子宮內(nèi)膜異位癥相關(guān)卵巢癌患者上皮-間充質(zhì)轉(zhuǎn)化相關(guān)蛋白的表達(dá)及其影響因素

付小英，呂海利，劉平，尚瑩瑩

西安國際醫(yī)學(xué)中心醫(yī)院婦科，西安 710061

研究證實，子宮內(nèi)膜異位癥（endometriosis，EMS）及其潛在的惡變能力與部分卵巢癌間存在密切聯(lián)系，目前臨床將這類卵巢癌單獨定義為子宮內(nèi)膜異位癥相關(guān)卵巢癌（endometriosis-associated ovarian cancer，EAOC）。上皮-間充質(zhì)轉(zhuǎn)化（epithelial-mesenchymal transition，EMT）是指上皮細(xì)胞轉(zhuǎn)變?yōu)殚g質(zhì)細(xì)胞的病理過程，其在EMS向EAOC轉(zhuǎn)變的過程中發(fā)揮重要作用，而上皮鈣黏蛋白（E-cadherin）、神經(jīng)鈣黏蛋白（N-cadherin）、鋅指轉(zhuǎn)錄因子Snail均是EMT相關(guān)的重要物質(zhì)。本研究旨在探討EAOC患者病灶組織中EMT相關(guān)蛋白表達(dá)情況及其與患者臨床特征間的相關(guān)性，以期為EAOC致病機(jī)制的研究提供參考，現(xiàn)報道如下。

1 資料與方法

1.1 一般資料

選取2019年8月至2021年4月于西安國際醫(yī)學(xué)中心醫(yī)院治療的EAOC患者及單純EMS患者。納入標(biāo)準(zhǔn)：①均于西安國際醫(yī)學(xué)中心醫(yī)院接受手術(shù)治療；②符合EAOC或單純EMS診斷標(biāo)準(zhǔn)；③近6個月無激素使用史。排除標(biāo)準(zhǔn)：①術(shù)前行化療或其他治療；②合并其他惡性腫瘤；③合并其他內(nèi)分泌疾病；④病歷資料不全。根據(jù)納入與排除標(biāo)準(zhǔn)，本研究共納入60例EMS患者及60例EAOC患者，收集EMS組織及EAOC組織。EAOC組年齡≥60歲34例，＜60歲26例；病理類型：卵巢透明細(xì)胞癌29例，子宮內(nèi)膜樣癌31例；臨床分期：Ⅰ～Ⅱ期19例，Ⅲ～Ⅳ期41例；淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移36例。

1.2 試驗試劑

兔人E-cadherin單克隆抗體（ab40277）、兔人N-cadherin多克隆抗體（ab18203）、兔人Snail多克隆抗體（ab180714）。

1.3 免疫組織化學(xué)染色法及結(jié)果判定

采用免疫組織化學(xué)鏈霉抗生物素蛋白-過氧化物酶（streptavidin-peroxidase，SP）法處理組織，具體方法如下：石蠟組織進(jìn)行4 μm的連續(xù)切片，將切片貼附于掛膠片上，使用67℃烤片機(jī)烤1 h，二甲苯脫蠟，梯度酒精脫苯水化，使用磷酸鹽緩沖液（phosphate buffered solution，PBS）沖洗3次，每次沖洗3 min。沖洗結(jié)束后使用pH=8.0的乙二胺四乙酸（ethylenediaminetetraacetic acid，EDTA）修復(fù)液進(jìn)行高壓修復(fù)，修復(fù)時間為2 min。自然冷卻至室溫后，PBS沖洗3次，每次沖洗3 min。使用3%的雙氧水封閉10 min阻斷內(nèi)源性過氧化物酶，PBS沖洗3次，每次沖洗3 min。去除PBS后，滴加對應(yīng)工作濃度的抗體試劑，在37℃的溫箱中孵育1 h，PBS沖洗3次，每次沖洗3 min。去除PBS后，滴加抗體工作液，室溫孵育22 min，PBS沖洗3次，每次沖洗3 min。使用二氨基聯(lián)苯胺進(jìn)行顯色，直至顯微鏡下出現(xiàn)棕黃色顆粒時，終止顯色，之后充分水洗，蘇木素復(fù)染細(xì)胞核，梯度酒精脫水，再使用二甲苯透明。

結(jié)果判斷：E-cadherin、N-cadherin蛋白陽性為細(xì)胞膜出現(xiàn)黃色顆粒，Snail蛋白陽性為細(xì)胞核和（或）細(xì)胞質(zhì)內(nèi)出現(xiàn)黃色顆粒。每張切片在高倍鏡（×400）下隨機(jī)選取5個視野，每個視野計數(shù)100個細(xì)胞，觀察細(xì)胞染色強(qiáng)度與陽性細(xì)胞百分比。染色強(qiáng)度評分標(biāo)準(zhǔn)：無黃色顆粒記0分，淡黃色記1分，棕黃色記2分，棕褐色記3分；染色陽性細(xì)胞百分比評分：≤25%為1分，＞25%且≤50%為2分，＞50%且≤75%為3分，＞75%為4分。染色強(qiáng)度與陽性細(xì)胞百分比相乘為積分，根據(jù)染色結(jié)果評估積分，其中0～2分為陰性，積分≥3分為陽性，其中3～4分為弱陽性，5～8分為陽性，≥9分為強(qiáng)陽性。

1.4 觀察指標(biāo)

比較兩組患者各自組織中E-cadherin、N-cadherin、Snail蛋白陽性表達(dá)率。統(tǒng)計不同臨床特征EAOC患者蛋白陽性表達(dá)率，并對其進(jìn)行多因素分析，分析不同蛋白陽性表達(dá)與患者臨床特征的相關(guān)性。

1.5 統(tǒng)計學(xué)方法

2 結(jié)果

2.1 EMT相關(guān)蛋白陽性表達(dá)情況的比較

EAOC組織中E-cadherin蛋白陽性表達(dá)率低于EMS組織，而N-cadherin及Snail蛋白陽性表達(dá)率均高于EMS組織（

P

＜0.05）。（表1）

表1 兩組患者EMT相關(guān)蛋白陽性表達(dá)情況的比較[ n（%）]

2.2 EAOC患者EAOC組織中EMT相關(guān)蛋白陽性表達(dá)影響因素的單因素分析

不同年齡、病理類型EAOC患者EAOC組織中EMT相關(guān)蛋白陽性表達(dá)率比較，差異均無統(tǒng)計學(xué)意義（

P

＞0.05）。臨床分期為Ⅰ～Ⅱ期、無淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移的EAOC患者EAOC組織中E-cadherin蛋白陽性表達(dá)率均高于臨床分期為Ⅲ～Ⅳ期、有淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移的患者，差異均有統(tǒng)計學(xué)意義（

χ

=60.00、41.71，

P

＜0.05）；臨床分期為Ⅰ～Ⅱ期、無淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移的EAOC患者EAOC組織中N-cadherin蛋白陽性表達(dá)率均低于Ⅲ～Ⅳ期、有淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移的患者，差異均有統(tǒng)計學(xué)意義（

χ

=6.16、15.13，

P

＜0.05）；無淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移的EAOC患者EAOC組織中Snail蛋白陽性表達(dá)率低于有淋巴轉(zhuǎn)移患者，差異有統(tǒng)計學(xué)意義（

χ

=5.68，

P

＜0.05）。（表2）

表2 EAOC患者EAOC組織中EMT相關(guān)蛋白陽性表達(dá)影響因素的單因素分析（ n=60）

2.3 EAOC患者EAOC組織中EMT相關(guān)蛋白陽性表達(dá)率影響因素的多因素分析

將單因素分析中差異有統(tǒng)計學(xué)意義的臨床分期（Ⅰ～Ⅱ期=0，Ⅲ～Ⅳ期=1）、淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移（有=0，無=1）作為自變量，EMT相關(guān)蛋白的陽性表達(dá)作為因變量納入多因素Logistic回歸分析，結(jié)果顯示，臨床分期為Ⅲ～Ⅳ期、有淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移均是E-cadherin蛋白陽性表達(dá)的獨立危險因素（OR=1.531，95%CI：1.166～2.011，

P

＜0.05）、（OR=1.425，95%CI：1.047～1.938，

P

＜0.05）；臨床分期不是N-cadherin蛋白陽性表達(dá)的影響因素，無淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移是N-cadherin蛋白陽性表達(dá)的獨立危險因素（OR=1.533，95%CI：1.100～2.135，

P

＜0.05）；無淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移是Snail蛋白陽性表達(dá)的獨立危險因素（OR=1.612，95%CI：1.041～2.496，

P

＜0.05）。

2.4 EAOC患者EMT相關(guān)蛋白陽性表達(dá)與其臨床特征相關(guān)性分析

Spearman相關(guān)性分析顯示，EAOC患者EAOC組織E-cadherin蛋白陽性表達(dá)與其臨床分期及淋巴轉(zhuǎn)移情況呈負(fù)相關(guān)（

r

=-0.36、-0.44，

P

＜0.05），而N-cadherin蛋白陽性表達(dá)與其臨床分期及淋巴轉(zhuǎn)移情況呈正相關(guān)（

r

=0.42、0.37，

P

＜0.05），Snail蛋白陽性表達(dá)與其淋巴轉(zhuǎn)移情況呈正相關(guān)（

r

=0.34，

P

＜0.05）。

3 討論

EMT是EMS侵襲與轉(zhuǎn)移的重要機(jī)制，研究EMT相關(guān)蛋白與EAOC的關(guān)系可進(jìn)一步闡釋EAOC致病機(jī)制，對疾病的治療及預(yù)防起著至關(guān)重要的作用。EMT是指上皮細(xì)胞轉(zhuǎn)變?yōu)殚g質(zhì)細(xì)胞的過程，上皮細(xì)胞具有明顯的極性及緊密的黏附性，而間質(zhì)細(xì)胞則缺乏極性并具有較強(qiáng)的運動性，當(dāng)上皮細(xì)胞喪失極性，間質(zhì)細(xì)胞獲得轉(zhuǎn)移能力時，細(xì)胞開始進(jìn)入EMT狀態(tài)。

近年來，有許多研究發(fā)現(xiàn)，EMT不僅與傷口愈合、胚胎形成、器官纖維化等反應(yīng)相關(guān)，其還在惡性腫瘤增殖、侵襲與轉(zhuǎn)移中發(fā)揮重要功效。黏蛋白參與細(xì)胞生長、分化、延伸及移動，而E-cadherin、N-cadherin及P-cadherin均屬于經(jīng)典黏蛋白。E-cadherin是維持上皮細(xì)胞表型的單次跨膜糖蛋白，是細(xì)胞間重要的黏附分子，N-cadherin主要參與神經(jīng)細(xì)胞的選擇，并在促進(jìn)神經(jīng)管形成中發(fā)揮功效。鋅轉(zhuǎn)錄因子Snail是促使EMT發(fā)生的關(guān)鍵因子，并能促進(jìn)E-cadherin蛋白表達(dá)?？偠灾珽-cadherin、N-cadherin及Snail在EMT中均發(fā)揮重要作用。而E-cadherin表達(dá)下調(diào)，N-cadherin及Snail表達(dá)上調(diào)是EMT促進(jìn)上皮源性腫瘤發(fā)生的公認(rèn)標(biāo)志改變。本研究發(fā)現(xiàn)，與單純的EMS組織相比，EAOC組織中E-cadherin蛋白陽性表達(dá)率降低，而N-cadherin及Snail蛋白陽性表達(dá)率均上升，與上述研究結(jié)論相吻合。Logistic回歸分析結(jié)果顯示，臨床分期為Ⅲ～Ⅳ期、有淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移是E-cadherin蛋白陽性表達(dá)的獨立危險因素，無淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移是N-cadherin、Snail蛋白陽性表達(dá)的獨立危險因素，表明臨床分期、淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移對EAOC患者EMT相關(guān)蛋白水平存在不同影響。

本研究Spearman相關(guān)性分析顯示，EAOC患者EAOC組織E-cadherin蛋白陽性表達(dá)與其臨床分期及淋巴轉(zhuǎn)移情況呈負(fù)相關(guān)（

r

=-0.36、-0.44，

P

＜0.05），而N-cadherin蛋白陽性表達(dá)與其臨床分期及淋巴轉(zhuǎn)移情況呈正相關(guān)（

r

=0.42、0.37，

P

＜0.05），Snail蛋白陽性表達(dá)與其淋巴轉(zhuǎn)移情況呈正相關(guān)（

r

=0.34，

P

＜0.05）。但由于本研究樣本量有限，未能對EMT相關(guān)蛋白間的相互作用進(jìn)行分析，后續(xù)應(yīng)對此方面進(jìn)行深入研究。

綜上所述，EAOC患者EAOC組織與EMS患者EMS組織中E-cadherin、N-cadherin及Snail蛋白陽性表達(dá)差異顯著，且經(jīng)Spearman相關(guān)性分析，E-cadherin、N-cadherin及Snail蛋白陽性表達(dá)與EAOC患者臨床分期及淋巴轉(zhuǎn)移有一定相關(guān)性，說明EAOC的進(jìn)展可能與EMT相關(guān)蛋白的表達(dá)存在密切聯(lián)系。