基于Klotho/FGF23通路探討天麻鉤藤飲對大鼠靜脈橋血管氧化應(yīng)激及內(nèi)膜增生的影響*

王建民，孟 蓓，王勝利，辛利軍

（河北以嶺醫(yī)院血管外科，石家莊 050000）

冠心病是常見的心血管疾病，近年來，其發(fā)病率不斷升高且呈年輕化趨勢[1]。冠狀動脈旁路移植術(shù)（coronary artery bypass grafting，CABG）是該病治療的主要方法，能有效改善患者預(yù)后[2]。大隱靜脈（great saphenous vein，GSV）是CABG的常用移植血管，具有來源豐富、易獲取、無排斥反應(yīng)等優(yōu)點[3]。然而，GSV與動脈吻合后因血管內(nèi)皮細(xì)胞氧化應(yīng)激損傷引起血管內(nèi)膜增生，進(jìn)而引起靜脈橋血管再狹窄，導(dǎo)致遠(yuǎn)期閉塞率較高，嚴(yán)重影響CABG 遠(yuǎn)期療效[4]。因此，如何減少靜脈橋血管內(nèi)膜增生是目前使用CABG 治療亟需解決的問題。Klotho/成纖維細(xì)胞生長因子23（fibroblast growth factor 23，F(xiàn)GF23）是參與高血壓發(fā)生發(fā)展及動脈硬化進(jìn)展的常見通路，且Klotho、FGF23分別為慢性腎臟病患者頸動脈內(nèi)膜、中膜厚度增厚的保護(hù)和危險因子[5-6]。天麻鉤藤飲是治療原發(fā)性高血壓疾病的經(jīng)典中草藥方劑，研究表明，其作用機(jī)制與抑制氧化應(yīng)激、維護(hù)血管內(nèi)皮系統(tǒng)功能有關(guān)[7-8]。但天麻鉤藤飲對靜脈橋血管內(nèi)膜增生的影響鮮有研究。本研究通過建立大鼠自體靜脈移植模型，基于Klotho/FGF23通路探討天麻鉤藤飲對大鼠靜脈橋血管氧化應(yīng)激及內(nèi)膜增生的影響。

1 材料與方法

1.1 實驗動物 SPF 級雄性SD 大鼠，體重200～250 g，購于上海茂生衍生物科技有限公司，動物生產(chǎn)許可證號：SCXK（滬）2017-0004，于SPF級動物房中飼養(yǎng)，濕度50%～60%，溫度20～25 ℃，光照12 h明/12 h 暗，自由攝食、飲水。本研究經(jīng)河北以嶺醫(yī)院動物倫理委員會審核批準(zhǔn)（審批號：201610201）

1.2 藥品 天麻鉤藤飲配制[9]：天麻9 g，鉤藤（后下）12 g，生石決明（先煎）18 g，山梔9 g，黃芩9 g，川牛膝12 g，杜仲9 g，益母草9 g，桑寄生9 g，夜交藤9 g，朱茯神9 g。以上藥物經(jīng)河北以嶺醫(yī)院中藥房鑒定均為正品，加水煎煮濃縮為1 g/mL 藥液，4 ℃保存?zhèn)溆谩?/p>

1.3 主要試劑與儀器 Klotho 陰性對照（NC）、Klotho 小干擾RNA（siRNA）序列及Klotho、FGF23、GAPDH 引物由北京賽百盛基因技術(shù)有限公司合成；實時熒光定量PCR（qRT-PCR）試劑盒購自美國Promega 公司；蘇木精—伊紅（HE）染色試劑盒購自南京建成生物技術(shù)有限公司；谷胱甘肽過氧化物酶（GSH-Px）檢測試劑盒、丙二醛（MDA）酶聯(lián)免疫吸附試驗（ELISA）檢測試劑盒均購自上海一研生物科技有限公司；RIPA裂解液、BCA蛋白濃度測定試劑盒購自上海碧云天生物科技公司；Klotho 抗體、FGF23 抗體、增殖細(xì)胞核抗原（PCNA）抗體、GAPDH 抗體、羊抗兔lgG 購自Abcam 公司。顯微鏡（型號：ⅣC TK-870E）購自日本Olympus 公司；熒光定量PCR 儀（ABI 7500）為美國Applied Biosystems 公司產(chǎn)品；酶標(biāo)儀（型號：SynergyH 1）購自美國BioTek公司；凝膠成像系統(tǒng)（型號：AlphaImager Mini）購自美國Protein Simple公司。

1.4 大鼠自體靜脈移植模型建立[10]大鼠術(shù)前禁食8 h，腹腔注射10%水合氯醛（300 mg/kg）進(jìn)行麻醉。尾靜脈注射200 U/kg肝素鈉，在頸部正中切開皮膚約2 cm，找到并分離右側(cè)頸外靜脈，結(jié)扎其屬支，切取0.8～1.0 cm 遠(yuǎn)心端主干，用肝素鈉鹽水沖洗并浸泡在罌粟堿溶液中備用。于右側(cè)氣管旁、胸鎖乳突肌下游離右頸總動脈至交叉處，期間用罌粟堿稀釋液噴灑動脈血管表面。動脈兩端用無損傷血管夾阻斷兩側(cè)血流，切除中間動脈約0.5 cm，用肝素鈉鹽水沖洗血管腔。利用“cuff”套管技術(shù)吻合頸外靜脈與頸總動脈，開放血管夾，觀察到有力的血流搏動感即為自體靜脈移植模型建立成功。洗滌手術(shù)區(qū)域，依次縫合肌肉、皮下組織及皮膚，術(shù)畢當(dāng)天肌注40萬U/kg青霉素抗感染。

1.5 動物分組及給藥 將造模成功的48 只SD 大鼠隨機(jī)分為模型對照組、天麻鉤藤飲組、通路對照組和通路干預(yù)組，每組12只。參照成人天麻鉤藤飲用量計算大鼠等效劑量（114 g/60 kg）×6.3≈12 g/kg[9]。天麻鉤藤飲組、通路對照組和通路干預(yù)組大鼠每日給予天麻鉤藤飲12 mL/kg灌胃，通路對照組和通路干預(yù)組大鼠每日給予Klotho NC（0.38 OD/mL）、Klotho siRNA（0.4 OD/mL）100 μL 尾靜脈注射，模型對照組灌胃等量蒸餾水，1 次/d，連續(xù)給藥28 d。

1.6 標(biāo)本采集與處理 每組分別于術(shù)后2 周、4 周各隨機(jī)取6只大鼠的移植靜脈橋血管，沖洗干凈，一部分血管組織固定于4%多聚甲醛，另一部分置于液氮中保存。

1.7 HE染色觀察各組大鼠靜脈橋血管病理形態(tài)及內(nèi)膜增生情況 取4%多聚甲醛固定24 h 后的靜脈橋血管組織，常規(guī)脫水、透明、浸蠟、包埋，制成5 μm厚切片，行HE 染色。顯微鏡下觀察大鼠靜脈橋血管病理形態(tài)。使用Image-ProPlus 6.0軟件測量中段橫截面的新生內(nèi)膜厚度，取平均值。

1.8 qRT-PCR法檢測大鼠靜脈橋血管組織Klotho、FGF23 mRNA表達(dá)水平 取靜脈橋血管，冰上制備勻漿，TRIzol 法提取總RNA，逆轉(zhuǎn)錄為cDNA，在熒光定量PCR儀上進(jìn)行PCR擴(kuò)增，采用2-ΔΔCt法計算目的基因相對表達(dá)量。PCR 反應(yīng)條件：95 ℃預(yù)變性3 min；95 ℃變性30 s，60 ℃延伸40 s，共40 個循環(huán)。引物序列如下：Klotho 上游：5’-TGATGTAGGCTGGCTGGCAGAG-3’，下游：5’-TGGTGGTGTAATGGCTCAACGC-3’；FGF23上游：5’-ATCAGAGGATGCTGGCTCCGTAG-3’，下游：5’-TAGCCGTTCTCTAGCGTCCACTG-3’；GAPDH 上游：5’-CGTTGACATCCGTAAAGACCTC-3’，下游：5’-TAGGAGCCAGGGCAGTAATCT-3’。

1.9 ELISA 法檢測大鼠靜脈橋血管中GSH-Px 活性、MDA含量 取靜脈橋血管勻漿，離心，取上清，按照ELISA試劑盒說明書進(jìn)行操作，測定樣本與標(biāo)準(zhǔn)品在酶標(biāo)儀450 nm波長處的吸光度，繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線，計算靜脈橋血管中GSH-Px活性和MDA含量。

1.10 Western blotting 法檢測大鼠靜脈橋血管中Klotho、FGF23、PCNA 蛋白表達(dá) 提取靜脈橋血管組織蛋白，BCA法測定蛋白濃度。取適量蛋白進(jìn)行10%SDS-聚丙酰胺凝膠電泳，濕轉(zhuǎn)法轉(zhuǎn)至聚偏氟乙烯膜上，分離目標(biāo)條帶，用5%脫脂奶粉封閉60 min，加入一抗（Klotho、FGF23、PCNA、GAPDH，均1∶600稀釋）4 ℃孵育過夜，TBST洗滌，加入二抗（1∶2 000稀釋）室溫孵育1 h，TBST 洗滌；ECL 發(fā)光，成像儀中顯影、拍照，Image J軟件進(jìn)行條帶灰度值分析，以目的蛋白條帶灰度值與內(nèi)參蛋白條帶灰度值的比值為目的蛋白表達(dá)量。

1.11 統(tǒng)計學(xué)方法 采用SPSS 19.0 軟件進(jìn)行數(shù)據(jù)分析，計量資料以均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差（）表示，多組間比較用單因素方差分析，進(jìn)一步兩兩比較采用SNK-q檢驗，以P＜0.05為差異有統(tǒng)計學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 大鼠自體靜脈移植模型構(gòu)建情況 手術(shù)過程中無大鼠死亡，48 只大鼠均順利完成手術(shù)，血管吻合口通暢，無出血、狹窄、血管扭曲等情況，術(shù)后能觀察到移植靜脈橋血管中血液充盈良好，血流搏動有力，剪斷遠(yuǎn)心端能看到鮮紅色血液流出，表明血流通暢，大鼠自體靜脈移植模型構(gòu)建成功。

2.2 4 組大鼠靜脈橋血管病理形態(tài) HE 染色結(jié)果顯示，模型對照組術(shù)后2 周靜脈橋血管內(nèi)膜細(xì)胞明顯增多，即出現(xiàn)增生，術(shù)后4周增生更加明顯；術(shù)后2周，天麻鉤藤飲組靜脈橋血管內(nèi)膜細(xì)胞層數(shù)明顯減少，術(shù)后4周內(nèi)膜增生改善更加明顯，與通路對照組內(nèi)膜厚度無明顯差異；通路干預(yù)組較通路對照組內(nèi)膜明顯增厚，出現(xiàn)再狹窄現(xiàn)象，見圖1。

圖1 4組大鼠靜脈橋血管病理形態(tài)（HE染色×200）

2.3 4組大鼠靜脈橋血管內(nèi)膜厚度比較 與模型對照組比較，天麻鉤藤飲組大鼠術(shù)后2 周、4 周靜脈橋血管內(nèi)膜厚度均顯著減?。ň鵓＜0.05）；術(shù)后2周、4周，天麻鉤藤飲組與通路對照組靜脈橋血管內(nèi)膜厚度比較，差異無統(tǒng)計學(xué)意義（均P＞0.05）；與通路對照組比較，通路干預(yù)組大鼠術(shù)后2 周、4 周靜脈橋血管內(nèi)膜厚度顯著增加（均P＜0.05），見表1。

表1 4組大鼠靜脈橋血管內(nèi)膜厚度比較 ，n=6

表1 4組大鼠靜脈橋血管內(nèi)膜厚度比較 ，n=6

與模型對照組比較，aP＜0.05；與天麻鉤藤飲組比較，bP＜0.05；與通路對照組比較，cP＜0.05。

2.4 4 組大鼠靜脈橋血管中Klotho、FGF23 mRNA表達(dá)水平比較 與模型對照組比較，天麻鉤藤飲組大鼠術(shù)后2 周、4 周靜脈橋血管中Klotho mRNA 水平顯著升高，F(xiàn)GF23 mRNA 水平顯著降低（均P＜0.05）；天麻鉤藤飲組與通路對照組比較，術(shù)后2周、4周靜脈橋血管中Klotho、FGF23 mRNA水平比較，差異無統(tǒng)計學(xué)意義（均P＞0.05）；與通路對照組比較，通路干預(yù)組大鼠術(shù)后2 周、4 周靜脈橋血管中Klotho mRNA水平顯著降低，F(xiàn)GF23 mRNA水平顯著升高（均P＜0.05），見表2。

表2 4組大鼠靜脈橋血管中Klotho、FGF23 mRNA表達(dá)水平比較 ，n=6

表2 4組大鼠靜脈橋血管中Klotho、FGF23 mRNA表達(dá)水平比較 ，n=6

與模型對照組比較，aP＜0.05；與天麻鉤藤飲組比較，bP＜0.05；與通路對照組比較，cP＜0.05。

2.5 4 組大鼠靜脈橋血管中GSH-Px 活性、MDA 含量比較 與模型對照組比較，天麻鉤藤飲組大鼠術(shù)后2 周、4 周靜脈橋血管中GSH-Px 活性顯著升高，MDA含量顯著降低（均P＜0.05）；術(shù)后2周、4周，天麻鉤藤飲組與通路對照組靜脈橋血管中GSH-Px活性、MDA 含量比較，差異無統(tǒng)計學(xué)意義（均P＞0.05）；與通路對照組比較，通路干預(yù)組大鼠術(shù)后2周、4周靜脈橋血管中GSH-Px活性顯著降低，MDA含量顯著升高（均P＜0.05），見表3。

表3 4組大鼠靜脈橋血管中GSH-Px活性、MDA含量比較 ，n=6

表3 4組大鼠靜脈橋血管中GSH-Px活性、MDA含量比較 ，n=6

與模型對照組比較，aP＜0.05；與天麻鉤藤飲組比較，bP＜0.05；與通路對照組比較，cP＜0.05。

2.6 4 組大鼠靜脈橋血管中Klotho、FGF23、PCNA蛋白表達(dá)比較 與模型對照組比較，天麻鉤藤飲組大鼠術(shù)后2周、4周靜脈橋血管中Klotho蛋白水平顯著升高，F(xiàn)GF23、PCNA 蛋白水平顯著降低（均P＜0.05）；術(shù)后2 周、4 周，天麻鉤藤飲組與通路對照組靜脈橋血管中Klotho、FGF23、PCNA 蛋白水平比較，差異無統(tǒng)計學(xué)意義（均P＞0.05）；與通路對照組比較，通路干預(yù)組大鼠術(shù)后2 周、4 周靜脈橋血管中Klotho 蛋白水平顯著降低，F(xiàn)GF23、PCNA 蛋白水平顯著升高（均P＜0.05），見圖2、表4。

表4 4組大鼠靜脈橋血管中Klotho、FGF23、PCNA蛋白表達(dá)水平比較 ，n=6

表4 4組大鼠靜脈橋血管中Klotho、FGF23、PCNA蛋白表達(dá)水平比較 ，n=6

與模型對照組比較，aP＜0.05；與天麻鉤藤飲組比較，bP＜0.05；與通路對照組比較，cP＜0.05。

圖2 4組大鼠靜脈橋血管中Klotho、FGF23、PCNA蛋白表達(dá)

3 討論

盡管藥物治療、介入治療等治療可在一定程度上緩解冠心病病情發(fā)展，CABG 仍是治療冠心病的主要且有效手段，然而，術(shù)后靜脈橋血管發(fā)生再狹窄會影響橋血管的近期、遠(yuǎn)期通暢率[11]?；A(chǔ)研究顯示，靜脈移植過程中，血流切應(yīng)力改變、手術(shù)操作機(jī)械性損傷、組織缺血再灌注等因素均會引起血管內(nèi)皮細(xì)胞損傷，進(jìn)而刺激血小板源性生長因子、成纖維細(xì)胞生長因子、活性氧等各種細(xì)胞因子及炎癥介質(zhì)釋放，導(dǎo)致平滑肌細(xì)胞異常遷移、增殖，同時平滑肌細(xì)胞不斷分泌細(xì)胞外基質(zhì)，使得血管內(nèi)膜不斷增厚以適應(yīng)動脈血流，最終導(dǎo)致移植靜脈再狹窄發(fā)生[12-13]。本研究采用靜脈移植手術(shù)，術(shù)中保證血管吻合口通暢，無出血等異常情況，術(shù)后可見移植靜脈橋血管中血液充盈，血流搏動有力，血流通暢，表明大鼠自體靜脈移植模型建立成功。

天麻鉤藤飲收載于《雜病證治新義》，是治療高血壓病的經(jīng)典方劑，由天麻、鉤藤、生石決明、山梔、黃芩、川牛膝、杜仲、益母草、桑寄生、夜交藤、朱茯神組成，天麻、鉤藤平肝熄風(fēng)，生石決明平肝潛陽，山梔、黃芩清肝降火，川牛膝活血利水，杜仲、桑寄生補(bǔ)肝益腎，夜交藤、朱茯神寧心安神，合用具有平肝熄風(fēng)、清熱活血、補(bǔ)益肝腎的功效[14-15]。馮惠枝[16]研究發(fā)現(xiàn)，天麻鉤藤飲能抑制患者細(xì)胞內(nèi)Ca2+及炎癥因子釋放，有效改善高血壓患者血管內(nèi)皮功能損傷及血管重塑。本研究建立大鼠自體靜脈移植模型后給予大鼠天麻鉤藤飲灌胃，發(fā)現(xiàn)術(shù)后2 周、4 周時大鼠靜脈橋血管內(nèi)膜厚度均顯著減小，提示天麻鉤藤飲可以抑制靜脈橋血管內(nèi)膜增生。GSH-Px、MDA 分別為重要的抗氧化酶和脂質(zhì)過氧化反應(yīng)最終產(chǎn)物，是檢測抗氧化應(yīng)激水平及氧化應(yīng)激水平的重要參考指標(biāo)[17]。本研究結(jié)果顯示，與模型對照組比較，天麻鉤藤飲組大鼠術(shù)后2 周、4 周靜脈橋血管中GSH-Px 活性顯著升高，MDA 含量顯著降低，提示天麻鉤藤飲可抑制氧化應(yīng)激，提高機(jī)體抗氧化能力，減輕血管內(nèi)皮功能損傷，進(jìn)而抑制靜脈橋血管內(nèi)膜增生。

Klotho/FGF23 通路是影響冠心病、慢性腎臟疾病、高血壓等疾病血管功能的重要通路[18-19]。有研究發(fā)現(xiàn)，Klotho蛋白水平升高能減少活性氧的產(chǎn)生，抑制腎臟細(xì)胞氧化應(yīng)激反應(yīng)[20]。陳金艷等[6]研究表明，Klotho 蛋白對血管內(nèi)皮細(xì)胞具有保護(hù)作用，而FGF-23水平升高與內(nèi)皮功能紊亂相關(guān)，兩者均能影響頸動脈內(nèi)膜中膜厚度變化。本研究結(jié)果顯示，使用天麻鉤藤飲后，大鼠術(shù)后2 周、4 周靜脈橋血管中Klotho mRNA 及蛋白水平顯著升高，F(xiàn)GF23 mRNA及蛋白水平顯著降低，提示天麻鉤藤飲可能通過上調(diào)Klotho 表達(dá)并下調(diào)FGF23 表達(dá)保護(hù)血管內(nèi)皮細(xì)胞。此外，本研究在使用天麻鉤藤飲治療的同時向大鼠尾靜脈注射Klotho siRNA抑制Klotho表達(dá)，發(fā)現(xiàn)靜脈橋血管中Klotho mRNA 及蛋白表達(dá)量顯著降低，F(xiàn)GF-23 mRNA 及蛋白表達(dá)量顯著升高，同時GSH-Px 活性顯著降低，MDA 含量顯著升高，血管內(nèi)膜厚度顯著增加，靜脈橋血管出現(xiàn)再狹窄現(xiàn)象，進(jìn)一步提示天麻鉤藤飲改善靜脈橋血管內(nèi)膜增生的機(jī)制可能與上調(diào)Klotho 表達(dá)及下調(diào)FGF23 表達(dá)有關(guān)。

綜上所述，天麻鉤藤飲可能通過激活Klotho/FGF23 信號通路抑制自體靜脈移植大鼠靜脈橋血管中氧化應(yīng)激反應(yīng)，改善血管內(nèi)膜增生。