癌痛消方對(duì)肝癌大鼠癌痛的調(diào)控作用機(jī)制研究*

劉 軍，杜寶昌，郭 茜，肖芳芳,武振明,齊秀恒

（河北中石油中心醫(yī)院腫瘤科，廊坊 065000）

臨床中晚期癌癥患者最常見的癥狀之一為癌痛，超過半數(shù)的癌癥患者存在無法忍受和控制的劇烈疼痛，雖然嗎啡等阿片類藥物能夠有效緩解癌痛，但是長期使用阿片類藥物可能會(huì)出現(xiàn)胃腸道反應(yīng)和伴隨成癮性等副作用，因此如何緩解疼痛成為了臨床研究的一個(gè)難題[1-2]。癌痛為與神經(jīng)病理性疼痛機(jī)制和炎癥痛相關(guān)的慢性疼痛，因此對(duì)其展開研究以適當(dāng)?shù)膭?dòng)物模型入手是十分合適的。癌痛消方是以傳統(tǒng)的“膈下逐瘀湯”為基礎(chǔ)，加用半枝蓮、元胡、白花蛇舌草、絞股藍(lán)、黃芪、莪術(shù)、三棱等藥物制備而來，可化瘀解散、清熱解毒、行氣止痛、健脾益氣，且經(jīng)濟(jì)實(shí)惠，便于攜帶和使用[3-4]。抑制NF-kB蛋白的表達(dá)能夠緩解神經(jīng)損傷所致的疼痛和炎癥反應(yīng)，這在既往研究中已有報(bào)道，有學(xué)者指出NF-kB 蛋白能夠減少癌痛大鼠的痛覺過敏，抑制脊髓小膠質(zhì)細(xì)胞激活[5]。而在已經(jīng)發(fā)現(xiàn)的TLRs 中，TLR2和TLR4所識(shí)別的配體最多，不僅能夠與相關(guān)配體結(jié)合，還能夠與負(fù)責(zé)特異區(qū)別配體的內(nèi)源性巨噬細(xì)胞蛋白結(jié)合，增加配體結(jié)合靶位，介導(dǎo)和活化相關(guān)因子，介導(dǎo)疼痛通路。SIGIRR 蛋白激活可對(duì)TLR4-NF-kB 轉(zhuǎn)導(dǎo)信負(fù)調(diào)控，進(jìn)而調(diào)節(jié)該信號(hào)通路終端NF-kB水平，緩解鎮(zhèn)痛。因此，本研究選取NFkB、SIGIRR、TLR2、TLR4 作為檢測(cè)指標(biāo)，就癌痛消方對(duì)大鼠癌痛的調(diào)控作用機(jī)制進(jìn)行了研究，以期為今后臨床干預(yù)提供參考。

1 材料與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物

采用肝臟左葉表面注射walker256 細(xì)胞成功構(gòu)造原發(fā)性肝癌SD 大鼠模型。SD 大鼠雌雄各半，均為4～5 周齡，體質(zhì)量為13～17 g，平均（15.72±1.21）g。所有大鼠均購自中國醫(yī)學(xué)科學(xué)院醫(yī)學(xué)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物研究所，許可證號(hào)：SYXK（京）2020-1134。所有大鼠均標(biāo)準(zhǔn)飼養(yǎng)，設(shè)置溫度（21±2）℃，濕度為40%～60%，每12 h光暗交替，每5 min換氣通風(fēng)1次。

1.2 藥品、主要試劑及儀器

超凈工作臺(tái)（上海凈化設(shè)備廠產(chǎn)品），TGL-16M臺(tái)式高速冷凍離心機(jī)（濟(jì)南博鑫生物技術(shù)有限公司），負(fù)80度超低溫冰箱（北京天地精儀科技有限公司），半自動(dòng)石錯(cuò)切片機(jī)（leikacm3050s 德國），包埋機(jī)（LS-100+沈陽市龍首電子儀器有限公司），高速冷凍離心機(jī)（GL21M 上虞市博盛生物科技有限公司），普通光學(xué)顯微鏡（SZ51奧林巴斯日本），日立全自動(dòng)生化分析儀（LABOSPECT008日本）。

NF-kB 蛋白、SIGIRR 蛋白、TLR2、TLR4mRNA試劑盒由武漢博士得生物公司購入；鼠兔通用一抗試劑盒、二抗試劑盒、二氨基聯(lián)苯胺（3,3’-diaminobenzidine,DAB）顯色試劑盒、無水乙醇、甘氨酸、冰乙酸、甲醇、10 μl/200 μl/1 000 μl 進(jìn)口吸頭AXYGEN、離心管（盒）、PCR管盒、乳膠手套、PE手套，一次性滴管、燒杯均由南寧市博仁實(shí)驗(yàn)用品經(jīng)營部購入。

1.3 動(dòng)物分組及造模

參照文獻(xiàn)[6]的方法進(jìn)行造模，造模前大鼠禁食禁水12 h，依據(jù)2.3 mg/kg 的劑量給予2%戊巴比妥鈉腹腔注射麻醉，成功麻醉后取仰臥位，使用橡皮筋將四肢和上肢固定在實(shí)驗(yàn)手術(shù)板上。采用沐浴露混合液潤濕皮毛，將部分體毛使用剃須刀刮取，暴露腹部，對(duì)手術(shù)區(qū)域進(jìn)行常規(guī)消毒，將腹部正中線0.5右側(cè)旁逐層剪開2 cm，暴露腹腔，將肝左外葉托出，注射walker256 細(xì)胞懸液，注射后觀察若無活動(dòng)性出血?jiǎng)t輕送肝臟還納腹腔，確認(rèn)無異物殘留后，使用無菌可吸收線逐層縫合關(guān)腹。

采用肝臟左葉表面注射walker256 細(xì)胞成功構(gòu)造60只原發(fā)性肝癌SD大鼠模型，分為3組，癌痛消方低劑量組（0.5 g/mL），癌痛消方中劑量組（1g/mL）和癌痛消方高劑量組（2 g/mL），每組20只。并選取20只健康SD大鼠作為對(duì)照組（Control組）。Control組每日1次使用2 mL蒸餾水灌胃，劑量組大鼠每日1次給予2 mL濃度為0.5 g/mL、1 g/mL、2 g/mL的癌痛消方灌胃。

1.4 癌痛消方

癌痛消方：30 g 白花蛇舌草，30 g 赤芍藥，20 g黃芪，15 g半枝蓮，12 g絞股藍(lán)，10 g延胡索，10 g三棱，10 g香附，10 g莪術(shù)，10 g烏藥，10 g甘草，6 g紅花。由廣西中醫(yī)藥大學(xué)附屬百年樂藥廠制備，每包15 g。

1.5 Western blotting實(shí)驗(yàn)檢測(cè)NF-kB、SIGIRR蛋白的表達(dá)水平

采用斷頭法處死大鼠，取脊髓L4～L6 段稱重，并加入80 g/L的裂解液，使用液氮研磨，加入PMSF蛋白酶抑制劑，冰上裂解。使用勻漿機(jī)勻漿20 s，靜置30 min，以12 000 r/min 的速率離心20 min（半徑15 cm，溫度4 ℃），取上清液，加入EP管內(nèi)，-20 ℃保存待測(cè)。采用Western blotting 印跡法對(duì)NF-kB、SIGIRR蛋白表達(dá)進(jìn)行檢測(cè)。

1.6 RT-PCT 實(shí)驗(yàn)檢測(cè)TLR2、TLR4 mRNA 的表達(dá)量

采用斷頭法處死大鼠，取0.1 g脊髓L4～L6段，加入1 mL 的Trizol Reagent，采用電動(dòng)勻漿機(jī)高速低溫勻漿20 s，靜置后，于1 mL的Trizol試劑內(nèi)加入0.2 mL的氯仿，劇烈振蕩搖勻后，室溫下靜置2 min，以12 000 r/min的速率離心15 min（半徑15 cm，溫度4 ℃），取400 μL 移至EP 管內(nèi)，加入等體積異丙醇，搖勻冰浴15 min，以12 000 r/min的速率離心10 min（半徑15 cm，溫度4 ℃），棄上清液，倒置在消毒濾紙上，將異丙醇吸干，使用75%乙醇洗滌沉淀，以 7 500 r/min的速率離心5 min（半徑15 cm，溫度4 ℃），棄上清液，風(fēng)干5 min 后溶于DEPC 水備用。使用RT-PCT 半定量檢測(cè)TLR2 和TLR4 mRNA 表達(dá)情況。

1.7 流式細(xì)胞儀檢測(cè)細(xì)胞周期和凋亡情況

取1 000 mg 新鮮癌灶組織，置于平皿內(nèi)，加少量PBS，剪為勻漿，加少量PBS，使用吸管吸取勻漿，以尼龍網(wǎng)（100 目）過濾，以1 500 r/min 的速率離心3 min（半徑10 cm），PBS洗3次，以500 r/min的速率離心3 min（半徑10 cm），去除細(xì)胞碎片，以尼龍網(wǎng)（300目）過濾細(xì)胞團(tuán)塊，分置兩管內(nèi)，調(diào)整細(xì)胞濃度為1×106/mL，置于4 ℃冰箱內(nèi)保存待測(cè)。采用Annexin V/PI 雙染色法染色細(xì)胞，用上流式細(xì)胞儀檢測(cè)，CellQuest軟件分析，計(jì)算細(xì)胞周期和凋亡率。

1.8 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法

采用SPSS 18.0 統(tǒng)計(jì)軟件進(jìn)行數(shù)據(jù)分析，計(jì)量資料以均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差()表示，兩組均數(shù)比較采用t檢驗(yàn)，多重比較采用dunnett’st檢驗(yàn)。以P＜0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 各組大鼠不同時(shí)刻的NF-kB、SIGIRR 蛋白表達(dá)水平比較

Western blotting 實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，不同時(shí)刻（5 d、10 d、15 d）不同濃度（0.5 g/mL、1.0 g/mL、2.0 g/mL）組NF-kB 蛋白的表達(dá)水平均低于Control 組（P＜0.05），且癌痛消方的濃度越大，NF-kB 蛋白的表達(dá)水平越低，見圖1A；不同時(shí)刻（5 d、10 d、15 d）不同濃度（0.5 g/mL、1.0 g/mL、2.0 g/mL）組SIGIRR蛋白的表達(dá)水平均高于Control 組（P＜0.05），且癌痛消方的濃度越大，SIGIRR 蛋白的表達(dá)水平越高，見圖1B。

圖1 各組大鼠不同時(shí)刻的NF-kB和SIGIRR蛋白表達(dá)水平比較

2.2 各組大鼠不同時(shí)刻的TLR2、TLR4 mRNA表達(dá)水平比較

RT-PCT 實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，不同時(shí)刻（5 d、10 d、15 d）不同濃度（0.5 g/mL、1.0 g/mL、2.0 g/mL）組TLR2、TLR4mRNA 的表達(dá)水平均低于Control 組（P＜0.05），且癌痛消方的濃度越大，TLR2、TLR4 mRNA的表達(dá)水平越低，見圖2。

圖2 各組大鼠不同時(shí)刻的TLR2和TLR4 mRNA表達(dá)水平比較

2.3 各組大鼠不同時(shí)刻的細(xì)胞周期比較

流式細(xì)胞儀檢測(cè)結(jié)果顯示，不同時(shí)刻（5 d、10 d、15 d）不同濃度（0.5 g/mL、1.0 g/mL、2.0 g/mL）組G0/G1 期細(xì)胞比例均高于Control 組（P＜0.05），且癌痛消方的濃度越大，G0/G1期細(xì)胞比例越高，見圖3A；但S期、G2期細(xì)胞比例均低于Control組（P＜0.05），癌痛消方的濃度越大，S期、G2期細(xì)胞比例越低，見圖3B-C。

圖3 各組大鼠不同時(shí)刻的細(xì)胞周期比較

2.4 各組大鼠不同時(shí)刻的細(xì)胞凋亡率比較

流式細(xì)胞儀檢測(cè)結(jié)果顯示，不同時(shí)刻（5 d、10 d、15 d）不同濃度（0.5 g/mL、1.0 g/mL、2.0 g/mL）組細(xì)胞凋亡率均高于對(duì)照組（P＜0.05），且癌痛消方的濃度越大，細(xì)胞凋亡率越高，見圖4。

表4 各組大鼠不同時(shí)刻的細(xì)胞凋亡率比較

3 討論

癌癥患者病情進(jìn)展中最常見的癥狀之一為癌性疼痛，簡(jiǎn)稱癌痛，癌痛為癌癥患者普遍存在的癥狀，部分患者為間斷性疼痛，多數(shù)患者為持續(xù)性疼痛，且持續(xù)時(shí)間長達(dá)每日12 h以上，約2/3的癌痛患者為內(nèi)臟痛，近一半的患者為混合型疼痛，新發(fā)癌癥患者癌痛發(fā)生率約25%，晚期和復(fù)診患者則可高達(dá)80%[7]。雖然臨床中對(duì)于癌痛的護(hù)理和治療在逐步完善，但仍有50%～80%的癌痛患者無法得到晚期緩解，對(duì)患者的心理狀況常有嚴(yán)重影響，影響治療依從性和臨床療效[8]。

目前臨床上癌痛的藥物治療以“非甾體類”和”阿片類”藥物及神經(jīng)阻滯鎮(zhèn)痛治療等方法為主[9-10]。且在既往對(duì)癌癥患者的研究中可發(fā)現(xiàn)，隨著癌細(xì)胞活化，各類致炎細(xì)胞因子釋放量增加，有學(xué)者指出致炎細(xì)胞因子在癌痛的發(fā)展中也有重要作用[11]。本研究中發(fā)現(xiàn)癌痛消方可通過抑制SIGIRR 進(jìn)而對(duì)TLR-NF-kB 途徑產(chǎn)生抑制作用，降低了NF-kB、TLR2和TLR4的表達(dá)，進(jìn)而激活轉(zhuǎn)錄因子NF-kB的轉(zhuǎn)錄，以達(dá)到抑制趨化因子、致炎因子、細(xì)胞因子等多種炎癥介質(zhì)釋放的效果，而炎癥因子會(huì)影響和放大脊髓對(duì)傷害性刺激的感受，造成痛覺過敏，誘發(fā)患者出現(xiàn)癌痛癥狀，因此NF-kB、TLR2 和TLR4 表達(dá)的降低，說明癌痛消方可通過改善炎癥反應(yīng)，緩解癌痛。提示癌痛消方能夠抑制急性期蛋白的產(chǎn)生，抑制B 細(xì)胞和T 細(xì)胞的分化，影響適應(yīng)性免疫，減少巨噬細(xì)胞急性期蛋白的產(chǎn)生，抑制局部炎癥反應(yīng)，激活內(nèi)皮細(xì)胞，減少各類因子與神經(jīng)元上相應(yīng)受體的結(jié)合，抑制神經(jīng)元的激活，進(jìn)而緩解外周神經(jīng)的痛覺敏化[12]。同時(shí)，本研究結(jié)果顯示，癌痛消方可使癌細(xì)胞停留于細(xì)胞周期的G0/G1期，阻止其進(jìn)入S 期，抑制和阻斷脫氧核糖核酸（deoxyribonucleic acid,DNA）的合成，達(dá)到促進(jìn)凋亡的目的，緩解癌痛的發(fā)生。

分析本文結(jié)果產(chǎn)生的原因，主要是由于使用率癌痛消方，方中白花蛇舌草歸胃、大腸、肝、小腸經(jīng)，可消散癰腫、清熱解毒、利濕通淋，主治內(nèi)癰腹痛、瘡瘍腫毒等[13]；黨參性甘平，可補(bǔ)中益氣、養(yǎng)血生津，是臨床常用的治療脾肺氣虛之證的藥物[14]；半枝蓮味辛苦，性寒，可清熱解毒、活血化瘀、利水消腫，可治熱毒瘡癰、大腹水腫等[15]；莪術(shù)味辛散苦泄，性溫通，可破血行氣、消積止痛，三棱味苦辛，性平，破血之力強(qiáng)，二者常用于治療血瘀氣滯或癥瘕積聚所致腹痛、腹脹[16-17]；絞股藍(lán)味苦甘性寒，可健脾益氣、理氣除濕、活血生津、清熱解毒，主治脾虛痰濁阻絡(luò)熱毒之證[18]；赤芍味苦性寒，可清熱解毒、祛瘀止痛、清瀉肝火，主治癥瘕積聚、血熱之斑疹[19]；延胡索味辛散苦泄，性溫通，可活血行氣止痛，能治血瘀氣滯諸痛[20]；烏藥味辛性溫通，可疏離胸腹之氣，主治寒凝氣滯、陽虛腹痛之證[21]；黃芪味甘性溫，可升舉陽氣、補(bǔ)益脾肺之氣[22]；香附味辛甘微苦，性平，可疏肝理氣、調(diào)和氣血、調(diào)經(jīng)止痛，主治肝郁氣滯諸痛[23]；枳實(shí)味辛苦，性微寒，可補(bǔ)中益氣、行滯降泄，可治食積氣滯，脘腹痞滿證；甘草味甘性平，可補(bǔ)脾潤肺、解毒緩急[24]。因此，癌痛消方全方配伍精當(dāng)，組方嚴(yán)謹(jǐn)，可健脾益氣、抗癌解毒、化瘀散結(jié)，可通過抑制可能與TLR-NF-kB 通道，促進(jìn)肝癌細(xì)胞的凋亡，抑制炎癥反應(yīng)，發(fā)揮較佳的癌痛控制效果[25]。

綜上所述，癌痛消方能夠促使肝癌細(xì)胞凋亡，降低炎癥介質(zhì)釋放，控制癌痛，且以中、高劑量作用明顯，隨著用藥時(shí)間的延長，療效也有一定增強(qiáng)，其機(jī)理可能與TLR-NF-kB通道的抑制有關(guān)。