ClC-3參與碘離子對(duì)小鼠甲狀腺功能調(diào)節(jié)的研究

李小波，鄭衍芳，范 慶

( 1.遵義醫(yī)科大學(xué)珠海校區(qū) 診斷學(xué)教研室，廣東 珠海 519090；2.遵義醫(yī)科大學(xué)珠海校區(qū) 生理教研室，廣東 珠海 519090；3.遵義醫(yī)科大學(xué)珠海校區(qū) 數(shù)理教研室，廣東 珠海 519090)

甲狀腺是人體最大的內(nèi)分泌腺，在機(jī)體生長(zhǎng)發(fā)育和代謝過程中發(fā)揮重要作用。由于生活作息的不規(guī)律以及社會(huì)壓力的增大，甲狀腺功能紊亂的發(fā)病率逐年增加。我國自1996普遍實(shí)施食鹽碘化政策，在積極糾正碘缺乏引起的神經(jīng)系統(tǒng)功能障礙及甲狀腺腫的同時(shí)，甲狀腺疾病的臨床表現(xiàn)也更為多樣，診治難度明顯加大[1-3]。碘離子不但是甲狀腺激素合成過程中不可缺少的原料，也是甲狀腺功能自身調(diào)節(jié)的重要因素。血液中的碘主要通過位于甲狀腺濾泡上皮細(xì)胞的鈉碘轉(zhuǎn)運(yùn)體逆濃度梯度攝取。碘從甲狀腺上皮細(xì)胞頂端膜流入濾泡腔碘化是合成甲狀腺激素的必要過程。研究發(fā)現(xiàn)碘離子的外流是多種陰離子通道和轉(zhuǎn)運(yùn)體共同介導(dǎo)的過程，其中氯離子通道是主要成員[4-5]。

ClC-3氯通道是電壓依賴性氯通道家族(voltage - dependent chloride channel，ClC)中的一員，在機(jī)體中大部分組織、器官都有表達(dá)，與腫瘤、子宮內(nèi)膜異位癥、疼痛等疾病發(fā)生發(fā)展密切相關(guān)[6-8]。ClC-3參與細(xì)胞容積、細(xì)胞周期和凋亡過程調(diào)節(jié)[9-10]。前期研究發(fā)現(xiàn)ClC-3對(duì)碘離子表現(xiàn)出較高通透性，具體為I-> Br-> Cl-> 葡萄糖酸根[11-12]。該結(jié)果提示ClC-3可能參與碘離子轉(zhuǎn)運(yùn)從而影響甲狀腺功能。然而對(duì)于ClC-3與碘離子調(diào)節(jié)甲狀腺功能的相關(guān)研究至今尚缺。本實(shí)驗(yàn)對(duì)WT和ClC-3高表達(dá)FVB小鼠實(shí)施高碘飲水，檢測(cè)ClC-3蛋白表達(dá)變化，比較甲狀腺組織形態(tài)學(xué)以及甲狀腺功能的差異，以探討ClC-3與碘離子調(diào)節(jié)甲狀腺功能的相關(guān)性。

1 材料與方法

1.1 動(dòng)物 小鼠品系為FVB，野生型(wild type， WT)小鼠和ClC-3轉(zhuǎn)基因(ClC-3 transgene，TG)小鼠，均在SPF級(jí)環(huán)境中飼養(yǎng)，室溫為23 ℃，濕度為75%，晝夜交替照明，墊料每日替換。Cyagen Biosciences負(fù)責(zé)ClC-3轉(zhuǎn)基因小鼠的構(gòu)建，項(xiàng)目合格編號(hào)：TGS120401AH01。該動(dòng)物實(shí)驗(yàn)嚴(yán)格遵循國家《實(shí)驗(yàn)動(dòng)物管理?xiàng)l例》和動(dòng)物保護(hù)和使用的相關(guān)法律法規(guī)。

1.2 主要試劑 兔抗小鼠 ClC-3單克隆抗體購自香港Abcam；美國Bio-Swamp提供小鼠三碘甲狀腺原氨酸(Free triodothyronine，F(xiàn)T3) 、小鼠甲狀腺素( Free thyroxine，F(xiàn)T4) 和小鼠促甲狀腺素(Thyrotropin，TSH) ELISA 試劑盒。高碘飲用水的配制：避光稱量150 mg NaI(白云山制藥有限公司)，溶于10 mL培養(yǎng)基中，過濾分裝，每管分裝500 μL，成為15 mg/mL的母液，放-20 ℃保存。取60 μL的NaI母液加入200 mL的無菌飲用水中，配置成4.5 mg/L的小鼠高碘飲用水[13]。

1.3 動(dòng)物分組和處理 選取3個(gè)月齡的WT小鼠和ClC-3轉(zhuǎn)基因小鼠各16只，雌雄各半。將WT小鼠隨機(jī)均分為兩組，對(duì)照組(WT)和高碘組(WT+NaI)，其中高碘組小鼠每周飲用200 mL高碘水，持續(xù)1個(gè)月。對(duì)照組小鼠飲用蒸餾水。ClC-3轉(zhuǎn)基因小鼠分為轉(zhuǎn)基因組(TG)和轉(zhuǎn)基因+高碘組(TG+ NaI)，轉(zhuǎn)基因組飲用蒸餾水，轉(zhuǎn)基因+高碘組每周飲用200 mL高碘水。

1.4 小鼠標(biāo)本的收集

1.4.1 采血方法 將小鼠麻醉后，眼球靜脈取血法采血。靜置采血管5 min，在3 000 r/min，4 ℃的條件下離心10 min，小心吸取上層血清送檢。

1.4.2 甲狀腺組織獲得 將取血后的小鼠仰臥固定，在體式顯微鏡下逐層切開皮膚和筋膜。暴露氣管后，剝離氣管周圍肌肉和后背側(cè)食管，尋找甲狀腺組織。用眼科彎鑷或直鑷取下兩側(cè)甲狀腺，如有腫大，峽部也一并取下。

1.5 HE染色觀察甲狀腺形態(tài) 將小鼠甲狀腺組織依次進(jìn)行脫水、包埋、切片、脫蠟、蘇木素染核、伊紅染細(xì)胞質(zhì)。用不同濃度的酒精和二甲苯進(jìn)行脫水，并用中性樹脂封片，最后在顯微鏡下觀察甲狀腺組織形態(tài)結(jié)構(gòu)變化。

1.6 免疫組化測(cè)定甲狀腺ClC-3蛋白表達(dá) 將甲狀腺組織進(jìn)行石蠟切片脫水、抗原修復(fù)、阻斷內(nèi)源性過氧化物酶、血清封閉、滴加一抗(1∶100)、二抗、DAB顯色、用蘇木素復(fù)染細(xì)胞核、最后脫水封片并在顯微鏡下觀察和拍照分析。

1.7 Western blotting測(cè)定甲狀腺ClC-3蛋白表達(dá) 將甲狀腺組織均質(zhì)后加入裂解液，提取總蛋白。采用BCA 蛋白含量檢測(cè)試劑盒定量，并繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線。蛋白上樣，通過10% SDS-PAGE分離20 μg蛋白，轉(zhuǎn)膜，加入5 mL奶粉封閉液2 h后，加入ClC-3一抗(1∶800)、GAPDH(1∶1 000)孵育過夜。加入山羊抗兔IgG(1∶5 000)孵育2 h，滴加等體積配置的ECL-A 、ECL-B 混合液，靜置2～3 min后放入凝膠成像系統(tǒng)成像。最后用Image-Pro Plus 軟件系統(tǒng)分析成像條帶并進(jìn)行灰度分析。

1.8 ELISA檢測(cè)激素FT3、FT4、TSH 在實(shí)驗(yàn)孔中加入40 μL血清并與單克隆抗體10 μL輕輕混勻；空白孔加入對(duì)照溶液。嚴(yán)格按照Bioswamp說明書進(jìn)行操作，在450 nm波長(zhǎng)下測(cè)定每孔的吸光值。樣本濃度為所測(cè)吸光度值與標(biāo)準(zhǔn)曲線對(duì)比得知。

2 結(jié)果

2.1 ClC-3轉(zhuǎn)基因小鼠和WT小鼠甲狀腺組織ClC-3蛋白表達(dá)的差異 為直觀反映WT小鼠和ClC-3轉(zhuǎn)基因小鼠甲狀腺組織的ClC-3蛋白表達(dá)情況，本實(shí)驗(yàn)采用免疫組化和Western blotting進(jìn)行蛋白表達(dá)的測(cè)定。從圖1可見棕色區(qū)域?yàn)镃lC-3蛋白分布部位，顏色越深表示蛋白含量越高?？梢奀lC-3蛋白主要分布于甲狀腺細(xì)胞質(zhì)中。Western blotting用灰度值表示ClC-3蛋白的相對(duì)表達(dá)量， ClC-3轉(zhuǎn)基因小鼠的ClC-3蛋白表達(dá)量明顯高于WT小鼠(P<0.05，見圖2)。

2.2 高碘飲水后WT小鼠和ClC-3轉(zhuǎn)基因小鼠ClC-3蛋白表達(dá)增加 WT小鼠和ClC-3轉(zhuǎn)基因小鼠高碘飲水干預(yù)后，小鼠甲狀腺ClC-3蛋白表達(dá)量均增加。免疫組化結(jié)果顯示高碘飲水的WT小鼠和ClC-3轉(zhuǎn)基因小鼠比未干預(yù)的小鼠染色更深(見圖1)。Western blotting測(cè)定ClC-3蛋白進(jìn)行灰度分析后發(fā)現(xiàn)，高碘飲水干預(yù)后WT和ClC-3轉(zhuǎn)基因小鼠ClC-3蛋白表達(dá)量均增加，且有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05，見圖2B)。

*：與WT相比，P<0.05；#：與TG相比，P<0.05。圖2 Western blotting檢測(cè)WT和ClC-3轉(zhuǎn)基因小鼠高碘飲水后ClC-3蛋白表達(dá)

圖1 免疫組化檢測(cè)WT和ClC-3轉(zhuǎn)基因小鼠高碘飲水后ClC-3蛋白表達(dá)

2.3 高碘飲水后ClC-3轉(zhuǎn)基因小鼠和WT小鼠甲狀腺組織學(xué)形態(tài)學(xué)差異 HE染色觀察小鼠甲狀腺組織，與WT小鼠相比，ClC-3轉(zhuǎn)基因小鼠的甲狀腺上皮細(xì)胞增生，濾泡腔擴(kuò)大和數(shù)目增多。高碘飲水后，WT小鼠和ClC-3轉(zhuǎn)基因小鼠甲狀腺組織對(duì)高碘飲水的形態(tài)學(xué)變化基本相同，表現(xiàn)為甲狀腺上皮細(xì)胞腫大、增生明顯、濾泡腔數(shù)目增多且體積差異較大，甲狀腺濾泡腔平均體積增加(見圖3)。

圖3 WT和ClC-3轉(zhuǎn)基因小鼠高碘飲水后甲狀腺形態(tài)學(xué)差異

2.4 ClC-3轉(zhuǎn)基因小鼠T3、T4水平增高 ELISA化學(xué)發(fā)光法測(cè)定小鼠血清中T3、T4含量后發(fā)現(xiàn)，與WT小鼠相比，ClC-3轉(zhuǎn)基因小鼠血清中的T3和T4含量增高，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義；ClC-3轉(zhuǎn)基因小鼠血清中的TSH含量與WT小鼠相比無明顯差異，但仍呈現(xiàn)下降趨勢(shì)(見圖4A、B)。

2.5 高碘飲水后WT小鼠和ClC-3轉(zhuǎn)基因小鼠T3、T4和TSH的改變 WT小鼠和ClC-3轉(zhuǎn)基因小鼠高碘飲水持續(xù)一個(gè)月后，測(cè)定血清T3、T4、TSH水平。結(jié)果發(fā)現(xiàn)與未干預(yù)WT小鼠相比，WT小鼠高碘飲水后T3和T4水平變化相同，均表現(xiàn)為明顯增高，TSH降低(P<0.05)；ClC-3轉(zhuǎn)基因小鼠高碘飲水后，與未干預(yù)的轉(zhuǎn)基因小鼠相比T3、T4也明顯增高(P<0.05)，但TSH無明顯變化(見圖4C)。

*：與WT相比，P<0.05；#：與TG相比，P<0.05；ns：與TG相比，差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。圖4 高碘飲水對(duì)WT小鼠和ClC-3轉(zhuǎn)基因小鼠激素水平的影響

3 討論

氯離子通道是人體最主要的陰離子通道。氯離子通道根據(jù)其激活特性可分為：電壓依賴性氯通道家族、鈣激活氯通道、環(huán)核苷酸激活氯通道等。過量碘抑制甲狀腺激素的合成效應(yīng)稱為碘阻值效應(yīng)。在頂端膜上對(duì)碘離子的外排過程有多種離子通道介導(dǎo)，至今發(fā)現(xiàn)的明確相關(guān)的有Pendrin[14]，Ano1[15]，和ClC-5[16]。

前期實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)在甲狀腺細(xì)胞中，有豐富的ClC-3蛋白表達(dá)。甲狀腺細(xì)胞ClC-3通道激活時(shí)，該通道對(duì)碘離子的通透性明顯大于氯離子[17]，提示ClC-3通道可能參與碘離子的轉(zhuǎn)運(yùn)從而影響甲狀腺形態(tài)與功能。本實(shí)驗(yàn)選用WT和ClC-3轉(zhuǎn)基因小鼠作為實(shí)驗(yàn)對(duì)象。研究發(fā)現(xiàn)ClC-3轉(zhuǎn)基因小鼠的甲狀腺結(jié)構(gòu)和激素水平與臨床上典型的甲亢表現(xiàn)有相同的表現(xiàn)，均為甲狀腺細(xì)胞明顯增生，伴有濾泡腔擴(kuò)大；T3、T4分泌量增多伴有TSH下降。這提示ClC-3通道的過表達(dá)可能與甲亢的發(fā)病機(jī)制相關(guān)，同時(shí)表明ClC-3轉(zhuǎn)基因小鼠可以作為從離子通道角度研究甲亢疾病的動(dòng)物模型。

碘是甲狀腺激素合成過程中必不可少的原料，同時(shí)也能根據(jù)血碘水平調(diào)節(jié)甲狀腺功能。血碘濃度開始升高時(shí)(1 mmol/L)，甲狀腺細(xì)胞可誘導(dǎo)碘的活化和甲狀腺激素的合成；但當(dāng)血碘高于10 mmol/L，甲狀腺激素的合成過程反而受抑制，甲狀腺激素合成減少。本實(shí)驗(yàn)選用濃度為4.5 mg/L的高碘飲用水，飼養(yǎng)WT和ClC-3轉(zhuǎn)基因小鼠1個(gè)月后檢測(cè)ClC-3蛋白表達(dá)與甲狀腺結(jié)構(gòu)和功能。結(jié)果發(fā)現(xiàn)，高碘飲水后WT小鼠ClC-3蛋白表達(dá)均明顯增加；甲狀腺細(xì)胞增生，濾泡腔體積增大； T3、T4水平均顯著升高，伴有TSH水平下降。該結(jié)果提示，4.5 mg/L的高碘飲水促使甲狀腺結(jié)構(gòu)呈現(xiàn)過度增生的狀態(tài)，同時(shí)伴有甲狀腺功能亢進(jìn)的激素表現(xiàn)，該過程可能與ClC-3的表達(dá)相關(guān)。高碘飲水對(duì)ClC-3轉(zhuǎn)基因小鼠甲狀腺結(jié)構(gòu)和功能的改變與WT相似，均為甲狀腺細(xì)胞明顯增生且濾泡腔增大，T3、T4增高，同時(shí)伴有ClC-3蛋白表達(dá)量的增加。

高碘飲水后，WT小鼠TSH水平下降，ClC-3轉(zhuǎn)基因小鼠TSH水平未發(fā)現(xiàn)明顯變化?？赡苡捎谕鈦硪蛩刈饔糜跈C(jī)體使FT3、FT4水平升高時(shí)，下丘腦-垂體-甲狀腺軸通過負(fù)反饋?zhàn)饔?，減少TSH分泌，以維持甲狀腺功能的穩(wěn)定。因而WT小鼠高碘飲水后，T3、T4升高會(huì)伴有TSH顯著下降。與WT小鼠的比較，ClC-3轉(zhuǎn)基因小鼠有甲亢的傾向性，因而可能對(duì)甲狀腺功能穩(wěn)態(tài)的調(diào)節(jié)作用減退。所以高碘飲水后FT3、FT4水平升高的情況下，TSH未發(fā)生顯著變化，未體現(xiàn)出明顯的負(fù)反饋調(diào)節(jié)作用。

綜上所述，高碘飲水對(duì)小鼠甲狀腺結(jié)構(gòu)和功能的調(diào)節(jié)過程與ClC-3的表達(dá)相關(guān)。ClC-3氯通道為研究甲狀腺功能穩(wěn)態(tài)的研究提供新的視角，可能是甲狀腺功能相關(guān)疾病的潛在治療靶點(diǎn)。