消毒藥實驗室篩選及其非洲豬瘟復產(chǎn)前空豬舍臨床消毒使用效果評價

王亞超，胡 茂，何 健，2，李元鳳，2，陳宇晨，蔣 立

（1.西南科技大學生命科學與工程學院，四川 綿陽 621010；2.鐵騎力士集團馮光德實驗室，四川 綿陽 621006）

自2018年8月中國報道第一例非洲豬瘟以來，非洲豬瘟給國內(nèi)養(yǎng)豬業(yè)造成了巨大的經(jīng)濟損失[1-3]。由于目前還未研發(fā)出安全有效的疫苗和治療藥物，生物安全已成為防控非洲豬瘟的行業(yè)共識[4-5]。作為生物安全的一項重要工作，消毒是切斷傳播途徑、殺滅非洲豬瘟病毒的關(guān)鍵舉措，但是針對市場上琳瑯滿目的消毒劑，部分從業(yè)者缺乏相關(guān)的專業(yè)知識，恐慌性盲目消毒，不僅未達到預期消毒效果，過量或濫用消毒藥還會對環(huán)境造成污染、用藥成本浪費增加，以及對人員和豬群造成不利影響[6-7]。該如何選擇有效的消毒藥，仍然困擾著很多豬場。近來迫于非洲豬瘟疫情壓力，很多豬場都籌建有小型實驗室，基本能滿足簡單的微生物試驗以及非洲豬瘟檢測的功能。鑒于此，文章就以實驗室篩選不同類型的消毒藥以及其在非洲豬瘟復產(chǎn)的空豬舍進行現(xiàn)場消毒試驗評價，篩選出有效的消毒劑，以期幫助豬場有效消毒，科學防控非洲豬瘟，也為臨床簡單有效地篩選消毒藥提供一種方法[8]。

1 材料與方法

1.1 試驗時間與地點

試驗于2019年6—10月，在西南科技大學生命科學與工程學院微生物實驗室和四川省綿陽市三臺縣某一規(guī)?；i場進行。

1.2 材料

1.2.1 消毒藥 熏蒸藥：復方多聚甲醛粉，含量90%，山東某獸藥有限公司生產(chǎn)。

受試藥：消毒藥A（過氧乙酸，16.0% ～23.0% ），產(chǎn)品批號190346432，廣州產(chǎn)品；消毒藥B（100 mL∶戊二醛5 g+癸甲溴銨5 g），產(chǎn)品批號20100106，廣州產(chǎn)品；消毒藥C（癸甲溴銨，50 g/100 mL），產(chǎn)品批號190343272，廣州產(chǎn)品；消毒藥D（10% 苯扎氯銨+15% 戊二醛），美國產(chǎn)品。

1.2.2 菌種 本次試驗所用沙門氏菌和金黃色葡萄球菌由西南科技大學微生物實驗室提供。

1.2.3 試驗試劑及主要儀器 普通瓊脂培養(yǎng)基，杭州微生物試劑有限公司生產(chǎn)；菌落總數(shù)測試片：廣東達元綠洲食品科技股份有限公司；核酸（RNA/DNA）柱提試劑，寶生物工程（大連）有限公司生產(chǎn)；非洲豬瘟檢測試劑，賽默飛世爾科技（中國）有限公司生產(chǎn)；伯樂熒光定量PCR儀，型號CFX96Touch，美國伯樂Bio-Rad生產(chǎn)；潔凈工作臺，型號SW-CJ-1FD，蘇凈集團蘇州安泰空氣技術(shù)有限公司生產(chǎn)；培養(yǎng)箱，型號SHP-250型，上海三發(fā)科學儀器有限公司生產(chǎn)。

1.3 方法

1.3.1 藥敏試驗 采用牛津杯法對革蘭氏陰性菌沙門氏菌和陽性菌金黃色葡萄球菌進行耐藥性分析。將所培養(yǎng)的細菌涂在培養(yǎng)皿中，在培養(yǎng)基表面垂直擺放牛津杯，輕輕加壓，使其與培養(yǎng)基接觸無空隙，參考不同廠家提供的消毒藥不同稀釋比例（1∶100或1∶3 000或1∶10 000）在杯中加入不同稀釋度的消毒藥液，進行標記后置于37 ℃培養(yǎng)箱中培養(yǎng)16～18 h，觀察并測量抑菌圈直徑。消毒藥敏感度判斷標準如下：抑菌圈直徑≥15 mm，高度敏感；10 mm＜抑菌圈直徑＜15 mm，中度敏感；抑菌圈直徑≤10 mm，低敏感；抑菌圈直徑≤5 mm，無抑菌作用。

1.3.2 豬舍消毒試驗 以四川省綿陽市某一非洲豬瘟陽性豬場進行試驗，場內(nèi)有4個豬舍，分為4個組，即：一舍、二舍、三舍及四舍，提前將豬只清場，進行徹底清洗后，先對豬舍環(huán)境進行多點（至少12個點）采樣。具體操作：1）采樣面積。被采面積＜100 cm2取全部面積，采樣面積≥100 cm2，取100 cm2。2）采樣方法。棉拭子法：將5 cm×5 cm的標準滅菌規(guī)格板放在被檢環(huán)境表面，用浸有含滅菌生理鹽水的棉拭子在規(guī)格板內(nèi)橫豎往返均勻涂抹5次，并隨之轉(zhuǎn)動棉拭子，可連續(xù)采樣4×3個規(guī)格板面積，折斷上半部分，將棉拭子頭放入裝有30 mL含生理鹽水的試管內(nèi)，采樣后馬上放入隨身攜帶的冰袋箱內(nèi)保存，當天對采樣棉拭子頭濾液進行檢測。一部分濾液按照菌落總數(shù)測試片的操作說明進行實驗室37 ℃微生物培養(yǎng)16～18 h后，測定環(huán)境細菌總數(shù)；另一部分濾液按照核酸（RNA/DNA）柱提試劑和非洲豬瘟檢測試劑的操作說明進行非洲豬瘟熒光定量檢測。圈舍環(huán)境采樣進行非洲豬瘟檢測為陰性后，對圈舍進行多聚甲醛熏蒸消毒結(jié)合試驗用的不同消毒藥噴灑消毒；反之，為陽性時，還需要重新進行清潔圈舍，直至圈舍環(huán)境采樣非瘟檢測為陰性，才能對圈舍進行多聚甲醛熏蒸消毒結(jié)合試驗用的不同消毒藥噴灑消毒，具體分組試驗設(shè)計見表1。消毒24 h后，按照以上的采樣方法對各豬舍環(huán)境進行采樣，同樣進行實驗室微生物培養(yǎng)測定環(huán)境細菌總數(shù)以及非洲豬瘟熒光定量檢測，最后進行消毒效果評價。

表1 豬舍消毒藥使用分組試驗設(shè)計

1.4 數(shù)據(jù)處理

所有數(shù)據(jù)采用IBM SPSS 22軟件進行統(tǒng)計分析。

2 結(jié)果分析

2.1 藥敏結(jié)果分析

從表2可以看出，對沙門氏菌來說，在1∶3 000濃度下，消毒藥B、消毒藥C和消毒藥D之間相比，差異不顯著（P＞0.05），但消毒藥A與消毒藥C相比差異顯著（P＜0.05）；在濃度為1∶100時，消毒藥A與消毒藥D比較，差異不顯著（P＞0.05），但消毒藥A抑菌圈直徑最大；在1∶10 000濃度下，消毒藥A與消毒藥C比較，差異顯著（P＜0.05），消毒藥A抑菌圈直徑最大，整體來說，消毒藥A對革蘭氏陰性菌沙門氏菌的抑菌效果最好。對金黃色葡萄球菌來說，濃度為1∶100時，消毒藥A與消毒藥D相比，差異極顯著（P＜0.01），消毒藥D抑菌圈直徑最大，屬于高度敏感，殺菌效果最好；在1∶10 000濃度下，消毒藥A與消毒藥C比較，差異不顯著（P＞0.05）；而在濃度為1∶3 000濃度下，消毒藥A、消毒藥B和消毒藥C之間相比，差異不顯著（P＞0.05），而消毒藥C與消毒藥D相比差異顯著（P＜0.05），消毒藥C的抑菌圈直徑最大，消毒藥C對革蘭氏陽性菌金黃色葡萄球菌的抑菌效果最好，屬于中度敏感。綜合分析比較，在濃度1∶3 000時，消毒藥A對革蘭氏陰性菌和陽性菌抑菌效果較好；在濃度1∶100時，消毒藥D對革蘭氏陰性菌和陽性菌殺菌效果較好。

表2 不同消毒藥不同濃度對革蘭氏陰性菌和革蘭氏陽性菌的抑菌效果

2.2 不同消毒藥對豬舍消毒前后消毒效果分析

從表3可以看出，第1次清洗后進行非洲豬瘟檢測呈陽性，然后進行第2次清洗，檢測非洲豬瘟呈陰性，第1次清洗與第2次清洗細菌總數(shù)平均值相比較，第2次清洗比第1次微生物數(shù)量差異極顯著（P＜0.01），最大相差10個數(shù)量級以上；豬舍采樣檢測非洲豬瘟呈陰性，清洗符合規(guī)定后，正式進行消毒試驗。從各組使用的熏蒸和噴灑消毒藥組合及消毒前與消毒（24 h）后細菌總數(shù)比較來看，豬舍消毒前和消毒后相比較，微生物數(shù)量差異極顯著（P＜0.01），消毒后各組之間比較，微生物數(shù)量差異不顯著（P＞0.05），一舍、二舍和三舍的細菌總數(shù)在270～370 CFU范圍內(nèi)，而四舍在40 CFU左右，相差近10個數(shù)量級，說明消毒藥D（1∶100）效果最好，其次是消毒藥B（1∶500），消毒藥C（1∶1 000）和消毒藥A（1∶50）效果差不多。

表3 不同消毒藥對不同豬舍消毒前后細菌總數(shù)和非洲豬瘟指標變化

2.3 價格比較

由于使用的是廠家推薦的環(huán)境消毒的最大劑量來進行消毒，最后得出的結(jié)果不同，結(jié)合廠家提供的價格平衡性價比來確定是否符合豬場或不同的豬舍使用要求。由表4可知，從效果來，消毒藥D效果最好，但價格最貴；從性價比來看，消毒藥C可以選擇應用。

表4 不同消毒藥在豬舍中使用效果及其價格

3 討論與小結(jié)

消毒措施是豬場生物安全體系中的重要環(huán)節(jié)，在預防和控制傳染性疾病方面發(fā)揮著重要作用，不僅可以降低豬場環(huán)境中病原微生物的數(shù)量，而且可降低豬場微生物的污染程度，阻斷病原微生物從外部環(huán)境傳入和在豬群內(nèi)部的擴散，顯著降低了細菌性疾病及病毒性疾病的發(fā)生率[9-11]。當前，規(guī)?；i養(yǎng)殖場在應對防控非洲豬瘟疫情時，沒有疫苗可用，沒有藥物可治，只能采取消滅傳染源、切斷傳播途徑的方式進行主動防控，因此科學、系統(tǒng)、高效的消毒顯得尤為重要，其中消毒藥的正確篩選以及臨床上正確使用是關(guān)鍵。

3.1 實驗室藥敏試驗篩選

不同的病原微生物，對消毒藥的敏感性有很大的差異。大多數(shù)的消毒藥對細菌有殺滅作用，但對細菌的芽孢和病毒作用很有限。由于養(yǎng)豬生產(chǎn)中細菌性病原占多數(shù)，實驗室只需配備有超凈工作臺和培養(yǎng)箱就可以進行細菌微生物藥敏試驗。細菌經(jīng)革蘭氏染色分成兩類，即革蘭氏陽性菌與革蘭氏陰性菌。本研究就以選擇革蘭氏陰性菌豬沙門氏菌和革蘭氏陽性菌金黃色葡萄球菌分別用消毒藥A、消毒藥B、消毒藥C和消毒藥D進行藥敏試驗和抑菌效果評價。從試驗的藥敏結(jié)果來看，在中等濃度（1∶3 000）時，消毒藥A對沙門氏菌的抑菌效果最好，即抑菌圈直徑為（14.81±0.693） mm，屬于中度敏感，而消毒藥C對金黃色葡萄球菌的抑菌效果最好，即抑菌圈直徑為（14.43±1.009） mm，屬于中度敏感。從整個表2來看，消毒藥A和消毒藥D在高濃度（1∶100）下，在沙門氏菌表現(xiàn)出抑菌圈直徑≥15 mm，沙門氏菌對消毒藥A和消毒藥D屬于高度敏感；在金色葡萄球菌表現(xiàn)出抑菌圈直徑≥15 mm，金色葡萄球菌只對消毒藥D屬于高度敏感，說明不同類型的消毒藥對革蘭氏陰性菌和陽性菌敏感性不一樣，濃度高時對細菌的抑制較強，高度敏感[12-13]，然而中等濃度時，殺菌強的消毒劑不一定抑菌效果好，因此，在實際應用中應根據(jù)消毒的目的來對消毒藥類型及濃度進行選擇。

3.2 臨床上使用消毒劑后消毒效果評價

試驗室內(nèi)對消毒藥進行藥敏試驗評價消毒藥效果，由于試驗用的病原微生物菌比較單一且裸露在外，而豬場環(huán)境中病原微生物的種類復雜，尤其是豬舍內(nèi)微生物聚集較多，為了進一步驗證以上消毒劑在臨床上的消毒情況，選擇非洲豬瘟復產(chǎn)前空豬舍進行消毒評價，消毒前先對豬舍進行徹底清洗，并對豬舍進行多點（12個點以上）采樣，進行微生物培養(yǎng)菌落數(shù)，同時檢測非洲豬瘟指標是否陽性，只有檢測結(jié)果為陰性時，才能進行下一步消毒試驗。從表3可以看出，一舍和三舍第1次清洗后非洲豬瘟檢測呈陽性，同時兩個舍細菌總數(shù)平均值較另外的非洲豬瘟呈陰性的豬舍細菌總數(shù)都高，進行第2次徹底的清洗后，一舍和三舍細菌總數(shù)平均值比第1次的細菌總數(shù)下降，甚至達10個數(shù)量級以上，非洲豬瘟呈陰性，說明徹底的清洗是清除豬舍大部分環(huán)境微生物的關(guān)鍵[14-16]，但也不能完全清洗到很低的數(shù)量級別，還是需要消毒藥來補充由于清洗不到位的部分?，F(xiàn)場消毒試驗結(jié)果表明，消毒藥D（1∶100）效果最好，消毒后該豬舍細菌總數(shù)比其它3個豬舍低7～10倍，然而消毒藥A（1∶50）反而不如消毒藥D（1∶100），說明消毒藥類型本身決定了消毒效果是否高效。對于消毒藥D主要消毒成分為戊二醛苯扎氯銨，主要用于動物廄舍及其器具的消毒，其中戊二醛可殺滅各種微生物（包括細菌的芽孢），屬于高效的消毒劑[17]，成本高，作為器械消毒劑效果明顯，而作為環(huán)境消毒劑則受到成本的限制，醛類屬于還原性消毒劑，是通過凝固蛋白質(zhì)殺滅病菌的，使用濃度大，氣味刺鼻，作為消除非洲豬瘟的陽性場，可以考慮使用，它也是農(nóng)業(yè)農(nóng)村部推薦的防控非洲豬瘟疫情的消毒藥。消毒藥A主要成分為過氧乙酸，它是一種強氧化劑，可以殺滅大腸桿菌、金黃色葡萄球菌、白色念珠菌、白色葡萄球菌等細菌和真菌，屬于殺菌能力較強的消毒劑。而消毒藥C主要成分是癸甲溴銨，它是一種季銨鹽類陽離子表面活性劑，抑菌效果好，可殺滅親脂病毒和細菌繁殖體，屬于低效消毒劑，根據(jù)消毒任務和消毒對象用于預防消毒時居多。

綜合以上試驗結(jié)果，兼顧實際使用成本，可以用本研究簡單的試驗方法來篩選適合不同情況下豬場應用的消毒藥及其實際使用濃度。在消毒前要做好徹底的清洗工作，建議豬場如果發(fā)生非洲豬瘟疫情時，最好使用高效消毒藥進行殺滅病原微生物，質(zhì)量好的戊二醛類消毒劑，1∶100高濃度使用；平時的常規(guī)消毒要選擇安全性好、低毒、低刺激等抑菌效果好的中效消毒藥，中等濃度使用，再結(jié)合市場價格來選擇消毒藥的產(chǎn)品。