大鼠系膜增生性腎小球腎炎外周血Th17、Treg及炎癥因子演變特征

梁大飛，鄒旺輝，楊伊春，許其靜，宋公宇，章 濤，張 潛

(1.遵義醫(yī)科大學(xué) 基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)院人體解剖學(xué)教研室，貴州 遵義 563099；2：遵義醫(yī)科大學(xué)附屬醫(yī)院 貴州省細(xì)胞工程重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，貴州 遵義 563099)

系膜增生性腎小球腎炎(Mesangial proliferation glomerulonephritis,MsPGN)是我國原發(fā)性腎小球腎炎中常見的病理類型，不同地理區(qū)域的分布不盡相同，在西部地區(qū)發(fā)病率占比高達(dá)26.8%，而全國兒童當(dāng)中的發(fā)病率占比也達(dá)19.1%[1-2]。MsPGN的基本病理特征是腎小球系膜細(xì)胞增生及系膜基質(zhì)增多[3]，目前MsPGN的發(fā)病機(jī)制仍未完全闡明，已形成的共識是該病系一種免疫介導(dǎo)的炎癥性疾病，故異常炎癥反應(yīng)所導(dǎo)致的炎癥因子過度表達(dá)被認(rèn)為是MsPGN的重要病理生理致病原因[4]。

在炎癥、自身免疫性疾病中CD4+T細(xì)胞是關(guān)鍵的驅(qū)動因素[5]，輔助性T細(xì)胞17(T helper 17 cells，Th17)和調(diào)節(jié)性T細(xì)胞(Regulatory T cells，Treg)是主要的兩個效應(yīng)細(xì)胞亞群。初始T細(xì)胞在轉(zhuǎn)化生長因子-β(Transforming growth factor-β,TGF-β)、IL-6協(xié)同作用下，通過STAT3途徑誘導(dǎo)維甲酸相關(guān)孤核受體轉(zhuǎn)錄因子信號，從而促進(jìn)其向Th17細(xì)胞分化[6]，并主要分泌IL-17A。已有研究顯示，Th17可能在腎小球腎炎的發(fā)生發(fā)展過程中發(fā)揮重要作用[7]。Treg是初始的T細(xì)胞在TGF-β誘導(dǎo)下經(jīng)由叉頭翼狀螺旋核轉(zhuǎn)錄因子3 (Forhead box P3 transcription factor,Foxp3 )途徑產(chǎn)生，可分泌IL-10、TGF-β抗炎因子，為CD4/CD25/Foxp3三陽性細(xì)胞[8]，其在腎小球基底膜性腎炎、新月體腎炎的抗炎作用上已得到研究證實(shí)[9-10]。然而，Th17與Treg是否參與了MsPGN的發(fā)生發(fā)展以及疾病的轉(zhuǎn)歸，是否和炎癥因子演變相關(guān)聯(lián)還未見報道。故本文采用抗Thy1.1制備大鼠(MsPGN)模型，通過分析大鼠外周血Th17、Treg與炎癥因子變化趨勢，結(jié)合腎臟組織病理學(xué)和免疫組化特點(diǎn)、腎功能改變等檢測，幫助揭示MsPGN的炎癥免疫相關(guān)發(fā)病機(jī)制，為該病的治療提供新的思路和理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)動物 清潔級6～8周雄性SD大鼠36只，體重(180～200)g，購于遵義醫(yī)科大學(xué)實(shí)驗(yàn)動物中心并飼養(yǎng)于該中心普通實(shí)驗(yàn)區(qū)[實(shí)驗(yàn)動物使用許可證號：SYXK(黔)2021-0004]。本研究涉及的實(shí)驗(yàn)動物及其相關(guān)操作經(jīng)遵義醫(yī)科大學(xué)實(shí)驗(yàn)動物倫理委員會審議批準(zhǔn)。

1.2 主要試劑與儀器 Anti-Rat CD90 (Thy1.1) Monoclonal Antibody (CL005A,Cedarlane,Canada)；流式細(xì)胞術(shù)檢測用抗體Anti-Rat FITC-CD4 (E10268-1633,Biolegend,USA)，Anti-Rat PE-IL-17A (1995433,eBioscience,USA)、Anti-Rat PE-CD25 (B253594,eBioscience,USA)和Anti-Rat APC-FoxP3(4291991,eBioscience,USA)；True NuclearTM10× Perm(B323378,Biolegend,USA)、True NuclearTM4× Tix (B324201,Biolegend,USA)、 True NuclearTMFix Diluent (B323378,Biolegend,USA)；Rat IL-17A (70-EK317/3-96,MultiSciences,China)、Rat IL-6 ELISA Kit (70-EK306/3-96,MultiSciences,China)、Rat IL-10 ELISA Kit (70-EK310/2-96,MultiSciences,China)、Human/Mouse/Rat TGF-β1 (70-EK981-96,MultiSciences,China)；免疫組化抗體IL-17A (BS90701,Biogot technology,China)；Foxp3(bs-0269R,Bioss,China)；大鼠淋巴細(xì)胞分離液 (LTS1083-200,天津?yàn)笊镏破酚邢薰?中國)。流式細(xì)胞儀(GALLIOS,Beckmancoulter,USA)；酶標(biāo)儀(MK3,Thermo Multiskan,USA)；全自動血生化儀(AU680,Beckmancoulter,USA)。

1.3 實(shí)驗(yàn)方法

1.3.1 動物模型制備 參考文獻(xiàn)報道的方法[11]制備MsPGN模型，扼要步驟為：Anti-Rat CD90 (Thy1.1)單克隆抗體凍干品一支(1.55 mg)，用300 μL PBS稀釋，按25 μL/100 g劑量(1.29 mg/kg)單次尾靜脈注射誘導(dǎo)MsPGN模型。

1.3.2 大鼠腎臟組織切片 HE和PAS染色 以注射抗Thy1.1抗體之日作為0 d，分別于3、7和14 d 在正常組和MsPGN組隨機(jī)選取6只大鼠，予2%戊巴比妥鈉(20 mg/kg)腹腔麻醉后采集外周血，并隨即分離雙側(cè)腎臟，切取1/4大小腎臟組織，置于 4%多聚甲醛溶液固定48 h；腎臟組織經(jīng)脫水后再行石蠟包埋、切片(厚度為4 μm)，部分切片分別進(jìn)行HE和PAS染色，中性樹脂封片，置光鏡下觀察腎皮質(zhì)部分的腎小球系膜區(qū)。部分切片用于免疫組化染色。

1.3.3 大鼠腎臟組織切片 IL-17A、Foxp3免疫組化染色 取上述石蠟包埋組織切片進(jìn)行IL-17A、Foxp3表達(dá)的免疫組化染色分析，步驟為：組織切片經(jīng)二甲苯脫蠟2次，梯度乙醇水化；3%甲醇雙氧水清除內(nèi)源性過氧化物酶作用，高壓抗原修復(fù)2 min；山羊血清室溫封閉20 min，IL-17A(1∶100)、Foxp3(1∶100)一抗4 ℃孵育過夜；PBS浸洗3次，37 ℃下HRP標(biāo)記的二抗孵育20 min，DAB顯色，蘇木素復(fù)染1 min，乙醇梯度脫水，二甲苯透明、中性樹脂封片，置光學(xué)顯微鏡觀察腎皮質(zhì)部分的腎小球系膜區(qū)。利用Image-ProPlus軟件測定正常組及MsPGN組不同時間點(diǎn)的積分光密度值。

1.3.4 腎功能檢測 采用代謝籠收集正常組和MsPGN大鼠3、7和14 d的24 h尿液，采集大鼠外周血標(biāo)本，均經(jīng)600×g離心10 min后用全自動生化分析儀行24 h尿蛋白定量、血肌酐與尿素檢測。

1.3.5 外周血 Th17、Treg的流式細(xì)胞術(shù)檢測 采用密度梯度離心法(Ficoll)分離大鼠外周血單個核細(xì)胞(PB-MNC)，紅細(xì)胞裂解液裂解紅細(xì)胞后獲得純化后的PB-MNC。取200 μL PBS重懸細(xì)胞并計數(shù)(細(xì)胞總數(shù)約8×105～5×106)，分別取100 μL于兩個流式管中，一管予0.5 μL FITC-CD4室溫避光孵育20 min，細(xì)胞固定、破膜后予1.25 μL PE-IL-17A 37℃下避光孵育30 min，PBS洗1次，250× g離心10 min，350 μL PBS重懸浮細(xì)胞后上機(jī)檢測；另一管予0.5 μL FITC-CD4，3 μL PE-CD25室溫避光孵育20 min，細(xì)胞固定、破膜后予4 μL APC-foxp337℃下避光孵育20 min，同上洗滌重懸細(xì)胞，上機(jī)檢測。

1.3.6 外周血 IL-17A、IL-6、IL-10、TGF-β1的ELISA檢測 大鼠外周血樣品室溫下靜置0.5 h，600×g離心10 min，取上清，按照ELISA試劑盒說明書要求對3個時間點(diǎn)的各組樣品中的IL-17A、IL-6、IL-10、TGF-β1蛋白進(jìn)行標(biāo)記，酶標(biāo)儀檢測450 nm波長下的樣品OD值，Origin軟件繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線，計算檢測樣品的IL-17A、IL-6、IL-10、TGF-β1含量。

2 結(jié)果

2.1 MsPGN大鼠腎組織病理特征 與正常組比較，MsPGN大鼠腎小球系膜區(qū)在3個時間點(diǎn)均出現(xiàn)了系膜細(xì)胞增生、系膜基質(zhì)增多，其中7 d系膜細(xì)胞增生達(dá)高峰，14 d開始減少(見圖1)。

圖1 MsPGN大鼠不同時間點(diǎn)腎小球系膜區(qū)病理形態(tài)特點(diǎn)(HE、PAS,×400)

2.2 腎臟組織IL-17A、Foxp3免疫組化檢測 免疫組化結(jié)果顯示，IL-17A、Foxp3在腎小球細(xì)胞胞漿和腎小管上皮細(xì)胞胞漿均呈棕黃色，與正常組比較，MsPGN大鼠IL-17A在 3 d達(dá)峰(P<0.05)，F(xiàn)oxp3在3 d較正常組降低后升高，7 d達(dá)峰(P<0.05，見圖2)。

A:腎組織IL-17A和Foxp3免疫組化染色圖(×400)；B:IL-17A、Foxp3免疫組化檢測積分光密度值；*：與正常組比較，P<0.05。圖2 MsPGN大鼠不同時間點(diǎn)IL-17A、Foxp3表達(dá)的免疫組化檢測結(jié)果

2.3 24 h尿蛋白定量、血尿素與肌酐 與正常組相比較，MsPGN大鼠24 h尿蛋白定量和血尿素在3個時間點(diǎn)表達(dá)量均升高，在3 d時達(dá)高峰，然后呈逐漸降低(P<0.05)；血肌酐在3個時間點(diǎn)表達(dá)量與正常組比較差異無統(tǒng)計學(xué)意義(P>0.05，見圖3)。

*：P<0.05；ns：無統(tǒng)計學(xué)意義。圖3 MsPGN大鼠不同時間點(diǎn)24 h尿蛋白(A)、血尿素(B)和肌酐(C)表達(dá)情況

2.4 外周血Th17、Treg細(xì)胞的流式細(xì)胞術(shù)檢測 MsPGN大鼠在3個時間點(diǎn)Th17(CD4+IL-17A細(xì)胞)表達(dá)量均較正常組高(P<0.05)，3 d的Th17數(shù)量升高達(dá)峰，之后逐次降低(P<0.05)；而Treg細(xì)胞(CD4+CD25+Foxp3+)在第3天降低后轉(zhuǎn)而又逐漸增高(P<0.05)，但各時間點(diǎn)均低于正常組水平(P<0.05，見圖4)。

A:CD4+IL-17A細(xì)胞(Th17)數(shù)量變化；B:CD4+CD25+Foxp3+細(xì)胞(Treg)數(shù)量變化；C:以CD4設(shè)門，獲取CD4+CD25+Foxp3+細(xì)胞的步驟說明；步驟1：根據(jù)前向角FSC和側(cè)向角SSC參數(shù)在PBMC中圈定淋巴細(xì)胞門(紅色部分)；步驟2：CD4設(shè)門，圈定CD4+CD25+淋巴細(xì)胞(藍(lán)色部分)；步驟3： CD25+Foxp3+淋巴細(xì)胞即Treg(CD4+ CD25+Foxp3+)細(xì)胞；D:Th17數(shù)量的表達(dá)差異；*：P<0.05；E:Treg數(shù)量的表達(dá)差異，*：P<0.05。圖4 MsPGN大鼠不同時間點(diǎn)外周血Th17、Treg數(shù)量的流式細(xì)胞術(shù)檢測結(jié)果

2.5 外周血IL-6、IL-17A、IL-10、TGF-β1含量的ELISA檢測 MsPGN大鼠炎癥因子IL-6、IL-17A、IL-10、TGF-β1在3個時間點(diǎn)的表達(dá)量均較正常組升高(P<0.05)，其中IL-17A在3 d升高達(dá)峰后逐次降低(P<0.05)，IL-6在7 d達(dá)高峰后依次降低(P<0.05)；IL-10、TGF-β1則呈逐次升高趨勢(P<0.05)，其中3 d時的IL-10表達(dá)量與正常組比較差異無統(tǒng)計學(xué)意義(P>0.05，見圖5)。

*：P<0.05；ns：無統(tǒng)計學(xué)意義。圖5 MsPGN大鼠外周血IL-17A、IL-6、IL-10和TGF-β1含量的ELISA檢測結(jié)果

3 討論

MsPGN在腎小球疾病中發(fā)病率較高，且男性多于女性，臨床上以無癥狀性蛋白尿及血尿?yàn)橹饕攸c(diǎn)，可進(jìn)展為腎小球硬化，腎間質(zhì)纖維化及終末期腎臟疾病[11]，是我國引起慢性腎臟病、尿毒癥的常見原因。由于并非所有慢性腎炎患者均接受過腎組織活檢采樣分析，使得無法獲得準(zhǔn)確的疾病占比。目前對于MsPGN的成因和發(fā)病機(jī)制等的認(rèn)識還極為有限，對其發(fā)病機(jī)制的深入研究將有助于提高對該病的認(rèn)識，并為探尋新的有效治療手段提供理論和實(shí)驗(yàn)依據(jù)，意義不言而喻。

制備符合臨床疾病病理生理發(fā)病過程的疾病動物模型對于研究某一疾病的發(fā)病機(jī)制以及新的干預(yù)措施評價具有至關(guān)重要的作用。目前，MsPGN模型制備常采用抗Thy1抗體誘導(dǎo)方法進(jìn)行，且較為可行有效[4,12]。本實(shí)驗(yàn)選擇了單次尾靜脈注射Anti-Rat CD90 (Thy1.1)單克隆抗體制備大鼠MsPGN模型，于注射抗Thy1.1抗體3、7和14 d發(fā)現(xiàn)模型組腎臟組織中腎小球系膜細(xì)胞增生及細(xì)胞外基質(zhì)增多的病理學(xué)形態(tài)改變，且各時間點(diǎn)的24 h尿蛋白定量較正常組均明顯升高，且與血尿素水平均呈現(xiàn)出先升高再逐漸降低的趨勢，說明MsPGN大鼠造模成功。

既往研究表明，CD4+T細(xì)胞是自身免疫性疾病的關(guān)鍵驅(qū)動因子，CD4+T細(xì)胞被激活后可分化為不同的效應(yīng)亞群，通過亞群特異性細(xì)胞因子的分泌在介導(dǎo)免疫應(yīng)答中發(fā)揮重要作用，主要由Th1、Th2、Th17及Treg 4個亞群構(gòu)成，有研究表明對Th1/Th2平衡進(jìn)行調(diào)節(jié)有助于MsPGN的治療[13]。Th17具有促進(jìn)炎癥和免疫反應(yīng)的作用，Treg可抑制過度炎癥免疫反應(yīng)。已有研究報道，Th17與Treg比值失衡在腎病綜合征[14]、IgA腎病[15]等自身免疫性腎臟疾病中發(fā)揮關(guān)鍵作用，但Th17和Treg在MsPGN發(fā)生發(fā)展中的變化情況及意義還未見報道。

本實(shí)驗(yàn)研究了MsPGN大鼠在模型外周血及腎臟組織IL-17A表達(dá)水平，結(jié)果顯示大鼠外周血中CD4+IL-17A細(xì)胞(Th17)在第3天明顯升高后逐漸降低；炎癥因子IL-17A在第3天升高達(dá)高峰后逐漸降低；腎臟組織IL-17A免疫組化結(jié)果顯示在第3天表達(dá)量增多達(dá)高峰后逐漸降低；24 h蛋白尿定量同樣在3個時間點(diǎn)均升高，第3天達(dá)高峰后逐漸降低，顯示血清IL-17A水平的變化模式與24 h蛋白尿的變化情況同步，這與既往文獻(xiàn)報道中發(fā)現(xiàn)腎小球腎炎患者血清IL-17A與24 h蛋白尿的嚴(yán)重程度呈正相關(guān)的結(jié)果一致[16]。IL-6是促炎細(xì)胞因子，本實(shí)驗(yàn)表明外周血炎癥因子IL-6的表達(dá)量在3個時間點(diǎn)均較正常組升高，提示IL-6可能與MsPGN發(fā)病有關(guān)，同時在第7 d達(dá)高峰，我們的研究結(jié)果還表明此時系膜細(xì)胞增殖也最為顯著。對外周血CD4+CD25+Foxp3+細(xì)胞(Treg)含量及免疫組化Foxp3表達(dá)量檢測結(jié)果表明，Treg在第3 d降低后逐漸升高，外周血炎癥因子IL-10在7 d呈逐漸升高趨勢且與Treg細(xì)胞降低后增多時間相一致。TGF-β1是TGF-β家族成員之一，既往有研究報道TGF-β1在原發(fā)腎病綜合征患兒外周血中含量降低[14]，而IgA腎病中既有升高的報道，也有報道降低的情況出現(xiàn)[15]。而本研究中，MsPGN大鼠外周血TGF-β1的含量各觀察時間點(diǎn)呈逐步升高趨勢，這可能與不同的研究采用的對象不完全一致以及TGF-β1不完全來自Treg單一細(xì)胞分泌有關(guān)。

鑒于目前臨床上MsPGN的治療仍以糖皮質(zhì)激素沖擊或者聯(lián)合免疫抑制劑為主要策略，但藥物毒副作用大，因此亟待探尋新的MsPGN有效治療或治愈方案。本研究結(jié)果提示通過調(diào)節(jié)Th17與Treg細(xì)胞的平衡有望成為探索MsPGN治療的新策略。結(jié)合本課題組以往對外周血間充質(zhì)干細(xì)胞(Peripheral blood-derived mesenchymal stem cells,PB-MSC)的免疫調(diào)節(jié)能力的研究提示，在體外PB-MSC與T細(xì)胞共培養(yǎng)的過程中PB-MSC具有調(diào)節(jié)Th17/Treg平衡的能力[17]，且在脊髓損傷模型中，PB-MSC移植到損傷部位后體內(nèi)Th17細(xì)胞數(shù)量減少，Treg細(xì)胞數(shù)量增加[18]，因此，在MsPGN模型中PB-MSC移植是否可通過調(diào)節(jié)Th17/Treg平衡而發(fā)揮有益治療作用，這一問題值得通過進(jìn)一步實(shí)驗(yàn)進(jìn)行驗(yàn)證評價，這對探尋MsPGN治療的新有效措施至關(guān)重要，具有重要的理論意義和臨床轉(zhuǎn)化應(yīng)用價值。