miR-508-3p靶向AFF4/TGFβ1信號(hào)通路調(diào)控人牙髓細(xì)胞分化的機(jī)制研究*

楊正濤，林方梁，溫利梅

（四川省自貢市第一人民醫(yī)院，自貢 643000）

牙髓治療普遍認(rèn)可牙髓牙本質(zhì)復(fù)合體的修復(fù)、再生，包括干細(xì)胞移植、細(xì)胞歸巢、牙髓血運(yùn)重建等技術(shù)[1]。雖然醫(yī)療水平不斷進(jìn)步，牙髓治療的技術(shù)也得到了很大提升，但臨床上仍存在很多問題。牙髓細(xì)胞具有很強(qiáng)的分化和再生牙本質(zhì)牙髓復(fù)合體的能力，也是再生醫(yī)學(xué)研究的重要對(duì)象。據(jù)報(bào)道，牙髓細(xì)胞分化的分子機(jī)制受堿性成纖維細(xì)胞生長因子（bFGF）、轉(zhuǎn)化生長因子β（TGFβ）、神經(jīng)生長因子（NGF）、血小板衍生生長因子（PDGF）和骨形態(tài)發(fā)生蛋白（BMP）等基因的調(diào)控[2]。微小RNA（miRNA）是一種非編碼RNA，長度在18～25 個(gè)核苷酸，其通過識(shí)別靶基因，抑制靶基因mRNA 的翻譯，從而在生物的發(fā)育、細(xì)胞增殖、凋亡、分化及腫瘤中發(fā)揮作用[3-4]。目前已發(fā)現(xiàn)，大量miRNA參與牙髓細(xì)胞的分化調(diào)控[5]，其中包括新發(fā)現(xiàn)的miR-508-3p[6]。AF4/FMR2 家庭成員4（AFF4）是AF4/FMR2 家族的最末位成員。AFF1 和AFF4 都是重要的表觀遺傳調(diào)控因子，其在人骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞成骨分化過程中的作用不同，其中AFF4 在促進(jìn)骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞成骨分化中起著關(guān)鍵作用[7]。本研究通過構(gòu)建缺氧誘導(dǎo)的牙髓細(xì)胞模型，觀察過表達(dá)miR-508-3p或敲減AFF4 對(duì)缺氧牙髓細(xì)胞分化的影響及相關(guān)機(jī)制。

1 材料與方法

1.1 主要試劑和儀器 DMEM 培養(yǎng)基、胎牛血清、胰蛋白酶均購自大連TaKaRa；pcDNA3.1（貨號(hào)：HG-VPI0001）、pcDNA3.1-AFF4（貨 號(hào)：GM-10405OP01）購自上海吉滿生物科技有限公司；兔抗AFF4、DMP1、DSPP、OCN、ALP、TGFβ1、Smad、BMP抗體、辣根過氧化物酶標(biāo)記的山羊抗兔二抗均購自上海艾博抗公司；熒光素酶報(bào)告基因試劑盒購自上海吉滿生物公司；RNA 抽提試劑盒、RT-qPCR試劑盒、ECL均購自碧云天。半干轉(zhuǎn)膜儀購自美國BIO-RAD公司，凝膠成像分析儀購自柯達(dá)公司。本試驗(yàn)所用所有引物、質(zhì)粒、mimics-NC、miR-508-3p mimics、si-NC、si-AFF4 序列均由上海吉瑪基因提供。

1.2 牙髓細(xì)胞的分離培養(yǎng) 收集2019 年2 月至2021年5月自貢市第一人民醫(yī)院拔除的無病變健康前磨牙或第三磨牙。無菌條件下取出牙髓組織，PBS洗凈，剪碎，用Ⅰ型膠原酶消化1 h。收集細(xì)胞，用20%胎牛血清的高糖DMEM 培養(yǎng)基置于37 ℃、5%CO2的培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。待細(xì)胞貼壁后，隔2 d 換液1 次，0.25%胰酶消化傳代。取第3～6 代的細(xì)胞用于實(shí)驗(yàn)研究。

1.3 缺氧牙髓細(xì)胞模型的建立與分組轉(zhuǎn)染 用200 μmol/mL 的氯化鈷（CoCl2）溶液處理牙髓細(xì)胞24 h，建立缺氧模型，記為實(shí)驗(yàn)組。用等量生理鹽水處理的牙髓細(xì)胞為對(duì)照組。使用Lipofectamine?2000 脂質(zhì)體將miR-NC 組（轉(zhuǎn)染mimics-NC）、miR-508-3p組（轉(zhuǎn)染miR-508-3p mimics）、si-NC組（轉(zhuǎn)染si-NC）、si-AFF4 組（轉(zhuǎn)染si-AFF4）、miR-508-3p+pcDNA 組（共轉(zhuǎn)染miR-508-3p mimics 和pcDNA）、miR-508-3p+pcDNA-AFF4 組（共轉(zhuǎn)染miR-508-3p mimics 和pcDNA-AFF4）轉(zhuǎn)染至實(shí)驗(yàn)組牙髓細(xì)胞。轉(zhuǎn)染48 h后，用RT-qPCR法檢測(cè)轉(zhuǎn)染效率。

1.4 RT-qPCR 實(shí)驗(yàn) 提取細(xì)胞總RNA，逆轉(zhuǎn)錄為cDNA，進(jìn)行PCR 反應(yīng)。miR-508-3p 內(nèi)參為U6，AFF4、DMP1、DSPP、OCN、ALP 內(nèi)參為GAPDH。用2-△△Ct法計(jì)算miR-508-3p、AFF4、DMP1、DSPP、OCN、ALP的表達(dá)。PCR反應(yīng)條件：94 ℃變性2 min；94 ℃變性30 min；58 ℃退火30 s；72 ℃延伸2 min，共45 個(gè)循環(huán)。引物序列如下：miR-508-3p 上游：5’-ACACTCCAGCTGGGTACTCCAGAGGGCGTCACT-3’，下游：5’-TGGTGTCGTGGAGTCG-3’；DMP1 上游：5’-GTGAGTGAGTCCAGGGGAGATAA-3’，下游：5’-TTTTGAGTGGGAGAGTGTGTGCC-3’；DSPP 上游：5’-GGGACACAGGAAA-AGCAGAA-3’，下 游：5’-TGCTCCATTCCCACTAGGAC-3’；OCN 上游：5’-CTCACACTCCTCGCCCTATT-3’，下游：5’-TTGGACACAAAGGCTGCAC-3’；ALP上游：5’-CTATCCTGGCTCCGTGCTC-3’，下游：5’-GCTGGCAGTGGTCAGATGTT-3’；GAPDH上游：5’-GTTGTCTCCTGCGACTTCA-3’，下游：5’-GGTGGTCCAGGGTTTCTTA-3’；U6 上游：5’-GCTTCGGCAGCACATATACTAAAAT-3’，下游：5’-CGCTTC ACGAATTTGCGTGTCAT-3’。

1.5 Western blotting 實(shí)驗(yàn) 將細(xì)胞充分裂解，提取總蛋白，并進(jìn)行定量、煮沸變性。SDS-PAGE 電泳，將蛋白轉(zhuǎn)移至PVDF 膜，脫脂奶粉封閉，加入一抗AFF4（1∶1 000）、DMP1（1∶1 000）、DSPP（1∶500）、OCN（1∶1 000）、ALP（1∶1 000）、TGFβ1（1∶800）、Smad（1∶2 000）、BMP（1∶1 500）4 ℃孵育過夜；洗膜，加入山羊抗兔二抗溶液（1∶500）37 ℃孵育2 h，洗膜，ECL 顯影、曝光。ImageJ 分析蛋白條帶灰度值。以目的蛋白條帶灰度值與內(nèi)參GAPDH條帶灰度值的比值作為目的蛋白相對(duì)表達(dá)量。

1.6 雙熒光素酶報(bào)告基因?qū)嶒?yàn) 在線預(yù)測(cè)網(wǎng)站Starbase（http://starbase.sysu.edu.cn）預(yù)測(cè)到miR-508-3p 與AFF4 存在靶向關(guān)系。將AFF4 3’UTR WT、AFF4 3’UTR MUT分別與miR-NC、miR-508-3p、anti-miR-NC、anti-miR-508-3p 構(gòu)建重組載體質(zhì)粒，并共轉(zhuǎn)染至293T 細(xì)胞。用雙熒光素酶活性檢測(cè)試劑盒測(cè)定細(xì)胞中螢火蟲熒光素酶的熒光值與海腎熒光素酶的熒光值的比值。

1.7 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法 用PEMS 3.2軟件分析數(shù)據(jù)。計(jì)量資料以均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差（）表示，多組間比較采用方差分析，組間兩兩比較采用LSD-t檢驗(yàn)，以P＜0.05為差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 miR-508-3p、AFF4 及牙髓分化指標(biāo)在缺氧誘導(dǎo)牙髓細(xì)胞中的表達(dá) 與對(duì)照組相比，實(shí)驗(yàn)組細(xì)胞中miR-508-3p 的表達(dá)顯著升高，AFF4、DMP1、DSPP、OCN、ALP 表達(dá)均顯著降低（均P＜0.01），見圖1。

圖1 miR-508-3p、AFF4及牙髓分化檢測(cè)指標(biāo)在缺氧誘導(dǎo)牙髓細(xì)胞中的表達(dá)

2.2 過表達(dá)miR-508-3p 或敲減AFF4 對(duì)缺氧誘導(dǎo)牙髓細(xì)胞分化的影響 與miR-NC 組相比，miR-508-3p組miR-508-3p表達(dá)顯著升高，AFF4、DMP1、DSPP、OCN、ALP 的表達(dá)均顯著降低（均P＜0.01）。與si-NC 組相比，si-AFF4 組miR-508-3p 表達(dá)升高，AFF4、DMP1、DSPP、OCN、ALP 的表達(dá)均明顯降低（均P＜0.01），見圖2。

圖2 過表達(dá)miR-508-3p或敲減AFF4對(duì)缺氧牙髓細(xì)胞分化的影響

2.3 miR-508-3p 靶 向AFF4 Starbase（http://starbase.sysu.edu.cn）預(yù)測(cè)到miR-508-3p與AFF4之間的互補(bǔ)堿基序列，見圖3A。與miR-NC 組相比，miR-508-3p組AFF4 3’UTR WT細(xì)胞的熒光活性顯著降低（P＜0.01），而AFF4 3’UTR MUT 組細(xì)胞的熒光活性變化不明顯，見圖3B；與miR-NC組相比，miR-508-3p組AFF4 蛋白表達(dá)顯著降低，與anti-miR-NC組相比，anti-miR-508-3p 組AFF4 蛋白表達(dá)顯著升高（P＜0.01），見圖3C。

圖3 miR-508-3p與AFF4的靶向關(guān)系

2.4 過表達(dá)AFF4 部分逆轉(zhuǎn)過表達(dá)miR-508-3p 對(duì)缺氧誘導(dǎo)牙髓細(xì)胞分化的作用 與miR-508-3p+pcDNA 組相比，miR-508-3p+pcDNA-AFF4 組誘導(dǎo)牙髓細(xì)胞中miR-508-3p 表達(dá)顯著降低，AFF4、DMP1、DSPP、OCN、ALP 的表達(dá)均明顯升高（P＜0.01），見圖4。

圖4 過表達(dá)AFF4對(duì)miR-508-3p的抑制誘導(dǎo)牙髓細(xì)胞分化作用的調(diào)控

2.5 TGFβ1 信號(hào)通路在缺氧誘導(dǎo)牙髓細(xì)胞中受miR-508-3p、AFF4 調(diào)控 與miR-NC 組相比，miR-508-3p 組TGFβ1、Smad、BMP 蛋白表達(dá)均顯著降低（P＜0.01）；與miR-508-3p+pcDNA 組相比，miR-508-3p+pcDNA-AFF4組TGFβ1、Smad、BMP蛋白表達(dá)均顯著升高（P＜0.01）；與si-NC 組相比，si-AFF4組TGFβ1、Smad、BMP 蛋白表達(dá)均顯著降低（P＜0.01），見圖5。

圖5 TGFβ1信號(hào)通路關(guān)鍵蛋白TGFβ1的表達(dá)與miR-508-3p/AFF4的關(guān)系

3 討論

牙髓細(xì)胞分化所處的環(huán)境含氧量雖然遠(yuǎn)遠(yuǎn)低于正常細(xì)胞培養(yǎng)的含氧量，但是若牙髓細(xì)胞長期受到炎癥、外傷、牙菌斑侵蝕等，容易誘發(fā)牙髓組織的缺血缺氧[8-9]。袁曉琴等[10]在研究中使用化學(xué)法誘導(dǎo)牙髓細(xì)胞缺氧，模擬牙髓的缺氧環(huán)境，在此基礎(chǔ)上發(fā)現(xiàn)，miR-210-3p參與牙髓在缺氧環(huán)境中的促增殖分化作用。因此，本研究建立了缺氧環(huán)境中的牙髓細(xì)胞模型，用于探究miR-508-5p、AFF4 在其中的功能及機(jī)制。

miRNA參與人類的多種疾病的發(fā)病過程，其中包括牙髓疾病[11]。Liu等[12]研究報(bào)道，miR-508-5p在牙周發(fā)育的過程中表達(dá)逐漸降低，過表達(dá)miR-508-5p 后，牙髓細(xì)胞的分化能力顯著降低，miR-508-5p的這種抑制牙髓細(xì)胞分化功能可被非轉(zhuǎn)移性黑色素瘤糖蛋白B（GPNMB）逆轉(zhuǎn)，揭示miR-508-5p 通過靶向GPNMB 發(fā)揮抑制牙髓細(xì)胞分化的調(diào)節(jié)機(jī)制。于是，猜測(cè)miR-508-3p可能參與調(diào)控缺氧條件下牙髓細(xì)胞的分化過程。本研究檢測(cè)了缺氧牙髓細(xì)胞中miR-508-5p 的表達(dá)發(fā)現(xiàn)，其明顯升高，再次確定了miR-508-5p 在牙髓細(xì)胞分化中的抑制作用。本實(shí)驗(yàn)對(duì)miR-508-5p 過表達(dá)后的缺氧牙髓細(xì)胞進(jìn)行檢測(cè)，檢測(cè)其中牙髓分化相關(guān)基因DMP1、DSPP、OCN、ALP 的表達(dá)發(fā)現(xiàn)，其可抑制牙髓分化的上述基因表達(dá)，這些結(jié)果與Liu 等[12]的實(shí)驗(yàn)結(jié)果相一致。通過熒光素酶實(shí)驗(yàn)進(jìn)行深入探究發(fā)現(xiàn)，miR-508-5p可與靶向負(fù)調(diào)節(jié)AFF4的表達(dá)水平。推測(cè)這種靶向關(guān)系可能與miR-508-5p 的牙髓分化調(diào)節(jié)有關(guān)。這些實(shí)驗(yàn)結(jié)果揭示了miR-508-5p 在缺氧牙髓細(xì)胞中顯著升高，發(fā)揮抑制牙髓細(xì)胞分化功能，這種抑制功能與靶向AFF4緊密相關(guān)。

近期，AFF4 在人類疾病發(fā)生發(fā)展中的調(diào)控功能的研究越來越多[13]。最近Xiao等[14]發(fā)現(xiàn)，AFF4參與牙囊細(xì)胞的成骨分化過程，敲減AFF4 能夠下調(diào)成骨相關(guān)基因遠(yuǎn)端同源框5、核心結(jié)合因子a1 和骨γ-羧谷氨酸蛋白的表達(dá)，而慢病毒介導(dǎo)的AFF4過表達(dá)則具有相反的作用，并顯著增強(qiáng)牙囊細(xì)胞的成骨能力，這種調(diào)控作用與AFF4上調(diào)ALKB同源蛋白1具有直接關(guān)系。Zhang 等[15]報(bào)道，慢病毒介導(dǎo)的AFF4 過表達(dá)能夠促進(jìn)牙髓細(xì)胞的成牙分化，而AFF4缺失則可抑制牙髓細(xì)胞分化，并且AFF4的這種功能與牙根形成關(guān)鍵因素核因子ⅠC相關(guān)。本研究發(fā)現(xiàn)，AFF4 在缺氧牙髓細(xì)胞中表達(dá)下調(diào)，敲減AFF4 可抑制牙髓分化相關(guān)基因DMP1、DSPP、OCN、ALP的表達(dá)，并且過表達(dá)AFF4還可逆轉(zhuǎn)過表達(dá)miR-508-3p對(duì)DMP1、DSPP、OCN、ALP表達(dá)的下調(diào)作用。這說明了AFF4可逆轉(zhuǎn)miR-508-5p對(duì)牙髓細(xì)胞分化的抑制作用。

大量研究報(bào)道，TGFβ1信號(hào)通路參與牙髓細(xì)胞損傷過程[16]。為了探究該通路是否受miR-508-3p、AFF4 的影響，本實(shí)驗(yàn)檢測(cè)了TGFβ1 信號(hào)通路關(guān)鍵基因TGFβ1、Smad、BMP 的表達(dá)情況，結(jié)果顯示，miR-508-5p 可抑制缺氧誘導(dǎo)的牙髓細(xì)胞中TGFβ1、Smad、BMP的表達(dá)，敲減AFF4也具有相似的功能，而過表達(dá)AFF4可逆轉(zhuǎn)過表達(dá)miR-508-3p對(duì)TGFβ1、Smad、BMP 的抑制作用。這些實(shí)驗(yàn)結(jié)果展示了TGFβ1 信號(hào)通路的活性在缺氧牙髓細(xì)胞中受miR-508-3p 的抑制、AFF4 的 促進(jìn)，揭示miR-508-5p/AFF4/TGFβ1信號(hào)通路在牙髓細(xì)胞分化中的調(diào)控機(jī)制。

綜上所述，miR-508-5p 可抑制缺氧誘導(dǎo)的牙髓細(xì)胞分化，產(chǎn)生這種作用的機(jī)制與miR-508-5p靶向AFF4，抑制TGFβ1 信號(hào)通路活性有關(guān)，本研究結(jié)果可為牙髓再生提供理論參考。