不同處理對喜馬拉雅紫茉莉種子萌發(fā)和幼苗生長的影響

袁 芳，王 靖，蘭小中

(1.西藏農(nóng)牧學院食品科學學院，西藏 林芝 860000；2.西藏農(nóng)牧學院食品科學學院西藏特色農(nóng)牧資源協(xié)同創(chuàng)新中心，西藏 林芝 860000)

藏藥“五根”之一的喜馬拉雅紫茉莉(Mirabilishimalaica(Edgew.) Heimerl)是西藏Ⅰ級瀕危藏藥材之一，藏文音譯“巴朱”[1]?！吨袊参镏尽穼⑵錃w入紫茉莉科(Nyctaginaceae)山紫茉莉?qū)?Oxybaphus)，新擬名為山紫茉莉(O.himalaicusEdgew.)和變種中華山紫茉莉(O.himalaicusEdgew. var.chinensis)，主產(chǎn)于西藏東部及喜馬拉雅山區(qū)[2]。以根入藥，具有溫腎益腎、滋補生肌、利尿排石等功效，可消炎、止痛，是二十五味兒茶丸、紅花如意丸、十四味羚牛角丸和熱巴羅布膏等30余種藏藥成方制劑的主要原料之一[3-4]。從該種植物中分離得到的黃酮類化合物、生物堿類化合物、三萜類化合物以及多糖類化合物，具有抗病毒、抗癌、降血糖等活性[5-8]。

喜馬拉雅紫茉莉人工馴化與栽培處于初始階段，種植規(guī)模不大，規(guī)范化種植技術(shù)尚不完善，采挖野生藥材的現(xiàn)象仍然存在[9]。隨著藏藥工業(yè)化生產(chǎn)速度加快、市場開拓力度加強，對喜馬拉雅紫茉莉藥理作用及其藥用范圍的不斷深化拓展，對其原料藥的需求量越來越大。目前，喜馬拉雅紫茉莉野生資源已經(jīng)處于匱乏狀態(tài)。開展藏藥材野生馴化及人工種植是保護藏藥材野生資源并解決市場資源緊缺問題的有效途徑。

喜馬拉雅紫茉莉以種子繁殖為主[10-11]，研究其種子萌發(fā)特性，最大程度地提高種子的發(fā)芽率對實現(xiàn)其人工規(guī)?；N植至關重要，但是目前有關此方面的研究鮮有報道。蘭小中等[10]研究表明，喜馬拉雅紫茉莉的種子采收后在室溫下貯藏1～4年皆可萌發(fā)，但隨著貯藏年限的延長，種子會出現(xiàn)褪變現(xiàn)象，黑暗有利于種子萌發(fā)。盧驍?shù)萚11]研究表明，喜馬拉雅紫茉莉的成熟種子有分泌粘液的特性，有粘液種子的發(fā)芽率比去掉粘液種子的發(fā)芽率高8.3%左右。雖然國內(nèi)學者開展了一些喜馬拉雅紫茉莉種子質(zhì)量及萌發(fā)特性的研究，但仍不足以闡明喜馬拉雅紫茉莉種子的萌發(fā)特性。

因此，本研究以喜馬拉雅紫茉莉的種子為試驗材料，探討不同消毒方法、浸種時間以及植物生長調(diào)節(jié)劑處理對喜馬拉雅紫茉莉種子萌發(fā)和幼苗生長的影響，旨在為這一珍貴藥用植物資源的保護和栽培提供理論依據(jù)。

1 材料和方法

1.1 供試材料

喜馬拉雅紫茉莉種子于2019年9月采自西藏林芝市西藏農(nóng)牧學院藏藥材種質(zhì)資源圃。種子自然干燥后在通風、干燥、避光的室內(nèi)存儲。于2020年5月開展實驗。種子千粒重為14.457 g。

1.2 試驗方法

1.2.1種子消毒與浸種時間處理

將種子用流水沖洗5 min后轉(zhuǎn)入超凈工作臺，分別進行如下處理： 1) 只用無菌水沖洗種子5次后接種到無菌萌發(fā)紙上，將該處理作為對照。 2) 用75%乙醇消毒1 min，無菌水沖洗3次，然后用0.1% HgCl2消毒2 min，無菌水沖洗3次。 3) 用75%乙醇消毒1 min，無菌水沖洗3次，然后用3% H2O2消毒3 min，無菌水沖洗3次。種子經(jīng)各種方法消毒后，分別用無菌水經(jīng)不同時間的浸種，然后接種于無菌萌發(fā)紙上。浸種時間設置為不浸種、浸種12 h、24 h、36 h、48 h、60 h和72 h共7個處理。以上消毒和浸種時間各處理均設3次重復，每個重復1個培養(yǎng)皿。

1.2.2植物生長調(diào)節(jié)劑處理

根據(jù)1.2.1的試驗結(jié)果，種子用最適消毒方法消毒后用無菌水浸泡適當時間，然后濾去多余的水分，用不同種類和濃度的植物生長調(diào)節(jié)劑浸種5 min。根據(jù)預試驗結(jié)果，選用6-芐氨基腺嘌呤(6-BA)、萘乙酸(NAA)、吲哚-3-乙酸(IAA)、吲哚丁酸(IBA)、2,4-二氯苯氧乙酸(2,4-D)和赤霉素(GA3)6種植物生長調(diào)節(jié)劑，濃度分別設置為6-BA(2、4、6、8、10 mg·L-1)，NAA(2、4、6、8、10 mg·L-1)，IAA(2、 4、6、8、10 mg·L-1)，IBA(2、4、6、8、10 mg·L-1)，2,4-D(2、4、6、8、10 mg·L-1)，GA3(20、50、100、150、200、250、300、400 mg·L-1)。每個處理設3次重復，每個重復1個培養(yǎng)皿。

上述試驗采用培養(yǎng)皿紙床發(fā)芽法，將兩層PhytoTC種子萌發(fā)紙鋪在培養(yǎng)皿中高溫高壓滅菌后烘干備用。所用試劑均用無菌水配制，植物生長調(diào)節(jié)劑母液抽濾滅菌。將培養(yǎng)皿內(nèi)的萌發(fā)紙用4 mL無菌水(消毒與浸種時間處理)或植物生長調(diào)節(jié)劑溶液(植物生長調(diào)節(jié)劑處理)浸濕，種子均勻接種在萌發(fā)紙上，并用Parafilm封口膜進行封口。在培養(yǎng)箱中于20 ℃、全黑暗環(huán)境下培養(yǎng)。每14 d向各處理培養(yǎng)皿中加入4 mL無菌水。

1.2.3測定指標與計算公式

從處理當天開始，每24 h記錄各培養(yǎng)皿中萌發(fā)的種子數(shù)，胚根露出種孔3 mm視為種子萌發(fā)。連續(xù)7 d對照組和試驗組的種子萌發(fā)數(shù)不變時視為種子萌發(fā)進程結(jié)束，并測定幼苗的根長、莖長、鮮重和干重。

發(fā)芽啟動時間，即萌發(fā)時滯，指從萌發(fā)試驗開始到第1粒種子開始萌發(fā)所持續(xù)的天數(shù)；發(fā)芽持續(xù)時間，即種子開始萌發(fā)到最后1粒種子萌發(fā)的總天數(shù)；

帶菌率(%)=(污染種子數(shù)/供試種子總數(shù))×100%；

發(fā)芽率(%)=(種子發(fā)芽總數(shù)/供試種子總數(shù))×100%；

發(fā)芽勢(%)=(發(fā)芽初期(前4 d)正常發(fā)芽種子數(shù)/供試種子總數(shù))×100%；

發(fā)芽指數(shù)=∑(Gt/Dt)，

式中：Gt為t日內(nèi)的發(fā)芽數(shù)，Dt為相應的發(fā)芽日數(shù)；

活力指數(shù)=S×GI，

式中：S為幼苗平均鮮質(zhì)量，GI為發(fā)芽指數(shù)[12-13]。

1.2.4數(shù)據(jù)處理

采用Excel 2010軟件進行整理和作圖，SPSS 19.0軟件進行差異顯著性分析(p<0.05)。

2 結(jié)果與分析

2.1 不同消毒方法與浸種時間處理對喜馬拉雅紫茉莉種子萌發(fā)的影響

由表1可知，所試的21種處理下，只有10種處理的種子有少數(shù)萌發(fā)。從污染情況來看，75%乙醇1 min+0.1% HgCl22 min的消毒效果最好，75%乙醇1 min+3% H2O23 min次之，只用無菌水沖洗5次的種子污染較嚴重，但帶菌率均低于27%；另外，各消毒方法處理下的種子隨著浸種時間的延長帶菌率呈升高趨勢。從種子的萌發(fā)情況來看，只用無菌水沖洗5次的種子總體發(fā)芽情況較好，75%乙醇1 min+3% H2O23 min次之，75%乙醇1 min+0.1% HgCl22 min處理下的種子發(fā)芽率最低，并且各消毒處理下的種子隨著浸種時間的延長，發(fā)芽率顯著下降。將種子用無菌水沖洗5次后，不經(jīng)過浸泡直接接種到無菌萌發(fā)紙上進行培養(yǎng)，雖然種子帶菌率為3.74%，但是種子的發(fā)芽率最高，為30.64%。

表1 不同消毒方法與浸種時間處理對喜馬拉雅紫茉莉種子萌發(fā)的影響Table 1 Effects of different disinfection treatments and seed-soaking time on seed germination of M. himalaica

2.2 不同濃度植物生長調(diào)節(jié)劑對喜馬拉雅紫茉莉種子萌發(fā)的影響

2.2.1不同濃度IBA對喜馬拉雅紫茉莉種子萌發(fā)的影響

由表2可知，IBA 2～10 mg·L-1時對種子萌發(fā)有一定的抑制作用。與對照相比較，種子發(fā)芽啟動時間和發(fā)芽持續(xù)時間呈延長趨勢，發(fā)芽率、發(fā)芽勢和發(fā)芽指數(shù)均呈下降趨勢，活力指數(shù)則高于對照。綜上可知，IBA不利于種子萌發(fā)，但是可以促進幼苗生長增加鮮重。

表2 不同濃度IBA對喜馬拉雅紫茉莉種子萌發(fā)的影響Table 2 Effects of different concentrations of IBA on seed germination of M. himalaica

2.2.2不同濃度6-BA對喜馬拉雅紫茉莉種子萌發(fā)的影響

由表3可知，6-BA 2～10 mg·L-1時均可適當縮短發(fā)芽啟動時間；在發(fā)芽持續(xù)時間方面，2 mg·L-1處理與對照無顯著差異，4 mg·L-1、6 mg·L-1、8 mg·L-1和10 mg·L-1處理比對照延長。2～10 mg·L-1處理下，發(fā)芽率、發(fā)芽勢、發(fā)芽指數(shù)和活力指數(shù)均顯著高于對照；其中10 mg·L-1處理下，發(fā)芽率、發(fā)芽勢、發(fā)芽指數(shù)和活力指數(shù)最高，比對照分別提高33.03%、31.36%、10.24和1.21。綜上可知，在試驗設定的不同濃度6-BA處理中，濃度為10 mg·L-1浸種效果最好。

表3 不同濃度6-BA對喜馬拉雅紫茉莉種子萌發(fā)的影響Table 3 Effects of different concentrations of 6-BA on seed germination of M. himalaica

2.2.3不同濃度2,4-D對喜馬拉雅紫茉莉種子萌發(fā)的影響

由表4可知，2,4-D 2～10 mg·L-1時對種子萌發(fā)表現(xiàn)為一定的抑制作用。發(fā)芽啟動時間比對照顯著延長；發(fā)芽率、發(fā)芽勢和發(fā)芽指數(shù)也顯著低于對照；從活力指數(shù)顯示，2,4-D 2～4 mg·L-1可以促進幼苗生長，6～10 mg·L-1則顯著抑制幼苗生長。

表4 不同濃度2,4-D對喜馬拉雅紫茉莉種子萌發(fā)的影響Table 4 Effects of different concentrations of 2,4-D on seed germination of M. himalaica

2.2.4不同濃度IAA對喜馬拉雅紫茉莉種子萌發(fā)的影響

由表5可知，IAA 2、6、8、10 mg·L-1處理的種子發(fā)芽率、發(fā)芽勢和發(fā)芽指數(shù)低于對照，4 mg·L-1處理的種子發(fā)芽率、發(fā)芽指數(shù)和活力指數(shù)最高，比對照分別提高2.29%、2.98和0.86，發(fā)芽啟動時間比對照提前1.33 d，發(fā)芽持續(xù)時間則比對照延長4.67 d。綜上可知，IAA 4 mg·L-1對種子萌發(fā)和幼苗生長有一定的促進作用。

表5 不同濃度IAA對喜馬拉雅紫茉莉種子萌發(fā)的影響Table 5 Effects of different concentrations of IAA on seed germination of M. himalaica

2.2.5不同濃度NAA對喜馬拉雅紫茉莉種子萌發(fā)的影響

由表6可知，NAA不同濃度處理對種子萌發(fā)表現(xiàn)為一定的抑制作用，發(fā)芽率、發(fā)芽勢和發(fā)芽指數(shù)均顯著低于對照；當NAA濃度大于4 mg·L-1時，不利于幼苗的生長。

表6 不同濃度NAA對喜馬拉雅紫茉莉種子萌發(fā)的影響Table 6 Effects of different concentrations of NAA on seed germination of M. himalaica

2.2.6不同濃度GA3對喜馬拉雅紫茉莉種子萌發(fā)的影響

由表7可知，不同濃度的GA3處理對種子萌發(fā)表現(xiàn)為一定的促進作用，并且對延遲發(fā)芽持續(xù)時間也有一定的作用。在各處理下，種子的發(fā)芽率、發(fā)芽勢、發(fā)芽指數(shù)和活力指數(shù)均明顯高于對照；其中，在300 mg·L-1處理下，發(fā)芽率、發(fā)芽勢和活力指數(shù)最高，比對照分別提高22.49%、22.49%和1.16，發(fā)芽指數(shù)也比對照提高8.22。綜上可知，在試驗設定的不同濃度GA3處理中，濃度為300 mg·L-1浸種效果最好。

表7 不同濃度GA3對喜馬拉雅紫茉莉種子萌發(fā)的影響Table 7 Effects of different concentrations of GA3 on seed germination of M. himalaica

2.2.76-BA、IAA和GA3最優(yōu)處理的比較分析

對2.2.1～2.2.6所試的不同種類和濃度的植物生長調(diào)節(jié)劑處理進行綜合比較分析，結(jié)果發(fā)現(xiàn)，IBA、2,4-D和NAA在濃度為2～10 mg·L-1時，對喜馬拉雅紫茉莉種子的萌發(fā)均表現(xiàn)出一定的抑制作用，主要表現(xiàn)為種子發(fā)芽率、發(fā)芽勢和發(fā)芽指數(shù)均低于對照。IAA對種子萌發(fā)也有一定的抑制作用，但在濃度為4 mg·L-1時，種子發(fā)芽率、發(fā)芽指數(shù)和活力指數(shù)則高于對照。試驗設定的6-BA和GA3各濃度處理均可促進喜馬拉雅紫茉莉種子的萌發(fā)。

對6-BA、IAA和GA3的最優(yōu)濃度處理進行比較分析。由圖1可知，用6-BA 10 mg·L-1和GA3300 mg·L-1處理的種子各項發(fā)芽指標均顯著高于對照；IAA 4 mg·L-1處理的種子除了發(fā)芽勢低于對照外，其余指標均高于對照，但差異不明顯；3種最優(yōu)濃度處理中，6-BA 10 mg·L-1處理的種子發(fā)芽率、發(fā)芽勢、發(fā)芽指數(shù)和活力指數(shù)最高，分別為63.67%、62.00%、16.47和1.43，與對照相比較，發(fā)芽率提高了1.01倍，發(fā)芽勢提高了0.96倍，發(fā)芽指數(shù)提高了1.65倍，活力指數(shù)提高了5.50倍。

圖1 6-BA、IAA和GA3處理對喜馬拉雅紫茉莉種子萌發(fā)的影響Fig.1 Effects of the treatments with 6-BA, IAA and GA3 on seed germination of M. himalaica

綜上可知，6-BA 10 mg·L-1對喜馬拉雅紫茉莉種子萌發(fā)的促進作用最顯著。

2.3 不同濃度植物生長調(diào)節(jié)劑對喜馬拉雅紫茉莉幼苗生長的影響

由表8可知，不同濃度的植物生長調(diào)節(jié)劑處理對喜馬拉雅紫茉莉種子幼苗的生長影響不同。IBA 2～10 mg·L-1處理，隨著濃度的增大，幼苗的根長、莖長、鮮重和干重呈先升高后降低的趨勢，但是鮮重增長較明顯；在IBA 4 mg·L-1時，根長、莖長、鮮重和干重均高于對照，其中莖長和鮮重達到所有處理的最大值，分別為71.52 mm和137.10 mg。在6-BA 2～10 mg·L-1處理中，隨著濃度的增大，根長、莖長和鮮重呈升高的趨勢；6-BA 2 mg·L-1對根伸長生長有明顯的促進作用，根長達93.50 mm；6-BA 8～10 mg·L-1處理有利于幼苗干物質(zhì)的積累。2,4-D 2～10 mg·L-1對根長、莖長、鮮重和干重有一定的抑制作用。IAA 2～10 mg·L-1處理的種子與對照相比較，其幼苗的根長、莖長和鮮重都有不同程度的升高，其中在IAA 8 mg·L-1時根長達到所有處理的最大值，為111.69 mg；干重僅在IAA 2 mg·L-1處理時高于對照，其余處理均低于對照。NAA 2～10 mg·L-1處理下幼苗根長均低于對照；莖長和鮮重隨著NAA濃度增大呈先升高后降低的趨勢；對幼苗干物質(zhì)的積累總體上表現(xiàn)為抑制作用。在GA320～400 mg·L-1處理下，幼苗的莖長、鮮重和干重均高于對照，其中GA3250～400 mg·L-1處理下，干重達到所有處理的最大值，平均干重大于8.00 mg；GA3濃度大于300 mg·L-1時會抑制根的伸長生長。

表8 不同濃度植物生長調(diào)節(jié)劑對喜馬拉雅紫茉莉幼苗生長的影響Table 8 Effects of different concentrations of plant growth regulators on seedling growth of M. himalaica

3 結(jié)論與討論

種子活力的保持和成功萌發(fā)成苗決定著植物種群的繁衍和生存，也決定植物進入自然和農(nóng)業(yè)生態(tài)系統(tǒng)的時間[14]。因此，種子萌發(fā)具有重要的經(jīng)濟和生態(tài)意義。影響種子萌發(fā)的因素有很多，包括外部生態(tài)因素和內(nèi)部生理因素，對不同植物來說，影響種子萌發(fā)的主要因子也有差異[14-15]。

種子帶菌會引起種苗病害。本試驗中所試的2種消毒方法(75%乙醇1 min+0.1% HgCl22 min和75%乙醇1 min+3% H2O23 min)均能達到較好的消毒效果，但是發(fā)芽率顯著低于對照。其原因可能是，HgCl2易在種子上殘留，不易分解，從而對種子產(chǎn)生持續(xù)的毒害，降低種子發(fā)芽率；H2O2有一定的腐蝕性，消毒時間較長則可能破壞了種子結(jié)構(gòu)。只用無菌水沖洗5次后直接接種的種子，雖然帶菌率為3.74%，但是種子發(fā)芽率顯著高于消毒處理。另外在浸種時間試驗中發(fā)現(xiàn)，隨著時間的延長，種子污染情況愈發(fā)嚴重，并且嚴重影響到種子發(fā)芽和幼苗生長。喜馬拉雅紫茉莉種子在遇水后很快在種子表面出現(xiàn)白色的黏液。種子黏液是在種皮外層細胞的高爾基體內(nèi)產(chǎn)生并分泌到胞腔內(nèi)或細胞壁層的吸濕膨脹的果膠類多糖物質(zhì)[10-11]。種子黏液不利于消毒劑充分接觸被消毒材料，并且給一些微生物提供了“藏身之所”。

外源激素法是揭示種子休眠和萌發(fā)的激素調(diào)控機理的重要研究方法，已被廣泛應用于種子萌發(fā)特性研究，使用植物生長調(diào)節(jié)劑浸種可以打破種子休眠，破壞妨礙種子萌發(fā)的活性物質(zhì)，從而促進種子胚的發(fā)育和種子發(fā)芽[14]。本試驗中，IBA、2,4-D、NAA和IAA對喜馬拉雅紫茉莉種子的萌發(fā)主要表現(xiàn)為抑制作用，一定濃度的6-BA和GA3可以促進種子萌發(fā)。6-BA具有促進細胞分裂、種子發(fā)芽、誘導休眠芽生長，以及抑制或促進莖、葉和根的生長等生理作用[16]。GA3具有促進細胞伸長，解除種子、塊莖的休眠并促進萌發(fā)等生理作用[17]。本試驗中，6-BA 10 mg·L-1對喜馬拉雅紫茉莉種子萌發(fā)的促進作用最顯著，其次是GA3300 mg·L-1。

植物生長調(diào)節(jié)劑對幼苗生長也有巨大的影響[16,18]。在本試驗設定的濃度范圍內(nèi)，6-BA、GA3、IBA和IAA對喜馬拉雅紫茉莉幼苗生長有明顯的促進作用，NAA和2,4-D不利于幼苗干物質(zhì)的累積。