Cd、Pb復合脅迫對狼尾草種子萌發(fā)及幼苗生長的影響

國偉強，杜 雪，彭玉蘭，李源恒，趙春莉，曲同寶

(吉林農(nóng)業(yè)大學園藝學院，長春 130118)

由于大氣沉降、采礦冶煉以及污水灌溉等影響，對土壤生態(tài)環(huán)境和人類健康構成嚴重威脅[1-3]。調查結果顯示，2014年中國土壤重金屬總超標率高達16.1%，其中鎘(Cd)、鋁(Pb)分別占7.0%和1.5%，已成為我國城市地表土壤中含量超標最多的兩種重金屬[4]。Cd、Pb生態(tài)毒性較大易形成復合污染，對生態(tài)環(huán)境造成不可估量的傷害[5-6]。因此，如何高效、經(jīng)濟地治理土壤Cd、Pb污染，已成為急需解決的環(huán)境問題。

應用植物修復重金屬污染的土壤是一種行之有效的方法，具有經(jīng)濟成本低、操作簡單易行等優(yōu)點，可通過植物提取、固定和降解等方式減少土壤中的有毒有害物質[7-8]。我國擁有豐富的禾草資源，大量試驗研究表明，禾本科植物適應性強，根莖發(fā)達，生長快速，地下須根相互延伸交錯，更有利于吸收土壤中的重金屬[9-10]。目前研究方向多集中于重金屬脅迫對結縷草(Zoysiajaponica)、黑麥草(Loliumperenne)、早熟禾(Poaannua)等草坪草的影響[10-11]，而其他園林常用禾草資源在耐重金屬脅迫方面有待進一步開發(fā)利用。

狼尾草(Pennisetumalopecuroides)是禾本科(Poaceae)狼尾草屬(Pennisetum)多年生草本植物，具有生長迅速、生物量大、根系發(fā)達、抗逆性強、管理粗放等優(yōu)點，被稱為“能源草”，得到廣泛應用[13-14]。目前，對狼尾草的研究主要集中在耐鹽抗旱性、水土保持、園林應用等方面[15-17]，而有關重金屬對狼尾草的影響研究相對較少，僅限于狼尾草與其他植物對重金屬耐性的比較[13,18-19]，而Cd、Pb脅迫對狼尾草種子萌發(fā)及幼苗生長等方面的研究未見報道。因此，本研究以狼尾草為材料，設置不同濃度Cd、Pb單一脅迫及復合脅迫試驗，探討Cd、Pb脅迫對狼尾草種子萌發(fā)及幼苗生長的影響，以期為廢棄尾礦和垃圾填埋場等Cd、Pb污染地區(qū)選擇耐性植物材料應用提供參考。

1 材料與方法

1.1 材 料

狼尾草種子購買于花卉市場，千粒重為4.19 g。重金屬Cd、Pb分別以CdCl2和Pb(CH3COO)2水溶液的形式添加。

1.2 方 法

試驗在吉林農(nóng)業(yè)大學園藝學院實驗室進行，依據(jù)國家土壤環(huán)境質量標準(GB 36600—2018)并結合預試驗所得結果設置Cd、Pb處理濃度，其中Cd濃度設置為A1=0,A2=20 mg·L-1,A3=40 mg·L-1,A4=80 mg·L-1;Pb濃度設置為B1=0,B2=250 mg·L-1,B3=500 mg·L-1,B4=1 000 mg·L-1(表1)。

表1 Cd和Pb復合處理組合設計Table 1 Combination design of composite treatment with Cd and Pb

將狼尾草種子用濃度為1%的次氯酸鈉(NaClO)溶液浸泡消毒10 min，用去離子水反復沖洗，除去漂浮的劣質種子后用濾紙吸干種子表面水分備用。將經(jīng)高壓滅菌后的玻璃培養(yǎng)皿(直徑9 cm)放置兩層定性濾紙作為狼尾草種子的發(fā)芽床，每床整齊放入50粒種子，每個處理3次重復。每個培養(yǎng)皿用移液槍緩慢加入5 mL不同濃度的重金屬溶液，并以蒸餾水為對照處理。將培養(yǎng)皿置于智能型人工氣候培養(yǎng)箱，設置培養(yǎng)參數(shù)為25±1 ℃、濕度70%、光照強度3 500 lx，光照14 h/黑暗10 h。為保持濾紙濕潤，每天采用稱重法補水。

1.3 測定指標及方法

1.3.1發(fā)芽指標測定

發(fā)芽指標測定參照QU等[20]的方法，每天同一時間觀察并記錄種子發(fā)芽情況，以胚根露白后突破種皮2 mm為種子萌發(fā)標志，參試種子連續(xù)3 d不發(fā)芽視為發(fā)芽結束。

1.3.2形態(tài)學指標測定

狼尾草種子發(fā)芽結束后，從培養(yǎng)皿中隨機取出10株狼尾草幼苗測定根長、芽長。

1.3.3生理指標測定

發(fā)芽試驗結束后參照張治安等[21]的方法測定相關生理指標，可溶性蛋白含量采用考馬斯亮藍G-250染色法；丙二醛(MDA)含量采用硫代巴比妥酸法；超氧化物歧化酶(SOD)活性采用NBT光還原法；過氧化物酶(POD)活性采用愈創(chuàng)木酚法。

1.4 數(shù)據(jù)處理

試驗數(shù)據(jù)用Excel 2010軟件和SPSS 19.0軟件進行統(tǒng)計分析，顯著性水平為p<0.05。采用Origin 2018軟件制圖。

2 結果與分析

2.1 Cd、Pb脅迫對狼尾草種子萌發(fā)的影響

由圖1可知，Cd單一脅迫濃度為20 mg·L-1時，可輕微促進狼尾草種子的萌發(fā)，而當Cd脅迫濃度為80 mg·L-1時，狼尾草種子的發(fā)芽率和發(fā)芽指數(shù)與對照相比分別顯著降低13.08%和11.02%(p<0.05)。在Pb單一脅迫下，狼尾草種子發(fā)芽率和發(fā)芽指數(shù)隨著Pb濃度的增加逐漸降低，Pb脅迫濃度為1 000 mg·L-1時，發(fā)芽率和發(fā)芽指數(shù)最低，分別為63.33%和18.12，較對照分別降低26.93%和22.01%。Cd、Pb復合脅迫顯著抑制狼尾草種子的萌發(fā)(p<0.05)，發(fā)芽率和發(fā)芽指數(shù)較對照分別降低3.85%～41.54%和3.23%～68.23%，在復合重金屬脅迫濃度為Cd 80 mg·L-1+Pb 1 000 mg·L-1時二者均達到最低值。

注：Cd濃度范圍內(nèi)不同鉛濃度水平之間的顯著差異用小寫字母(a～d)表示；Pb濃度范圍內(nèi)不同鎘濃度水平之間的顯著差異用大寫字母(A～D)表示，(p<0.05)。下同。圖1 Cd、Pb對狼尾草發(fā)芽率和發(fā)芽指數(shù)的影響Fig.1 Effects of Cd and Pb on germination rate and germination index of P. alopecuroides.

2.2 Cd、Pb脅迫對狼尾草幼苗生長的影響

由圖2可知，重金屬Cd、Pb脅迫顯著抑制狼尾草幼苗根和芽的生長，Cd、Pb單一脅迫下狼尾草幼苗根長較對照分別降低3.91%～63.04%和27.57%～79.37%，芽長分別降低25.74%～49.53%和5.87%～40.87%，其中Cd濃度為20 mg·L-1時，狼尾草的芽長高出對照4.54 mm，差異未達顯著水平(p>0.05)。Cd、Pb復合脅迫下狼尾草幼苗根長、芽長較對照顯著降低了29.08%～89.62%和13.23%～75.40%(p<0.05)。復合脅迫的抑制作用大于單一脅迫，且無論單一脅迫還是復合脅迫對根生長的抑制效果均明顯大于芽長。

圖2 Cd、Pb對狼尾草幼苗根長和芽長的影響Fig.2 Effects of Cd and Pb on root and bud length of P. alopecuroides seedlings

2.3 Cd、Pb脅迫對狼尾草幼苗可溶性蛋白含量和MDA含量的影響

由圖3可以看出，Cd、Pb單一脅迫下狼尾草幼苗可溶性蛋白含量隨著脅迫濃度的增加呈先升高后降低的變化趨勢，在Cd濃度為20 mg·L-1、Pb濃度為500 mg·L-1時可溶性蛋白含量達到最高，分別為3.34 mg·g-1和5.28 mg·g-1，較對照顯著增加了33.07%和110.36%(p<0.05)。Cd、Pb復合脅迫下狼尾草幼苗可溶性蛋白含量逐漸降低，當復合脅迫處理為A2+B2時可溶性蛋白含量最高(3.73 mg·g-1)，較對照高出48.61%；當復合脅迫處理為A4+B4時達到最低(0.92 mg·g-1)，比對照減少63.35%。

圖3 Cd、Pb對狼尾草幼苗可溶性蛋白含量和MDA含量的影響Fig.3 Effects of Cd and Pb on soluble protein content and MDA content of P. alopecuroides seedlings

狼尾草幼苗MDA含量隨著Cd、Pb濃度的增加顯著升高。在Cd濃度為80 mg·L-1、Pb濃度為1 000 mg·L-1時達到最大值，為0.30 μmol·g-1和0.35 μmol·g-1，較對照分別顯著增加了50.57%和77.57%(p<0.05)。當Cd、Pb復合脅迫處理為A4+B4時，MDA含量達到峰值(0.45 μmol·g-1)，為對照的2.25倍。復合脅迫對狼尾草幼苗MDA含量的促進作用高于單一脅迫。

2.4 Cd、Pb脅迫對狼尾草幼苗SOD和POD活性的影響

由圖4可知，Cd、Pb單一脅迫下狼尾草幼苗SOD活性隨著脅迫濃度的增加先升高后降低，在Cd濃度為20 mg·L-1、Pb濃度為250 mg·L-1時達到最大值，較對照分別顯著增加37.56%和25.87%(p<0.05)；在Cd濃度為80 mg·L-1、Pb濃度為500 mg·L-1時達到最小值，較對照分別降低7.45%和13.06%。Cd、Pb復合脅迫下狼尾草幼苗SOD活性隨著脅迫濃度的增加顯著降低(p<0.05)，在復合脅迫處理為A2+B2時，SOD活性達到峰值(473.20 U·g-1)，較對照增加了51.80%。當復合脅迫處理為A4+B4時，SOD活性達到最小值(145.30 U·g-1)，較對照降低了53.39%。

圖4 Cd、Pb對狼尾草幼苗SOD活性和POD活性的影響Fig.4 Effects of Cd and Pb on SOD activity and POD activity of P. alopecuroides seedlings

Cd單一脅迫下狼尾草幼苗POD活性隨著脅迫濃度的增加逐漸升高，在Cd濃度為80 mg·L-1時達到最大值，較對照顯著增加9.02%(p<0.05)。Pb單一脅迫下POD活性隨著脅迫濃度的增加先升高后降低再升高，表現(xiàn)為無規(guī)律波動，在Pb濃度為1 000 mg·L-1時達到最大值，較對照增加了8.38%(p<0.05)。在Cd、Pb復合脅迫下狼尾草幼苗POD活性隨著脅迫濃度的升高總體呈上升趨勢，在脅迫處理為A3+B4時POD活性達到峰值[1 088.04 U·(g·min)-1]，較對照提高了14.52%。

3 討 論

3.1 Cd、Pb對狼尾草種子萌發(fā)及幼苗生長的影響

種子萌發(fā)是植物生長的初始時期也是植物暴露于重金屬脅迫下的最早階段，能夠在一定程度上反映出植物耐逆境脅迫的能力[9,11,22]。通常認為，重金屬脅迫對植物種子萌發(fā)可表現(xiàn)出“低促高抑”的效應[10]。在本研究中，狼尾草種子萌發(fā)及幼苗對Cd、Pb脅迫的響應不同，在Cd脅迫下表現(xiàn)為低促高抑，在脅迫濃度為20 mg·L-1時可輕微促進狼尾草種子萌發(fā)及幼苗的生長，說明其對低濃度Cd表現(xiàn)出一定耐性，但隨脅迫濃度的升高，植株中蓄積累量越多，狼尾草種子萌發(fā)受阻，對幼苗生長的毒害作用也逐漸增強[22]；在Pb脅迫下表現(xiàn)為持續(xù)抑制，這與彭昌琴等[23]、朱紅霞等[24]研究有所差異。出現(xiàn)這一現(xiàn)象的原因可能是Pb阻礙了狼尾草種子內(nèi)部蛋白質和淀粉的合成，從而導致狼尾草種子萌發(fā)及幼苗根和芽的伸長受到了抑制[25]，同時也證明了狼尾草種子對重金屬耐受性表現(xiàn)為Cd>Pb。此外，Cd、Pb復合脅迫相較于Cd、Pb單一脅迫對狼尾草影響更大，說明Cd與Pb存在協(xié)同作用加大對狼尾草的毒害，這與鄒文桐等[26]結果一致。在本研究中Cd、Pb單一脅迫與復合脅迫對根伸長的抑制效果均大于芽長，這可能是狼尾草種子胚根突破種皮吸收溶液中重金屬，將重金屬離子固定在根系細胞壁上，導致根尖細胞有絲分裂速度減慢甚至無法正常分裂，從而抑制其根的伸長[22]，與趙雅曼等[10]研究基本一致。

3.2 Cd、Pb對狼尾草幼苗生理特性的影響

植物體內(nèi)的可溶性蛋白作為滲透調節(jié)物質與重金屬離子結合，形成一種重金屬結合蛋白，減少游離態(tài)重金屬離子的含量，從而減輕重金屬對植物的損傷[27-28]。在本研究中，Cd、Pb單一脅迫下狼尾草幼苗體內(nèi)可溶性蛋白的含量先升高后降低，而復合脅迫下狼尾草幼苗體內(nèi)可溶性蛋白的含量持續(xù)降低，這與張家洋[29]的研究結果相似，與郭堤等[30]研究結果不一致，可能是在低濃度Cd、Pb脅迫下狼尾草幼苗為維持細胞正常代謝合成大量可溶性蛋白，當狼尾草體內(nèi)重金屬離子進一步增多或Cd、Pb復合脅迫時，多肽表達受到抑制從而降低了可溶性蛋白含量[27]。

MDA含量通常用于指示植物細胞膜受損的程度，其作為脂質過氧化作用的最終分解產(chǎn)物反映了重金屬脅迫下的活性氧水平[31]。在本研究中，狼尾草幼苗MDA含量與Cd、Pb脅迫濃度呈正相關，這與TAUQEER等[32]研究基本一致，可能是細胞內(nèi)重金屬濃度升高時，誘發(fā)狼尾草幼苗體內(nèi)活性氧的鏈式反應，羥基自由基(-OH)、超氧自由基(-O2-)大量積累對細胞膜造成損傷[33]。另外本研究發(fā)現(xiàn)，在相同Cd濃度脅迫下，隨著Pb脅迫濃度的升高MDA含量大幅增加，說明Pb脅迫造成的狼尾草幼苗細胞膜損害程度更加嚴重。

SOD、POD在植物的抗氧化酶系統(tǒng)中起協(xié)同作用維持自由基正常代謝，在一定范圍內(nèi)能有效去除體內(nèi)過量的ROS以減輕重金屬對植物的損傷[20,34-35]。在本研究中，隨著Cd、Pb脅迫濃度的升高，狼尾草幼苗SOD活性呈先增后減的趨勢，在Cd、Pb復合處理為A2+B2時顯著激發(fā)了SOD潛在活性，當重金屬濃度進一步加大時SOD活性顯著降低，表明植物僅在一定的重金屬濃度范圍(Cd ≤ 20 mg·L-1、Pb ≤ 250 mg·L-1)具有抵抗力，這與陳順鈺等[34]、李瑞莉等[36]的研究基本一致。狼尾草幼苗POD活性隨著Cd、Pb脅迫濃度的升高總體上呈增加趨勢，這與李西等[11]的研究結果不一致，可能是Cd、Pb脅迫濃度的持續(xù)增加導致自由基動態(tài)平衡紊亂，抗氧化酶系統(tǒng)遭到破壞。

4 結 論

低濃度Cd(≤ 20 mg·L-1)單一脅迫促進狼尾草種子萌發(fā)及幼苗生長，高濃度則轉為抑制作用，Pb單一脅迫抑制狼尾草種子萌發(fā)及幼苗生長，復合脅迫比單一脅迫抑制作用更明顯，對狼尾草種子和幼苗造成的傷害更大。高濃度Cd、Pb單一及復合脅迫下，可溶性蛋白含量降低，MDA含量增加，抗氧化酶系統(tǒng)遭到破壞。狼尾草對兩種重金屬均有一定的耐性，可作為耐性植物材料應用在Cd、Pb污染風險較低地區(qū)。