾病的發(fā)病機(jī)制中發(fā)揮作用。LPS是一種激活多種炎癥信號(hào)的病原體，LPS誘導(dǎo)的RAW264.7巨噬細(xì)胞炎癥損傷被廣泛用作體外抗炎藥物篩選的經(jīng)典模型。在LPS刺激下，小鼠RAW264.7巨噬細(xì)胞可分泌多種炎癥介質(zhì)或促炎因子，如NO、PGE2、TNF-α、IL-6、IL-12、IL-23、IL-1β和COX-2等，這些炎癥介質(zhì)和細(xì)胞因子水平的升高與炎癥性疾病的發(fā)生發(fā)展密切相關(guān)[14-15]。其中，巨噬細(xì)胞中TNF-α和IL-1β分泌的降低有助于體內(nèi)平衡的恢復(fù)，有助于中性粒細(xì)胞在受傷部位的積聚，從而吞噬病原體，并釋放化學(xué)物質(zhì)，改善損傷。此外，炎癥相關(guān)介質(zhì)也是LPS誘導(dǎo)炎癥疾病的重要靶點(diǎn)，這些細(xì)胞因子水平的變化經(jīng)常被用作評價(jià)抗炎藥物活性的重要指標(biāo)。因此，能夠抑制炎癥介質(zhì)和細(xì)胞因子產(chǎn)生或釋放的化合物具有開發(fā)為新型抗炎藥物的潛質(zhì)。研究發(fā)現(xiàn)，腹腔注射CA可減少上述炎癥介質(zhì)和促炎因子的釋放，表現(xiàn)出較好的抗炎作用。

角叉菜膠誘導(dǎo)的炎癥主要癥狀表現(xiàn)為炎癥水腫，痛覺敏化等，其可增強(qiáng)雙相炎癥級聯(lián)反應(yīng)：早期階段包括組胺、白三烯、激肽和環(huán)氧合酶的大量分泌，晚期階段則伴隨著白細(xì)胞的聚集和炎癥組織中前列腺素和緩激肽的過多生成。通常這些炎癥因子可以在受損傷部位自身產(chǎn)生，也可以通過浸潤細(xì)胞產(chǎn)生。炎癥反應(yīng)強(qiáng)弱通常是通過小鼠足水腫程度來評價(jià)的，這一模型在抗炎藥物開發(fā)中發(fā)揮了重要作用。角叉菜膠炎癥模型可通過誘導(dǎo)TNF-α、IL-1β及角質(zhì)形成細(xì)胞源性趨化因子等炎癥相關(guān)的細(xì)胞因子的產(chǎn)生和釋放引起小鼠痛覺過敏，造成炎性損傷[16-17]。在角叉菜膠誘導(dǎo)的小鼠足腫脹模型中，CA可降低角叉菜膠誘導(dǎo)的小鼠足腫脹程度，表明細(xì)胞因子的產(chǎn)生或作用受到干擾可能與松柏醇抗炎機(jī)制密切相關(guān)。醋酸誘導(dǎo)的小鼠扭體實(shí)驗(yàn)?zāi)Ｐ屯ǔＳ糜谠u價(jià)外周鎮(zhèn)痛藥，其主要通過增加內(nèi)源性物質(zhì)如前列腺素，如PGF2α和PGE2，以及緩激肽、組胺和血清素等[18-19]產(chǎn)生痛覺反應(yīng)。這些內(nèi)源性物質(zhì)的大量釋放可造成外周傷害性敏化反應(yīng)產(chǎn)生腹部扭體反應(yīng)，引起進(jìn)一步的傷害性反應(yīng)。本研究發(fā)現(xiàn)CA的鎮(zhèn)痛活性與吲哚美辛相似，而吲哚美辛是一種非甾體抗炎藥，主要通過減少外周組織中前列腺素的生物合成發(fā)揮抗炎鎮(zhèn)痛作用。

綜上所述，松柏醇體外顯著降低NO、TNF-α、IL-1β、IL-6和PGE2的水平，表現(xiàn)出中等程度的在體抗炎鎮(zhèn)痛作用，且呈劑量依賴性。這些結(jié)果充分表明以松柏醇為母核結(jié)構(gòu)進(jìn)一步設(shè)計(jì)或開發(fā)新型抗炎劑具有較好研究價(jià)值。