lncRNA NCRNA00173靶向miR-765對骨肉瘤細(xì)胞增殖、遷移和侵襲的影響的實(shí)驗(yàn)研究

吳昌強(qiáng)，韋 敏，鄭一鳴，林正堅(jiān)

（海南省海口市第三人民醫(yī)院骨科，海口 571100）

骨肉瘤（osteosarcoma）是兒童和青少年中發(fā)病率最高的惡性骨腫瘤，臨床上定位于長骨的干骺端。骨肉瘤常見于早期轉(zhuǎn)移和肺轉(zhuǎn)移，是導(dǎo)致骨肉瘤患者死亡的主要原因[1]。盡管數(shù)十年來研究者付出了很多努力，但骨肉瘤患者的五年生存率仍然不能令人滿意。由于骨肉瘤的早期癥狀是非特異性的，且治療有限[2]。因此，確定骨肉瘤的新診斷標(biāo)志物和治療靶標(biāo)至關(guān)重要。長非編碼RNA（long noncoding RNA，lncRNA）是一類長度超過200 個核苷酸的非編碼RNA分子，在多種生物學(xué)過程中具有重要功能，例如淋巴結(jié)的轉(zhuǎn)移、細(xì)胞凋亡和細(xì)胞周期控制、細(xì)胞發(fā)育和分化、轉(zhuǎn)錄和翻譯調(diào)控以及中樞代謝[3-5]。越來越多的證據(jù)證實(shí)，lncRNA 的表達(dá)失調(diào)通常與人類許多疾病有關(guān)，包括骨肉瘤在內(nèi)的多種類型的癌癥[6-7]。最近，發(fā)現(xiàn)一種新的lncRNA NCRNA00173 在肝癌中表達(dá)失調(diào)[8]。徐繪華等[9]通過lncRNA 芯片及實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)，NCRNA00173 在骨肉瘤組織中表達(dá)下調(diào)，且其低表達(dá)與腫瘤分化、遠(yuǎn)處轉(zhuǎn)移以及疾病分期密切相關(guān)。然而，NCRNA00173在骨肉瘤中的作用及潛在的分子機(jī)制知之甚少。本項(xiàng)研究旨在探討lncRNA NCRNA00173對骨肉瘤細(xì)胞的增殖、遷移和侵襲的影響，并探究其可能的作用機(jī)制，以期為骨肉瘤的靶向治療提供實(shí)驗(yàn)依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 細(xì)胞和主要試劑 骨肉瘤細(xì)胞株U2-OS、Saos-2、SJSA-1 和SOSP-9607 購于美國ATCC；人成骨細(xì)胞hFOB1.19 購于中國科學(xué)院上海細(xì)胞庫；DMEM培養(yǎng)基購于美國Gibco；脂質(zhì)體Lipofectamine 2000轉(zhuǎn)染試劑購于美國Invitrogen；胎牛血清和胰蛋白酶購于美國HyClone；總RNA 提取試劑盒、逆轉(zhuǎn)錄試劑盒和實(shí)時熒光定量PCR（qPCR)檢測試劑盒購于賽默飛世爾科技有限公司；miR-765 mimics及mimics control購于廣州市銳博生物科技有限公司；雙熒光素酶報(bào)告基因檢測試劑盒購于美國Promega；含miR-765結(jié)合位點(diǎn)NCRNA00173野生型熒光素酶重組報(bào)告質(zhì)粒（NCRNA00173-Wt）和含miR-765 結(jié)合位點(diǎn)NCRNA00173 突變型熒光素酶重組報(bào)告質(zhì)粒（NCRNA00173-Mut）購于上海吉瑪制藥技術(shù)有限公司；實(shí)驗(yàn)所用引物、pcDNA3.1 載體和pcDNANCRNA00173 重組載體質(zhì)粒購于上海生工生物工程有限公司；Transwell 小室購于美國Coming Costar；Matrigel 基質(zhì)膠購于BD Biosciences；增殖細(xì)胞核抗原（PCNA）、基質(zhì)金屬蛋白酶-2（MMP-2）和基質(zhì)金屬蛋白酶-9（MMP-9）單克隆抗體和二抗購于美國CST；ECL化學(xué)發(fā)光試劑、細(xì)胞裂解液、BCA蛋白濃度測定試劑盒購于賽默飛世爾。

1.2 細(xì)胞培養(yǎng) 將骨肉瘤細(xì)胞U2-OS、Saos-2、SJSA-1、SOSP-9607 和人成骨細(xì)胞hFOB1.19 置于含5%CO2、37 ℃恒溫培養(yǎng)箱中，并采用含10%胎牛血清、100 U/mL 青－鏈霉素的DMEM 培養(yǎng)基進(jìn)行培養(yǎng)。使用顯微鏡及時觀察細(xì)胞生長情況，每隔1 d更換1 次培養(yǎng)液，待細(xì)胞達(dá)85%匯合時進(jìn)行傳代培養(yǎng)。

1.3 細(xì)胞轉(zhuǎn)染 對數(shù)生長期的U2-OS 細(xì)胞種植于6孔板中，于37 ℃恒溫培養(yǎng)箱過夜培養(yǎng)，待細(xì)胞生長融合度至60%左右時，使用Lipofectamine 2000轉(zhuǎn)染試劑將pcDNA-NCRNA00173質(zhì)?；蚩蛰d質(zhì)粒轉(zhuǎn)染至U2-OS細(xì)胞，具體操作參照轉(zhuǎn)染試劑說明書。其中轉(zhuǎn)染pcDNA-NCRNA00173 質(zhì)粒的細(xì)胞作為NCRNA00173組，轉(zhuǎn)染空載質(zhì)粒的細(xì)胞作為pcDNA組，未行轉(zhuǎn)染的細(xì)胞作為空白對照即Con 組。轉(zhuǎn)染后各組U2-OS 細(xì)胞于37 ℃培養(yǎng)箱持續(xù)培養(yǎng)48 h，收集各組細(xì)胞進(jìn)行后續(xù)相關(guān)指標(biāo)檢測。

1.4 qPCR 實(shí)驗(yàn)檢測細(xì)胞中NCRNA00173 和miR-765 的表達(dá) 使用總RNA 提取試劑盒分別提取待測細(xì)胞中總RNA，測定RNA 的濃度，選取合格的RNA 利用逆轉(zhuǎn)錄試劑盒將RNA 逆轉(zhuǎn)錄成cDNA。采用cDNA 為模板，以GAPDH 和U6 為內(nèi)參，使用qPCR 檢測試劑盒分別檢測NCRNA00173 和miR-765的相對表達(dá)量，擴(kuò)增條件為：95 ℃預(yù)變性5 min；設(shè)40個循環(huán)，95 ℃變性30 s，60 ℃退火30 s，72 ℃延伸30 s。實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)采用2-ΔΔCt法計(jì)算。實(shí)驗(yàn)所需引物如下：NCRNA00173，F(xiàn)：5’-ACCTAGTCTTCCTTGGCACATC-3’，R：5’-GGGATATTGATCTGAAGGGTGA-3’。GAPDH，F(xiàn)：5’-CGCTCTCTGCTCCTCCTGTTC-3’，R：5’-ATCCGTTGACTCCGACCTTCAC-3’；miR-765，F(xiàn)：5’-GCCTGGAGGAGAAGGAA-3’，R：5’-GTGCAGGGTCCGAGGT-3’；U6，F(xiàn)：5’-CGCTAGCACATATCGGCTA-3’，R：5’-TTCTGCGACGAATTTGTCAT-3’。

1.5 雙熒光素酶報(bào)告實(shí)驗(yàn)檢測NCRNA00173 和miR-765的靶向關(guān)系 對數(shù)期的U2-OS細(xì)胞種植到6 孔板上，于37 ℃恒溫培養(yǎng)箱培養(yǎng)，待細(xì)胞貼壁后，將NCRNA00173-Wt 和NCRNA00173-Mut 熒光素酶重組載體質(zhì)粒分別和miR-765 mimics 或mimics control共轉(zhuǎn)染U2-OS細(xì)胞，具體轉(zhuǎn)染步驟參照Lipofectamine 2000轉(zhuǎn)染試劑使用說明，轉(zhuǎn)染后的U2-OS細(xì)胞37 ℃恒溫培養(yǎng)箱繼續(xù)培養(yǎng)48 h 后，收集細(xì)胞，使用雙熒光素酶報(bào)告基因檢測試劑盒測定細(xì)胞的相對熒光素酶活性。

1.6 噻唑藍(lán)（MTT）實(shí)驗(yàn)檢測細(xì)胞增殖能力 U2-OS 細(xì)胞以3×103個/孔種植于96 孔板上，于37 ℃恒溫培養(yǎng)箱培養(yǎng)，待細(xì)胞貼壁后進(jìn)行轉(zhuǎn)染（參考上述1.3項(xiàng)），分別在轉(zhuǎn)染24 h、48 h和72 h時向每孔細(xì)胞中添加100 μL MTT 溶液，37 ℃恒溫培養(yǎng)箱繼續(xù)孵育4 h，去上清培養(yǎng)液，再向每孔細(xì)胞中添加150 μL二甲基亞砜，待沉淀完全溶解后，使用酶標(biāo)儀在450 nm 波長處測定每孔細(xì)胞的吸光度（OD）值，以O(shè)D值反映細(xì)胞增殖能力。

1.7 克隆形成實(shí)驗(yàn)檢測細(xì)胞克隆形成能力 U2-OS 細(xì)胞按照上述1.3 分組處理，24 h 后以胰蛋白酶消化各組U2-OS 細(xì)胞，收集并計(jì)數(shù)，向每個培養(yǎng)皿中接種300 個細(xì)胞，于37 ℃培養(yǎng)箱培養(yǎng)，換液1 次/3 d，培養(yǎng)約2周后出現(xiàn)細(xì)胞克?。ㄈ庋劭梢姡r終止培養(yǎng)，以PBS洗滌2次，采用4%多聚甲醛染色20 min，GIMSA染色液染10 min，觀察并計(jì)數(shù)各組U2-OS細(xì)胞克隆形成數(shù)（＞50 個細(xì)胞克隆記為1 個細(xì)胞克隆）。

1.8 劃痕實(shí)驗(yàn)檢測細(xì)胞遷移能力 U2-OS 細(xì)胞按照上述1.3 項(xiàng)分組處理24 h 后，以胰蛋白酶消化各組U2-OS細(xì)胞，以3×105個/孔接種到6孔板（背面畫有直線）中，待細(xì)胞鋪滿底部時，使用槍頭垂直6 孔板背面直線進(jìn)行劃線，以PBS洗滌3次，再加入培養(yǎng)液2 mL，拍照，此時記為0 h，將6 孔板放置在37 ℃培養(yǎng)箱培養(yǎng)24 h，拍照此時記為24 h，采用Image J軟件計(jì)算U2-OS細(xì)胞劃痕愈合率。

1.9 Transwell 實(shí)驗(yàn)檢測細(xì)胞侵襲和遷移能力 以0.25%胰蛋白酶消化并收集轉(zhuǎn)染48 h后各組U2-OS細(xì)胞，以PBS洗滌3次，使用不含血清的培養(yǎng)液懸浮細(xì)胞，調(diào)整細(xì)胞密度至5×105/mL。在Transwell小室的下室加入含10%胎牛血清的培養(yǎng)液500 μL，在上室（小室的上室未以Matrigel 基質(zhì)膠包被的為細(xì)胞遷移實(shí)驗(yàn)，上室以Matrigel 膠包被的為細(xì)胞侵襲實(shí)驗(yàn)）加入200 μL 細(xì)胞懸液，將小室放置在37 ℃恒溫培養(yǎng)箱繼續(xù)培養(yǎng)48 h，取出Transwell 小室，用干凈的棉簽拭去上室未穿過膜的細(xì)胞，用多聚甲醛固定，隨后使用0.1%的結(jié)晶紫染色10 min，使用倒置顯微鏡隨機(jī)選取6 個視野拍照并計(jì)數(shù)，以穿膜細(xì)胞數(shù)反映U2-OS細(xì)胞的遷移或侵襲能力。

1.10 蛋白質(zhì)印跡（Western blotting）實(shí)驗(yàn)檢測細(xì)胞中PCNA、MMP-2和MMP-9的表達(dá) 以0.25%胰蛋白酶消化并收集轉(zhuǎn)染48 h后各組U2-OS細(xì)胞，以適量RIPA裂解液在冰上裂解細(xì)胞，抽提總蛋白，BCA法測定蛋白濃度，制備SDS-PAGE，行電泳分離蛋白，使用半干法將蛋白電轉(zhuǎn)至PVDF 膜上，在5%脫脂奶粉中封閉2 h，將膜放置在含一抗的溶液中進(jìn)行雜交，其中PCNA、MMP-2和MMP-9一抗均為1∶500稀釋，4 ℃冰箱搖床孵育過夜，洗膜后將膜放置1∶3 000稀釋的二抗溶液中，室溫孵育2 h，通過ECL發(fā)光顯影，采集圖像，分析各條帶灰度值，分別計(jì)算細(xì)胞中PCNA、MMP-2和MMP-9的表達(dá)水平。

1.11 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法 采用SPSS 21.0 統(tǒng)計(jì)軟件分析實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)，以上實(shí)驗(yàn)至少重復(fù)3 次，計(jì)量資料以均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差（）表示，兩組間比較采用t檢驗(yàn)，多組間比較采用單因素方差分析，組間兩兩比較采用SNK-q檢驗(yàn)，以P＜0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 NCRNA00173 和miR-765 在骨肉瘤細(xì)胞中的表達(dá) 與成骨細(xì)胞hFOB1.19 相比，骨肉瘤細(xì)胞株U2-OS、Saos-2、SJSA-1 和SOSP-9607 中NCRNA 00173 的表達(dá)明顯下調(diào)（P＜0.05），而miR-765 的表達(dá)明顯上調(diào)（P＜0.05），見表1。由于NCRNA00173在U2-OS 細(xì)胞中下調(diào)最明顯，因此后續(xù)實(shí)驗(yàn)以U2-OS細(xì)胞為實(shí)驗(yàn)細(xì)胞株。

表1 NCRNA00173和miR-765在各細(xì)胞株中的表達(dá)水平比較

表1 NCRNA00173和miR-765在各細(xì)胞株中的表達(dá)水平比較

與hFOB1.19細(xì)胞比較，*P＜0.05。

2.2 檢測NCRNA00173 過表達(dá)轉(zhuǎn)染效果 與Con組和pcDNA 組比較，NCRNA00173 組U2-OS 細(xì)胞中NCRNA00173 的表達(dá)水平顯著升高（P＜0.05）；與Con組相比，pcDNA組中NCRNA00173的表達(dá)水平無明顯改變（P＞0.05），見表2。

表2 各組U2-OS 細(xì)胞中NCRNA00173 和miR-765 表達(dá)水平比較

表2 各組U2-OS 細(xì)胞中NCRNA00173 和miR-765 表達(dá)水平比較

與Con組比較，*P＜0.05；與pcDNA組比較，&P＜0.05。

2.3 NCRNA00173 和miR-765 靶向關(guān)系驗(yàn)證 生物信息學(xué)軟件Starbase 預(yù)測結(jié)果發(fā)現(xiàn)，NCRNA 00173和miR-765間具有特異性互補(bǔ)結(jié)合位點(diǎn)；雙熒光素酶報(bào)告基因?qū)嶒?yàn)結(jié)果發(fā)現(xiàn)，與miR-NC組相比，miR-765 組NCRNA00173-Wt 細(xì)胞的相對熒光素酶活性顯著降低（P＜0.05），而NCRNA00173-Mut 細(xì)胞的相對熒光素酶活性無顯著變化（P＞0.05），見圖1和表3。

表3 雙熒光素酶報(bào)告基因?qū)嶒?yàn)檢測細(xì)胞的相對熒光素酶活性

表3 雙熒光素酶報(bào)告基因?qū)嶒?yàn)檢測細(xì)胞的相對熒光素酶活性

與miR-NC組比較，*P＜0.05。

圖1 生物信息學(xué)預(yù)測NCRNA00173 和miR-765 的結(jié)合位點(diǎn)示意圖

2.4 過表達(dá)NCRNA00173 對U2-OS 細(xì)胞增殖的影響 與Con 組和pcDNA 組相比，NCRNA00173 組U2-OS 細(xì)胞OD 值從48 h 開始顯著降低（P＜0.05），克隆形成細(xì)胞數(shù)明顯減少（P＜0.05）；與Con 組相比，pcDNA組克隆形成細(xì)胞數(shù)及細(xì)胞OD值在24 h、48 h 和72 h 時均無明顯改變（P＞0.05），見表4 和圖2。

表4 各組U2-OS細(xì)胞增殖能力（OD值）和克隆形成能力比較

表4 各組U2-OS細(xì)胞增殖能力（OD值）和克隆形成能力比較

與Con組比較，*P＜0.05；與pcDNA組比較，&P＜0.05。

圖2 克隆形成實(shí)驗(yàn)檢測24 h各組U2-OS細(xì)胞克隆形成能力

2.5 過表達(dá)NCRNA00173 對U2-OS 細(xì)胞遷移和侵襲的影響 與Con 組和pcDNA 組相比，NCRNA 00173組U2-OS細(xì)胞遷移和侵襲數(shù)均顯著減少（P＜0.05），劃痕愈合率明顯降低（P＜0.05）；與Con 組相比，pcDNA組劃痕愈合率遷移和侵襲細(xì)胞數(shù)均無明顯改變（P＞0.05），見圖3和表5。

圖3 各組細(xì)胞遷移和侵襲能力

表5 各組U2-OS細(xì)胞遷移和侵襲細(xì)胞數(shù)比較

表5 各組U2-OS細(xì)胞遷移和侵襲細(xì)胞數(shù)比較

與Con組比較，*P＜0.05；與pcDNA組比較，&P＜0.05。

2.5 過表達(dá)NCRNA00173對U2-OS細(xì)胞中PCNA、MMP-2和MMP-9表達(dá)的影響 與Con組和pcDNA組相 比，NCRNA00173 組U2-OS 細(xì)胞中PCNA、MMP-2 和MMP-9 的表達(dá)水平均顯著降低（P＜0.05）；與Con 組相比，pcDNA 組PCNA、MMP-2 和MMP-9的表達(dá)均無明顯改變（P＞0.05），見圖4和表6。

圖4 各組U2-OS細(xì)胞中PCNA、MMP-2和MMP-9的表達(dá)

表6 各組U2-OS 細(xì)胞中PCNA、MMP-2 和MMP-9 的表達(dá)水平比較

表6 各組U2-OS 細(xì)胞中PCNA、MMP-2 和MMP-9 的表達(dá)水平比較

與Con組比較，*P＜0.05；與pcDNA組比較，&P＜0.05。

3 討論

越來越多的研究表明，lncRNA 在調(diào)節(jié)癌癥生長和遷移中起著關(guān)鍵作用，這增加了我們對幾種疾病，尤其是惡性腫瘤的生物學(xué)行為的了解[10-11]。先前的證據(jù)表明lncRNA是包括骨肉瘤在內(nèi)的多種腫瘤治療靶標(biāo)和有價值的生物標(biāo)志物。例如，lncRNA CBR3-AS1 在調(diào)節(jié)骨肉瘤細(xì)胞的增殖、遷移、侵襲和凋亡中起著致癌作用，并且是骨肉瘤患者的一個獨(dú)立的不良預(yù)后因素[12]。lncRNA HIF2PUT 的過表達(dá)通過下調(diào)HIF-2α 抑制骨肉瘤干細(xì)胞的球形形成，并且顯著抑制了骨肉瘤干細(xì)胞的增殖、遷移和侵襲能力，這些發(fā)現(xiàn)表明，lncRNA HIF2PUT可能是治療骨肉瘤的新靶點(diǎn)[13]。lncRNA HIF1A-AS2 在骨肉瘤中表達(dá)上調(diào)，且其過表達(dá)可通過調(diào)節(jié)miR-129-5p促進(jìn)骨肉瘤細(xì)胞的增殖、細(xì)胞周期進(jìn)程和侵襲，這些結(jié)果表明，HIF1A-AS2 可能是骨肉瘤的潛在治療靶標(biāo)[14]。NCRNA00173 作為一種新的lncRNA，在肝癌中表達(dá)下調(diào)，提示包括NCRNA00173在內(nèi)的lncRNA 可能提供新穎的分子生物標(biāo)志物，并為對抗肝癌病例的轉(zhuǎn)移提供新的基礎(chǔ)[8]。近期研究顯示，NCRNA00173 在骨肉瘤組織中表達(dá)下調(diào)，且與患者的腫瘤分期、遠(yuǎn)處轉(zhuǎn)移等密切相關(guān)[9]。但是，骨肉瘤和NCRNA00173之間的關(guān)系尚未見相關(guān)報(bào)道。本實(shí)驗(yàn)首次對NCRNA00173 在骨肉瘤中的功能進(jìn)行了探究。本研究中首先檢測了NCRNA 00173在骨肉瘤細(xì)胞中的表達(dá)情況，結(jié)果顯示，與成骨細(xì)胞hFOB1.19 相比，骨肉瘤細(xì)胞中NCRNA 00173的表達(dá)下調(diào)（P＜0.05），提示NCRNA00173在骨肉瘤中可能發(fā)揮調(diào)控作用。

先前的研究表明，lncRNA 通過充當(dāng)miRNA 的“海綿”而在調(diào)節(jié)生物細(xì)胞過程中發(fā)揮關(guān)鍵作用[15-16]。為探究NCRNA00173在骨肉瘤細(xì)胞中的功能，本研究初步證實(shí)NCRNA00173可靶向結(jié)合miR-765。已發(fā)現(xiàn)miR-765 在人類某些癌癥中具有不同的作用。miR-765對舌鱗狀細(xì)胞癌的細(xì)胞增殖和侵襲具有抑制作用[17]。相反，miR-765 通過抑制人肝癌中的INPP4B促進(jìn)細(xì)胞增殖[18]。近期Lv等[19]研究顯示，miR-765 的表達(dá)在骨肉瘤組織中顯著增加，miR-765 的上調(diào)促進(jìn)了骨肉瘤中的細(xì)胞增殖、遷移和侵襲。Linc00511 過表達(dá)通過下調(diào)miR-765 促進(jìn)了骨肉瘤MG-63 細(xì)胞的增殖、集落形成和遷移[20]。本研究中觀察到miR-765在骨肉瘤細(xì)胞中表達(dá)上調(diào)（P＜0.05），提示NCRNA00173 可能通過負(fù)向調(diào)控miR-765的表達(dá)而參與骨肉瘤發(fā)生及發(fā)展過程。

隨后本實(shí)驗(yàn)進(jìn)一步研究了其在骨肉瘤細(xì)胞系中的功能。功能實(shí)驗(yàn)顯示，外源性高表達(dá)NCRNA 00173 抑制了骨肉瘤細(xì)胞的增殖、遷移和侵襲（P＜0.05）。此外，本研究結(jié)果顯示，過表達(dá)NCRNA 00173 能夠有效抑制增殖相關(guān)蛋白PCNA 的表達(dá)（P＜0.05）。PCNA 參與DNA 代謝的各種過程，包括DNA復(fù)制和修復(fù)，染色質(zhì)組織和轉(zhuǎn)錄以及姐妹染色單體凝聚。另外，PCNA參與細(xì)胞存活，是細(xì)胞處于增殖狀態(tài)的標(biāo)志分子。MMP-2和MMP-9參與正常生理過程以及疾病過程（例如癌癥轉(zhuǎn)移）中細(xì)胞外基質(zhì)的分解。本研究結(jié)果發(fā)現(xiàn)，過表達(dá)NCRNA 00173抑制MMP-2和MMP-9的表達(dá)（P＜0.05）。以上這些結(jié)果提示，過表達(dá)NCRNA00173可能通過抑制PCNA、MMP-2 和MMP-9 的表達(dá)阻礙骨肉瘤細(xì)胞的增殖、侵襲和遷移。在臨床環(huán)境中，抑制NCRNA00173 表達(dá)可能是治愈骨肉瘤的一種治療策略。但需要更多的研究來解釋NCRNA 00173 在骨肉瘤發(fā)展中的分子機(jī)制。

綜上，下調(diào)表達(dá)的NCRNA00173在骨肉瘤中起抑癌基因的作用，并通過調(diào)節(jié)miR-765 的表達(dá)抑制骨肉瘤的發(fā)生，這表明NCRNA00173可能是骨肉瘤的潛在治療靶點(diǎn)。