上皮間質(zhì)轉(zhuǎn)化相關(guān)標(biāo)志物在不同類型慢性鼻竇炎患者中的表達(dá)*

蔣 迪，陳順金，林正權(quán)，胡金成，黃妙銘，徐志鴻，何錦添，傅 明

（南方醫(yī)科大學(xué)附屬東莞人民醫(yī)院耳鼻咽喉科，東莞 523000）

慢性鼻竇炎（chronic rhinosinusitis，CRS）是一種常見的鼻腔鼻竇黏膜炎癥，多中心流行病學(xué)調(diào)查顯示，我國(guó)CRS 的總患病率為8.0%（4.8%～9.7%）[1]。目前臨床上主要根據(jù)是否有鼻息肉分為慢性鼻竇炎伴鼻息肉（chronic rhinosinusitis with nasal polyps,CRSwNP）和慢性鼻竇炎不伴鼻息肉（chronic rhinosinusitis without nasal polyps,CRSs-NP）兩種類型。上皮間質(zhì)轉(zhuǎn)化（epithelial-mesenchymal transition state，EMT）是上皮組織重塑的關(guān)鍵環(huán)節(jié)之一[2]，在CRS 的發(fā)病中有重要作用[3-4]。但目前對(duì)CRS 中EMT 的研究較為籠統(tǒng)，且多針對(duì)CRS 的臨床表型進(jìn)行研究，未見根據(jù)內(nèi)型將CRS細(xì)化之后EMT 的相關(guān)報(bào)道。最新歐洲鼻竇炎指南2020（EPOS 2020）根據(jù)主導(dǎo)內(nèi)型將鼻竇炎分為非嗜酸性粒細(xì)胞型CRS（non-eosinophilic chronic rhinosinusitis,Non-ECRS）和嗜酸性粒細(xì)胞型CRS（eosinophilic chronic rhinosinusitis,ECRS）[5]。本研究通過檢測(cè)上皮細(xì)胞標(biāo)志物E-鈣粘素(E-cadherin)、閉合蛋白（Occludin）、封閉蛋白4（Claudin-4）及間質(zhì)細(xì)胞標(biāo)志物N-鈣粘素(N-cadherin)、α-平滑肌肌動(dòng)蛋白(α-SMA)、波形蛋白（Vimentin）在不同類型CRS 中的表達(dá)差異，觀察EMT在不同類型CRS中的作用。

1 材料與方法

1.1 臨床資料 選取2019 年9 月至2020 年5 月在廣東省東莞市人民醫(yī)院耳鼻咽喉頭頸外科行鼻內(nèi)鏡手術(shù)的患者40例，根據(jù)CRS診斷和治療指南標(biāo)準(zhǔn)（EPOS 2020）[5]進(jìn)行診斷分型，分為Non-ECRS組和ECRS組，每組20例。其中Non-ECRS組男12例，女8例，年齡17～56歲，平均36.8歲；ECRS組男10例，女10例，年齡19～48歲，平均35.2歲。另收集同期在本院行鼻內(nèi)鏡手術(shù)患者的中鼻道篩竇黏膜組織標(biāo)本15 例作為對(duì)照組，CT 提示對(duì)照組所有患者均無鼻竇炎性疾病，其中男8例，女7例，年齡19～45歲，平均34.7歲。排除標(biāo)準(zhǔn)：術(shù)前1個(gè)月內(nèi)接受抗生素、糖皮質(zhì)激素及抗組胺藥物治療者；單側(cè)后鼻孔息肉、真菌性鼻——鼻竇炎、變應(yīng)性鼻炎、哮喘、囊性纖維化、糖尿病、艾滋病、免疫系統(tǒng)性疾病等免疫系統(tǒng)功能不全者。本研究已取得醫(yī)院倫理委員會(huì)批準(zhǔn)（倫理注冊(cè)號(hào)：KYKT2018-039），所有患者及家屬均已簽署知情同意書。

1.2 組織的獲取與處理 由同一位高年資醫(yī)師在手術(shù)中留取實(shí)驗(yàn)組和對(duì)照組患者的中鼻道篩竇黏膜組織標(biāo)本。生理鹽水清洗后，將每個(gè)標(biāo)本分成兩份，1份立即冷凍并儲(chǔ)存于超低溫冰箱內(nèi)，隨后進(jìn)行Western blotting 檢測(cè)；另1 份則固定于4%多聚甲醛溶液用于免疫組織化學(xué)染色。

1.3 蘇木精—伊紅（HE）染色及病理分型 組織標(biāo)本脫水，石蠟包埋，切片（厚度4 μm），行HE 染色。在顯微鏡下隨機(jī)選取5 個(gè)高倍鏡（×200）下視野，計(jì)算嗜酸性粒細(xì)胞的數(shù)目，取平均值。每個(gè)高倍視野（×200）超過10 個(gè)嗜酸性粒細(xì)胞數(shù)定義為ECRS[6]，否則為Non-ECRS。

1.4 免疫組織化學(xué)染色 組織切片脫蠟，抗原修復(fù)，清除過氧化物，一抗（E-cadherin、N-cadherin、Claudin-4、Occludin、α-SMA 和Vimentin，英國(guó)Abcam公司）孵育，辣根過氧化物酶標(biāo)記的二抗IgG孵育（中杉金橋PV9000），DAB 顯影，蘇木精復(fù)染，脫水，中性樹膠封片。在光學(xué)顯微鏡下隨機(jī)選取5 個(gè)視野進(jìn)行觀測(cè)。實(shí)驗(yàn)采取雙盲原則，并由專業(yè)的病理醫(yī)師進(jìn)行觀察，以免疫染色強(qiáng)度和陽(yáng)性細(xì)胞百分比作為定量評(píng)分標(biāo)準(zhǔn)。根據(jù)細(xì)胞染色強(qiáng)度評(píng)為4級(jí)，無陽(yáng)性著色（陰性）計(jì)0分，淡黃色（弱陽(yáng)性）計(jì)1分，棕黃色（陽(yáng)性）計(jì)2 分，棕褐色（強(qiáng)陽(yáng)性）計(jì)3 分；根據(jù)陽(yáng)性細(xì)胞百分比評(píng)為4級(jí)，≤25%計(jì)1分，26%～50%計(jì)2 分，51%～75%計(jì)3 分，＞75%計(jì)4 分，將兩項(xiàng)評(píng)分相乘得出最終評(píng)分結(jié)果[7]。

1.5 Western blotting 檢測(cè) 用RIPA 蛋白裂解液試劑盒提取總蛋白，BCA法測(cè)定蛋白濃度。95 ℃煮沸5 min使蛋白變性，取20 μg蛋白進(jìn)行8%聚丙烯酰胺凝膠電泳，轉(zhuǎn)移至PVDF 膜，封閉，加入一抗E-cadherin、Occludin、α-SMA、Claudin-4、Vimentin、N-cadherin（均1∶2 000）和GAPDH（1∶5 000，Abcam)，4 ℃孵育過夜，洗膜，加入相應(yīng)二抗（1∶5 000，Abcam），ECL 顯色，LAS-4000 型熒光圖像分析儀采集圖像，用Quantity One 圖像分析軟件分析蛋白條帶灰度值。

1.6 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法 采用SPSS 22.0統(tǒng)計(jì)軟件進(jìn)行數(shù)據(jù)分析。計(jì)量資料以均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差（）表示，多組間比較采用方差分析，組間兩兩比較采用LSD-t檢驗(yàn)，P＜0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 HE染色結(jié)果 光學(xué)顯微鏡下可見對(duì)照組鼻竇黏膜細(xì)胞結(jié)構(gòu)完整，黏膜細(xì)胞以假?gòu)?fù)層纖毛柱狀上皮居多，纖毛長(zhǎng)短、粗細(xì)均勻，排列整齊；Non-ECRS組及ECRS組鼻黏膜上皮層和纖毛局部缺失。Non-ECRS 組主要表現(xiàn)為細(xì)胞外基質(zhì)沉積，黏膜下間質(zhì)纖維化，基底膜增厚和上皮細(xì)胞局部增生，間質(zhì)中可見以中性粒細(xì)胞或淋巴細(xì)胞浸潤(rùn)為主的炎性細(xì)胞；ECRS組表現(xiàn)為黏膜下水腫疏松的結(jié)締組織，腺體增生，間質(zhì)中可見大量嗜酸性粒細(xì)胞浸潤(rùn)和上皮細(xì)胞大量杯狀細(xì)胞化生，見圖1。

圖1 鼻黏膜HE染色圖(×200)

2.2 3 組E-cadherin、Occludin、Claudin-4、α-SMA、N-cadherin、Vimentin 表達(dá)比較 免疫組化染色顯示，與對(duì)照組相比，Non-ECRS 組和ECRS 組E-cadherin、Occludin和Claudin-4表達(dá)均明顯下調(diào)，N-cadherin、α-SMA 和Vimentin 表達(dá)均明顯上調(diào)（均P＜0.001）；ECRS 組E-cadherin 表達(dá)明顯高于Non-ECRS 組，N-cadherin、α-SMA 和Vimentin 表達(dá)明顯低于Non-ECRS組（均P＜0.05），而兩組Occludin和Claudin-4表達(dá)無明顯差異（P＞0.05），見圖2。

圖2 E-cadherin、Occludin、Claudin-4、α-SMA、N-cadherin、Vimentin在篩竇黏膜組織中的表達(dá)（×200）

Western blotting 顯示，與對(duì)照組相比，Non-ECRS組和ECRS組E-cadherin、Occludin和Claudin-4 表達(dá)均明顯下調(diào)，N-cadherin、α-SMA 和Vimentin表達(dá)均明顯上調(diào)（均P＜0.05）。兩組E-cadherin、Occludin 和Claudin-4 蛋白表達(dá)比較，差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＞0.05），ECRS組N-cadherin、α-SMA、Vimentin蛋白表達(dá)明顯低于Non-ECRS組（P＜0.05），見圖3。

圖3 E-cadherin、Occludin、Claudin-4、α-SMA、N-cadherin、Vimentin在篩竇黏膜組織中的表達(dá)

3 討論

EMT 現(xiàn)象是指上皮細(xì)胞在正常生理和特定病理?xiàng)l件下發(fā)生向間充質(zhì)細(xì)胞表型轉(zhuǎn)化的現(xiàn)象[8]。EMT在慢性炎癥發(fā)生發(fā)展中有重要作用，這在支氣管哮喘、慢性阻塞性肺病等下呼吸道慢性炎性疾病中已經(jīng)得到了驗(yàn)證[9]。而CRS作為上氣道黏膜組織的慢性炎性疾病，EMT在其發(fā)病機(jī)制中所起的作用也越來越受到關(guān)注。

相鄰細(xì)胞上端的緊密連接和黏附連接為上呼吸道的上皮組織提供了有效的物理屏障。CRS 中黏膜組織的慢性炎癥損傷可誘導(dǎo)持續(xù)性的EMT，導(dǎo)致鼻腔鼻竇黏膜上皮細(xì)胞極性及E-cadherin 等黏附蛋白表達(dá)下降，同時(shí)，細(xì)胞骨架發(fā)生變化，Vimentin表達(dá)上調(diào)，細(xì)胞轉(zhuǎn)移能力增強(qiáng)[10]。多數(shù)學(xué)者認(rèn)為，CRSwNP、CRSsNP 中均存在EMT 現(xiàn)象，以CRSwNP 更為明顯[11-14]；也有學(xué)者認(rèn)為，與CRSwNP相比，CRSsNP 中并不存在明顯的EMT[15-16]；另外，Konnecke 等[17]發(fā)現(xiàn)，與鼻息肉組織相比，正常下鼻甲黏膜組織中E-cadherin 和Vimentin 表達(dá)均較低，并且?guī)缀鯚o法檢測(cè)到N-cadherin 表達(dá)，說明CRSwNP中僅發(fā)生了部分EMT。部分EMT可能與損傷后上皮細(xì)胞增殖、去分化等自我保護(hù)相關(guān)[18]。目前EMT在CRS的研究多集中于CRSwNP[17,19]，且多關(guān)注其臨床表型，研究顯示，在嗜酸性粒細(xì)胞型CRSwNP患者中發(fā)現(xiàn)可能存在由高遷移率族蛋白1誘導(dǎo)的EMT現(xiàn)象[20]，但并沒有針對(duì)CRS內(nèi)型來進(jìn)一步研究。

CRS是一種多因素參與的異質(zhì)性疾病，由于地區(qū)及人種差異，CRS 表型的表現(xiàn)也是各不相同，潛在的病理生理機(jī)制也是多樣的。內(nèi)型的分析可以增加對(duì)CRS 臨床異質(zhì)性的各種病理生理學(xué)和致病機(jī)制的理解，從而進(jìn)一步指導(dǎo)CRS 的精準(zhǔn)治療。EPOS 2020 已經(jīng)摒棄了以往的臨床表型分類方法，根據(jù)主導(dǎo)內(nèi)型（是否2型反應(yīng)）將原發(fā)性彌漫性鼻竇炎分為CRSwNP/嗜酸性鼻竇炎和非嗜酸性鼻竇炎[5]。CRS 是多種炎性細(xì)胞參與的慢性炎癥性疾病。根據(jù)炎性細(xì)胞浸潤(rùn)情況可分為中性粒細(xì)胞浸潤(rùn)、嗜酸粒細(xì)胞浸潤(rùn)、淋巴細(xì)胞或漿細(xì)胞浸潤(rùn)和混合型[21]。CRSsNP主要是由Th1細(xì)胞介導(dǎo)，中性粒細(xì)胞的水平通常高于嗜酸粒細(xì)胞。CRSwNP 在白種人中常傾向于以嗜酸性粒細(xì)胞（eosinophils，Eos）浸潤(rùn)為主的Th2 型炎癥反應(yīng)[21]，而亞洲人CRSwNP 傾向于Th1/Th17 炎性反應(yīng)，以較低的Eos 和較高的中性粒細(xì)胞組織浸潤(rùn)為特征[23-24],但近年來也表現(xiàn)出嗜酸粒細(xì)胞增加的趨勢(shì)。因此，我們以最新的EPOS 2020 為借鑒，根據(jù)主導(dǎo)內(nèi)型將鼻竇炎分為Non-ECRS 及ECRS。通過免疫組化和Western blotting觀察EMT相關(guān)蛋白在這兩種類型CRS患者鼻黏膜上皮的表達(dá)情況，結(jié)果顯示，與對(duì)照組相比，Non-ECRS 和ECRS 鼻黏膜上皮細(xì)胞中E-cadherin、Occludin 和Claudin-4 表達(dá)均明顯下調(diào)，且免疫組化染色結(jié)果顯示E-cadherin 在ECRS 中表達(dá)明顯高于Non-ECRS；Non-ECRS 和ECRS 患者中N-cadherin、α-SMA 和Vimentin 表達(dá)均明顯上調(diào)，且ECRS 組Ncadherin、α-SMA、Vimentin 蛋白表達(dá)明顯低于Non-ECRS 組（P＜0.05）。說明Non-ECRS 和ECRS 患者鼻黏膜上皮中均存在EMT現(xiàn)象，且以Non-ECRS更為明顯。

不同內(nèi)型CRS 中炎性細(xì)胞的活化傾向不同。本研究揭示了CRS 患者的鼻黏膜組織中確實(shí)存在EMT 的發(fā)生，但以Non-ECRS 更為明顯。因此，推斷EMT 現(xiàn)象可能與CRS 的炎性細(xì)胞類型有關(guān)，即Non-ECRS 鼻黏膜上皮中才會(huì)有更典型EMT 的現(xiàn)象，具體機(jī)制值得后續(xù)進(jìn)一步研究。