HPLC法測定袋料栽培茯苓中茯苓酸的含量

涂永勤 邢康康 陳仕江

摘要：目的 建立袋料栽培茯苓中茯苓酸的測定方法，為袋料栽培茯苓的臨床應用提供依據(jù)。方法 采用HPLC測定，色譜柱：（Waters X-Bridge Shied RP C18 250 mm×4.6 mm，5 μm）;流動相乙腈-0.1%乙酸溶液，梯度洗脫;流速：1.0 mL/min;進樣量10 μL;柱溫：30℃;檢測波長210nm。結果 各茯苓樣品中茯苓酸的含量以野生茯苓最高為0.038%，其次是袋料栽培（室內(nèi)發(fā)菌）為0.034%，樹蔸栽培為0.028%、椴木栽培、袋料栽培（室外發(fā)菌）茯苓的含量在0.019～0.022之間，差異不明顯。結論 該方法穩(wěn)定可靠，重復性好，可以作為評價茯苓質量的方法。袋料栽培茯苓可以替代傳統(tǒng)栽培茯苓。

關鍵詞：茯苓;HPLC;含量測定;茯苓酸

中圖分類號：R285.5?? 文獻標志碼：A?? 文章編號：1007-2349（2021）12-0076-03

Content of Pachymic Acid in Bag-grown Poria Cocos Determined with HPLC Method

TU Yong-qin， XING Kang-kang， CHEN Shi-jiang

（Chongqing Research Institute of Traditional Chinese Medicine， Chongqing 400065.China）

【Abstract】Objective： To establish a method for the determination of pachymic acid in bag-grown Poria cocos， and provide a basis for the clinical application of bag-grown Poria cocos. Methods： Determined by HPLC， chromatographic column was Waters X-Bridge Shied RP C18 250 mm×4.6 mm， 5 μm， and mobile phase acetonitrile-0.1% acetic acid solution， with gradient elution， 1.0 mL/min of flow rate， 10 μL of sample volume， at 30℃ of column temperature and 210nm of detection wavelength. Results： The content of pachymic acid in each Poria sample was 0.038% in wild Poria， followed by bag material cultivation （indoor fungus） at 0.034%，and? arborum material cultivation at 0.028%， and the content of linden wood cultivation and bag material cultivation （outdoor fungus） was between 0.019 and 0.022， and the difference was not obvious. Conclusion： The method is stable and reliable， with good repeatability， and can be used as a method to evaluate the quality of Poria cocos. The bag-grown Poria can replace traditional cultivation of Poria.

【Key words】Poria; HPLC; Assay; Pachymic Acid

茯苓是多孔菌科臥孔屬真菌茯苓 Poria cocos（Schw.）Wolf 的干燥菌核，其菌體寄生于松木的根莖生長而成。茯苓史載于《神龍本草》，列為上品[1];為歷年版《中國藥典》一部所收載。茯苓具有滲濕利尿、和胃健脾、寧心安神的功效[2]。現(xiàn)代臨床研究表明，茯苓及其配方具有抗疲勞、抗腦卒中后抑郁、治療慢性腎小球腎炎、腹瀉等療效[3]。茯苓廣泛應用于藥品和食品行業(yè)，有十藥九茯苓之說，為中藥大品種。由于過度采挖，野生茯苓藥材已十分罕見，現(xiàn)在臨床所用藥材絕大多為人工栽培。傳統(tǒng)栽培茯苓方法是砍伐松木作為菌體繁殖材料，每年需要消耗大量的松木。松樹篼栽亦可作為栽培茯苓的原料。尋找替代傳統(tǒng)松木栽培茯苓的原料是廣大科研人員的研究目標。作者開展了袋料配方栽培茯苓的研究工作，取得了成功，獲得大量袋料栽培茯苓產(chǎn)品，有望代替?zhèn)鹘y(tǒng)松木栽培茯苓，以緩解砍伐松樹的壓力。為了確保袋料栽培茯苓的質量，本研究采用HPLC法測定袋料栽培及來自國內(nèi)多個產(chǎn)區(qū)用傳統(tǒng)松木栽培茯苓7個樣品中茯苓酸含量，結果表明：袋料栽培茯苓中茯苓酸的含量高于傳統(tǒng)松木栽培茯苓，為袋料栽培茯苓的臨床應用提供了科學依據(jù)。

1 實驗材料

1.1 實驗儀器與試劑 Agilent 1200高效液相色譜儀，包括真空脫氣機G1322A JP62356715;四元泵G1311A DE62959222;自動進樣器G1329A DE64760202;柱溫箱G1316ADE63060935;DAD檢測器G1315B DE63057698及ChemStation工作站（美國Agilent公司）、Alltech ELSD 2000ES檢測器（美國奧泰公司）、KQ-250DB型數(shù)控超聲波清洗儀（昆山市超聲儀器有限公司）、BS223S型電子天平（萬分之一）（北京賽多利斯儀器系統(tǒng)有限公司）、Meli-Q超純水儀（德國默克密理博有限公司）

1.2 試藥與試劑 對照品：茯苓酸（批號MUST-19081510，PURITY：≥99.80%），由成都曼思特生物科技有限公司提供。

試劑：甲醇、乙腈（HPLC級）購自美國TEDIA公司，乙酸、甲醇（AR級）購自成都科隆化學品有限公司。

1.3 實驗藥材 茯苓藥材分別采自內(nèi)安徽、湖北、重慶等地，由重慶市中藥研究院劉翔副研究員鑒定為多孔菌科真菌茯苓Poria cocos（Schw.）Wolf的干燥菌核。樣本產(chǎn)地明細見表1。

2 實驗方法

2.1 色譜條件 色譜柱：（Waters X-Bridge Shied RP C18 250 mm × 4.6 mm，5 μm）;流動相：以乙腈為流動相A，0.1%乙酸水溶液為流動相B，按表2中的規(guī)定進行梯度洗脫;流速：1.0 mL/min;柱溫：30℃;進樣量10 μL;DAD檢測器參數(shù)：檢測波長210 nm。

2.2 試驗溶液的制備 對照品溶液的制備：精密稱取對照品適量，加甲醇制成每1 mL含0.200mg茯苓酸對照品的溶液，即得。

供試品溶液的制備：取本品粉末約1.0 g，精密稱定，置具塞錐形瓶中，精密加入甲醇30 mL，密塞，稱定重量，超聲處理（功率300W，頻率40kHz）30 min，放冷，再稱定重量，用溶劑補足失重，搖勻，濾過，取續(xù)濾液，即得。

2.3 線性關系考察 精密吸取2.2項下稀釋的不同濃度梯度的對照品標準溶液按2.1項下色譜條件測定，平行測定3次，取平均峰面積。以進樣量（X，μg）為橫坐標，峰面積（Y）為縱坐標繪制標準曲線并進行回歸計算，得到茯苓酸的回歸方程。茯苓酸的回歸方程：Y=5.535+E07X+156.7，R2=0.999，線性范圍在0.42～42 mg/L之間。2.4 精密度試驗 精密吸取2.2項下制備的茯苓樣品溶液，按2.1項下色譜條件連續(xù)進樣6次，記錄茯苓酸的保留時間和相對峰面積。結果茯苓酸的相對保留時間和共有峰峰面積RSD均小于1.5%。

2.5 重復性試驗 取同一批茯苓樣品6份，按2.2項下方法平行制備6份供試品溶液，按2.1項下色譜條件進行測定，記錄茯苓酸的相對保留時間和相對峰面積。結果顯示茯苓酸的相對保留時間和相對峰面積RSD均小于2%。

2.6 穩(wěn)定性試驗 按2.2項下方法制備的同一樣品溶液，室溫放置，按2.1項下色譜條件分別于0，2，4，6，8，10，12，24 h進樣測定，記錄茯苓酸的相對保留時間和相對峰面積。結果顯示茯苓酸的相對保留時間和相對峰面積RSD均小于1%，表明樣品溶液在24 h內(nèi)穩(wěn)定。

2.7 加樣回收率 精密稱取已知含量的樣品6份，精密稱定并加入一定量茯苓酸對照品，按2.2項下方法制備樣品，加樣回收率按如下公式計算：回收率（%）=（測得量-已知樣品中量）/加入量×100。結果顯示上述茯苓酸的平均加樣回收率均高于95%，其RSD均小于2%。

2.8 樣品測定 不同產(chǎn)地的樣品，按2.2項下方法制備樣品溶液，按2.1項下色譜條件測定，結果如表3。

3 討論

本實驗經(jīng)過篩選確定色譜條件：色譜柱：Waters X-Bridge Shied RP C18 250 mm×4.6 mm，5 μm;流動相：乙腈-0.1%乙酸溶液，梯度洗脫;流速：1.0 mL/min;進樣量10 μL;柱溫：30℃;DAD檢測器;檢測波長210nm。具有較好分離效果。

茯苓酸是茯苓中特有的一種四環(huán)三萜化合物，是茯苓的主要活性成分之一。茯苓酸具有抗腫瘤、抗炎、抗氧化、降血糖、鎮(zhèn)靜催眠等方面的藥理作用[3]。含量測定結果表明不同栽培方式對茯苓酸有顯著影響。各茯苓樣品中茯苓酸的含量以野生茯苓最高為0.038%，其次是袋料栽培（室內(nèi)發(fā)菌）茯苓0.034%，樹蔸栽培茯苓為0.028%，椴木栽培、袋料栽培（室外發(fā)菌）茯苓的含量為0.019-0.022%之間，差異不明顯。袋料栽培茯苓室內(nèi)發(fā)菌>室外發(fā)菌，可能由于室內(nèi)溫度較高，有利于茯苓酸的合成或積累。因此，袋料栽培（室內(nèi)發(fā)菌）茯苓的質量優(yōu)于傳統(tǒng)椴木栽培茯苓，從而為袋料栽培茯苓的應用前景提供科學依據(jù)。

參考文獻：

[1]羅大倫.《神農(nóng)本草經(jīng)》里的中藥智慧茯苓[J].食品與健康，2012，9（3）：36-37.

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（收稿日期：2021-07-19）