免疫層析技術(shù)在檢測(cè)食品中硝基呋喃類(lèi)藥物的應(yīng)用

夏 菲，劉秀英，高 雪，湯立軍，李學(xué)鵬，勵(lì)建榮

（渤海大學(xué)食品科學(xué)與工程學(xué)院 遼寧省食品安全重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室生鮮農(nóng)產(chǎn)品貯藏加工及安全控制技術(shù)國(guó)家地方聯(lián)合工程研究中心 遼寧錦州121013）

硝基呋喃類(lèi)藥物屬于人工合成的廣譜抗生素，價(jià)格低廉、抗菌效果好，被廣泛的應(yīng)用于醫(yī)療和獸醫(yī)行業(yè)，用于治療胃腸道感染和預(yù)防病變?cè)葱晕⑸锔腥綶1]。由于硝基呋喃類(lèi)藥物具有致突變性和致癌性[2-4]，因此，目前包括中國(guó)在內(nèi)的許多國(guó)家已禁止將硝基呋喃類(lèi)藥物用于動(dòng)物性食品的生產(chǎn)中，然而，這類(lèi)藥物的非法使用事件仍有發(fā)生。開(kāi)發(fā)高效的檢測(cè)方法用于監(jiān)測(cè)食品中硝基呋喃類(lèi)藥物的殘留，對(duì)保障消費(fèi)者健康及生命安全具有重要意義。

硝基呋喃類(lèi)藥物的檢測(cè)方法多種多樣，最為常用的方法是儀器分析法，如液相色譜質(zhì)譜法[5]、液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜法[6-7]、超高效液相色譜串聯(lián)質(zhì)譜法[8-10]、四極串聯(lián)質(zhì)譜法[11]等。這些方法雖然準(zhǔn)確性和靈敏度高，但是儀器價(jià)格昂貴，需要專(zhuān)業(yè)的技術(shù)人員操作，不適用于現(xiàn)場(chǎng)檢測(cè)。以酶作為生物標(biāo)記物，利用抗體和抗原間的特異性為基礎(chǔ)的酶聯(lián)免疫分析法（Enzyme-linked immunosorbent assay，ELISA）也是檢測(cè)硝基呋喃類(lèi)藥物的一種重要手段，其具有高通量篩選能力、檢測(cè)速度快等優(yōu)點(diǎn)，被廣泛地應(yīng)用于食品中硝基呋喃類(lèi)藥物殘留的檢測(cè)[12-13]，然而存在檢測(cè)穩(wěn)定性不理想，易出現(xiàn)假陽(yáng)性結(jié)果等問(wèn)題[14-15]，這些不足限制了其發(fā)展。目前迫切需要一種快速、簡(jiǎn)便、低成本、高效率的現(xiàn)場(chǎng)檢測(cè)方法用于硝基呋喃類(lèi)藥物殘留的大規(guī)模篩查。

免疫層析技術(shù)（Immunochromatography assay，ICA）的出現(xiàn)在很大程度上促進(jìn)了硝基呋喃類(lèi)藥物殘留現(xiàn)場(chǎng)快速檢測(cè)技術(shù)的發(fā)展。該技術(shù)不僅操作過(guò)程簡(jiǎn)單、檢測(cè)迅速，還具有靈敏度和穩(wěn)定性高、特異性強(qiáng)、成本低等優(yōu)點(diǎn)。近年來(lái)，免疫層析技術(shù)成為研究熱點(diǎn)，被廣泛地應(yīng)用于硝基呋喃類(lèi)藥物母體及其代謝物的測(cè)定。本文綜述免疫層析技術(shù)的基本原理與優(yōu)點(diǎn)，重點(diǎn)介紹利用不同的信號(hào)標(biāo)記物構(gòu)建的免疫層析技術(shù)在食品中硝基呋喃類(lèi)藥物殘留的快速檢測(cè)，并展望未來(lái)的發(fā)展趨勢(shì)。

1 硝基呋喃類(lèi)藥物及其代謝衍生物

硝基呋喃類(lèi)藥物是以五元呋喃環(huán)為基礎(chǔ)骨架，在環(huán)的五位上都連有一個(gè)硝基而得到的一類(lèi)化合物。該類(lèi)藥物為黃色粉末狀晶體，幾乎不溶于水，在N，N-二甲基甲酰胺（DMF）中溶解性極高，味微苦或無(wú)味。目前應(yīng)用最廣泛的硝基呋喃類(lèi)藥物主要包括呋喃唑酮（Furazolidone，F(xiàn)ZD）、呋喃它酮（Furaltadone，F(xiàn)TD）、呋喃妥因（Nitrofurantoin，NFT）和呋喃西林（Nitrofurazone，NFZ）。然而，硝基呋喃類(lèi)母體藥物在體內(nèi)代謝迅速，半衰期短，高度不穩(wěn)定[16-17]。動(dòng)物攝入體內(nèi)后快速將母體藥物分解為代謝衍生物[18]，有研究表明單一測(cè)量硝基呋喃類(lèi)母體藥物殘留情況并不準(zhǔn)確[19]。3-氨基-2-惡唑烷酮（3-Amino-2-oxazolidone，AOZ）、3-氨基-5-嗎啉甲基-2-惡唑烷酮（3-Amino-5-morp-holino-methyl-1，3-oxazolidinone，AMOZ）、1-氨基乙內(nèi)酰脲（1-Aminohydantoin，AHD）和氨基脲（Semicarbazide，SEM）分別是呋喃唑酮、呋喃它酮、呋喃妥英和呋喃西林的代謝物。這些代謝物及其母體結(jié)構(gòu)式見(jiàn)圖一。硝基呋喃類(lèi)代謝物的穩(wěn)定性高，與動(dòng)物體內(nèi)肌肉組織中的蛋白結(jié)合形成的代謝結(jié)合物長(zhǎng)達(dá)數(shù)月之久，因此，檢測(cè)硝基呋喃類(lèi)母體藥物的代謝衍生物是監(jiān)測(cè)硝基呋喃類(lèi)藥物殘留情況的一種重要手段[20-21]。

2 免疫層析技術(shù)

2.1 免疫層析技術(shù)的檢測(cè)原理

免疫層析技術(shù)是一種將色譜法與免疫學(xué)反應(yīng)相結(jié)合的快速檢測(cè)技術(shù)。基于該技術(shù)開(kāi)發(fā)的試紙條通常由樣品墊、共軛墊、硝化纖維素膜和吸收墊4 個(gè)部分組成，這些部分被依次層壓于一片塑料襯墊上[22-23]。圖2 為免疫層析試紙條的組成與結(jié)構(gòu)示意圖。通常情況下，免疫層析試紙條以固定有檢測(cè)線(xiàn)（包被抗體或抗原）和質(zhì)控線(xiàn)（抗抗體或A 蛋白）的硝化纖維素膜為固定相，以樣品溶液為流動(dòng)相，通過(guò)毛細(xì)管作用使待測(cè)物在試紙條上移動(dòng)。在試紙條構(gòu)建過(guò)程中，利用不同的信號(hào)標(biāo)記物標(biāo)記抗體（抗原），并將其固定于共軛墊作為檢測(cè)信號(hào)的來(lái)源。對(duì)于具有多個(gè)抗原位點(diǎn)的大型分析物的檢測(cè)，通常使用“三明治”形式的雙抗夾層免疫層析分析技術(shù)，即首先將標(biāo)記抗體固定于共軛墊，當(dāng)含有目標(biāo)分析物的樣品溶液加入樣品墊中時(shí)，目標(biāo)分析物在共軛墊與標(biāo)記抗體形成復(fù)合物，并遷移到吸收墊中。在遷移過(guò)程中，上述復(fù)合物中的目標(biāo)分析物與檢測(cè)線(xiàn)上的檢測(cè)抗體發(fā)生免疫反應(yīng)，形成夾層。而檢測(cè)線(xiàn)上過(guò)量的游離復(fù)合物則被質(zhì)控線(xiàn)上其相應(yīng)的抗體所捕獲，形成可視化的質(zhì)控線(xiàn)。若檢測(cè)線(xiàn)和質(zhì)控線(xiàn)都顯現(xiàn)，檢測(cè)結(jié)果為陽(yáng)性；若樣品溶液中不存在目標(biāo)分析物，標(biāo)記抗體上行至質(zhì)控線(xiàn)，檢測(cè)線(xiàn)不顯現(xiàn)，檢測(cè)結(jié)果為陰性。對(duì)于具有較低分子質(zhì)量和單一抗原決定因子的小分析物的檢測(cè)，如硝基呋喃類(lèi)母體藥物及其代謝物等，由于不能同時(shí)與兩種抗體相結(jié)合，大多采用競(jìng)爭(zhēng)性的免疫層析技術(shù)，其檢測(cè)形式又通常分為兩種。其一，目標(biāo)分析物被信號(hào)材料標(biāo)記并附著在共軛墊上，對(duì)于陰性樣品，標(biāo)記的目標(biāo)分析物會(huì)穿過(guò)條帶，依次結(jié)合檢測(cè)線(xiàn)和質(zhì)控線(xiàn)上相應(yīng)的抗體，檢測(cè)線(xiàn)和質(zhì)控線(xiàn)都會(huì)顯現(xiàn)。對(duì)于陽(yáng)性樣品，樣品中未標(biāo)記的分析物與標(biāo)記的分析物發(fā)生競(jìng)爭(zhēng)，未標(biāo)記的分析物結(jié)合在檢測(cè)線(xiàn)上，標(biāo)記分析物與質(zhì)控線(xiàn)上抗體結(jié)合。此時(shí)只會(huì)有質(zhì)控線(xiàn)顯現(xiàn)。其二，當(dāng)使用信號(hào)標(biāo)記物標(biāo)記的抗體固定于共軛墊，其檢測(cè)線(xiàn)和質(zhì)控線(xiàn)分別固定有包被抗原和能與標(biāo)記抗體反應(yīng)的抗體時(shí)，若樣品溶液中不存在目標(biāo)分析物，則檢測(cè)線(xiàn)和質(zhì)控線(xiàn)都會(huì)顯現(xiàn)。若樣品溶液中存在目標(biāo)分析物，目標(biāo)分析物與檢測(cè)線(xiàn)上固定的包被抗原競(jìng)爭(zhēng)結(jié)合有限的標(biāo)記抗體，檢測(cè)線(xiàn)的顯現(xiàn)程度與樣品溶液中目標(biāo)分析物的含量成反比[24-27]。

圖1 4 種硝基呋喃類(lèi)母體化合物及其代謝物的化學(xué)結(jié)構(gòu)Fig.1 The chemical structures of four nitrofuran parent compounds and their metabolites

圖2 免疫層析試紙條的組成與結(jié)構(gòu)示意圖Fig.2 Schematic diagram of composition and structure of immunochromatographic strip

2.2 免疫層析技術(shù)的優(yōu)點(diǎn)

近年來(lái)，免疫層析技術(shù)因具有諸多優(yōu)點(diǎn)而在食品中硝基呋喃類(lèi)藥物的檢測(cè)方面成為研究熱點(diǎn)。首先，該技術(shù)不需要昂貴的儀器設(shè)備，檢測(cè)成本較低，適用于現(xiàn)場(chǎng)檢測(cè)；其次，該技術(shù)不需要繁瑣的樣品前處理過(guò)程，整個(gè)檢測(cè)過(guò)程可在幾分鐘內(nèi)完成，操作簡(jiǎn)單，檢測(cè)速度快[28-29]。第三，該技術(shù)可以將標(biāo)記材料與多種硝基呋喃類(lèi)藥物抗體結(jié)合，最終在試紙條上同時(shí)產(chǎn)生相應(yīng)的檢測(cè)信號(hào)，說(shuō)明該技術(shù)可對(duì)硝基呋喃類(lèi)藥物進(jìn)行多殘留分析，進(jìn)而實(shí)現(xiàn)高通量篩查[30]。最后，該技術(shù)不僅可以在基于抗原抗體的免疫反應(yīng)下確保檢測(cè)的特異性，而且還可以通過(guò)選擇各種新型免疫標(biāo)記物，放大抗原抗體之間的反應(yīng)結(jié)果，提高檢測(cè)的靈敏度[31-32]。

3 免疫層析技術(shù)在食品中硝基呋喃藥物殘留檢測(cè)中的應(yīng)用

在免疫層析分析技術(shù)中，標(biāo)記材料的選擇至關(guān)重要。標(biāo)記材料的性能和信號(hào)強(qiáng)度決定了檢測(cè)結(jié)果的讀取模式及靈敏度。目前，用于分析食品中硝基呋喃類(lèi)藥物的免疫層析技術(shù)所用標(biāo)記材料主要包括熒光材料、膠體金、磁珠等。本文重點(diǎn)圍繞這幾種類(lèi)型展開(kāi)綜述。

3.1 熒光物質(zhì)標(biāo)記的免疫層析技術(shù)

3.1.1 量子點(diǎn)標(biāo)記的免疫層析技術(shù) 量子點(diǎn)（Quantum dots，QDs），又稱(chēng)無(wú)機(jī)半導(dǎo)體晶體，是一類(lèi)由元素周期表中II-VI 或III-V 族元素組成的熒光納米顆粒。與傳統(tǒng)的熒光團(tuán)相比，量子點(diǎn)具有熒光發(fā)射光譜窄、量子產(chǎn)率高、穩(wěn)定性和生物相容性好、抗光漂白性強(qiáng)和熒光壽命長(zhǎng)等優(yōu)點(diǎn)[33-36]，因此成為了免疫層析技術(shù)中一種理想的熒光標(biāo)記物質(zhì)。利用QDs 構(gòu)建免疫層析技術(shù)檢測(cè)硝基呋喃類(lèi)藥物的相關(guān)報(bào)道較多，所用QDs 主要包括CdSe和CdTe 兩種類(lèi)型。

2017年，Le 等[37]利用表面羧基功能化的CdSe/ZnS QDs 作為熒光信號(hào)，通過(guò)1-（3-二甲氨基丙基）-3-乙基碳二亞胺鹽酸鹽/N-羥基琥珀酰亞胺【1-Ethyl-3-（3-dimethylaminopropyl）carbodiimide/N-Hydroxy succinimide，EDC/NHS】與抗1-氨基乙內(nèi)酰脲-4 硝苯基肟（1-Aminohydantoin-4-nitrophenyl oxime，NPAHD）抗體結(jié)合，建立了一種一步熒光免疫層析法。該方法無(wú)需對(duì)硝基呋喃類(lèi)藥物進(jìn)行衍生化處理，可應(yīng)用于魚(yú)、蟹、蝦動(dòng)物組織中AHD 的快速檢測(cè)。線(xiàn)性檢測(cè)范圍為0.1～100 ng/mL，NPAHD 的目測(cè)檢測(cè)限為3 ng/mL，實(shí)際動(dòng)物組織中的檢測(cè)限（Limit of detection，LOD）為0.14 ng/g。作者還通過(guò)液相色譜串聯(lián)質(zhì)譜法（Liquid chromatography-tandem mass spectrometry，LC-MS/MS）證實(shí)了該方法的可靠性。2017年，Sun 等[38]合成了發(fā)射波長(zhǎng)為605 nm 的CdTe/CdSe 核/殼納米結(jié)構(gòu)QDs，通過(guò)EDC 活化酯法將QDs 與NPAHD 抗體偶聯(lián)，構(gòu)建了一種檢測(cè)鯰魚(yú)、鯉魚(yú)和蝦中AHD 的熒光連接免疫吸附法。線(xiàn)性范圍為0.1～3.0 ng/mL，LOD 為0.06 mg/kg。

2019年，Xie 等[39]采用表面羧基功能化的CdSe/ZnS QDs 熒光標(biāo)記材料建立一種可快速檢測(cè)肌肉及肝臟組織中AMOZ 的熒光免疫層析試紙法，并將該方法應(yīng)用于雞、豬、鯰魚(yú)、鱘魚(yú)、蝦和鯉魚(yú)等實(shí)際樣品中。免疫條帶的目視檢測(cè)限為10 ng/mL，線(xiàn)性范圍為1～30 ng/mL，定量限為0.45 ng/mL，檢測(cè)時(shí)間為10 min。樣品中AMOZ 的回收率在78.6%～108.9%之間，變異系數(shù)（Coefficient of variation，CV）在12%以下，說(shuō)明該試紙對(duì)于動(dòng)物組織中AMOZ 殘留有較好的檢測(cè)能力。

3.1.2 鑭系螯合物標(biāo)記的免疫層析技術(shù) 鑭系螯合物是指一類(lèi)以稀土離子與高吸光系數(shù)配體結(jié)合形成的一種能發(fā)出高強(qiáng)度特征熒光的螯合物[40]。這類(lèi)化合物的斯托克斯（Stoke）位移大，一般在200 nm 以上，可以避免激發(fā)光的干擾以及熒光自猝滅的發(fā)生，進(jìn)而提高測(cè)定結(jié)果的靈敏度。此外，鑭系螯合物的熒光壽命（100～1 000 μs）和背景熒光壽命（1～10 ns）相差很大，能有效降低本底信號(hào)的干擾[41-42]。不同鑭系熒光螯合物的發(fā)射波長(zhǎng)不同，利用鑭系螯合物標(biāo)記的免疫層析技術(shù)可實(shí)現(xiàn)對(duì)多種目標(biāo)分析物的同時(shí)檢測(cè)[43]。最近幾年，以稀土離子及其螯合物作為熒光標(biāo)記物的免疫分析法技術(shù)在食品中硝基呋喃類(lèi)藥物殘留檢測(cè)中的應(yīng)用也有報(bào)道，其中應(yīng)用最多的為銪（Eu）。

2018年，趙義良等[44]采用粒徑為190 nm，表面羧基功能化的銪熒光微球（Eu 螯合物鍵合到聚苯乙烯微球表面）作為抗體標(biāo)記物，通過(guò)EDC 有機(jī)偶聯(lián)劑將銪熒光微球與AOZ 單克隆抗體結(jié)合，開(kāi)發(fā)出一種快速檢測(cè)魚(yú)、蝦等可食用肌肉組織中AOZ 的試劑卡。該試劑卡可在5 min 內(nèi)完成檢測(cè)，LOD 為0.5 μg/kg，與AMOZ、SEM、AHD 的交叉反應(yīng)率低于1%，LC-MS/MS 的檢測(cè)結(jié)果與該試劑卡的結(jié)果完全一致，說(shuō)明該試劑卡檢測(cè)快速，準(zhǔn)確性和靈敏度高。

2019年，Dong 等[45]為了避免抗體在Fab 區(qū)域潛在的結(jié)構(gòu)變化，提高檢測(cè)靈敏度，選擇摻雜聚苯乙烯并經(jīng)羧酸鹽改性的Eu（III）螯合物納米顆粒，采用羊抗鼠免疫球蛋白次級(jí)抗體作為連接Eu（III）螯合物納米顆粒和AHD、AOZ、AMOZ、SEM4 種抗體的中間物質(zhì)，建立了一種可同時(shí)檢測(cè)草魚(yú)中4 種硝基呋喃類(lèi)藥物的多重銪（Eu）納米顆粒免疫層析方法。該試紙條對(duì)AHD、AOZ、AMOZ、SEM 的LOD 分別為0.05，0.1，0.1，0.2 ng/g，檢測(cè)時(shí)間為10 min。該方法與商業(yè)ELISA 試劑盒的檢測(cè)結(jié)果具有良好的線(xiàn)性關(guān)系，說(shuō)明該方法可用于草魚(yú)中多種硝基呋喃類(lèi)藥物代謝物的檢測(cè)。

3.2 膠體金標(biāo)記的免疫層析技術(shù)

膠體金是金鹽被還原成金單質(zhì)后形成的穩(wěn)定、均勻、呈單一分散狀態(tài)并懸浮在液體中的金顆粒懸浮液。膠體金合成方法簡(jiǎn)單，有肉眼可見(jiàn)的顯著紅色，確?，F(xiàn)場(chǎng)檢測(cè)的方便性；而且信號(hào)在產(chǎn)生過(guò)程中無(wú)需繁瑣的孵育、洗滌、酶促反應(yīng)等繁瑣操作過(guò)程，能明顯縮短檢測(cè)時(shí)間。此外，膠體金顆粒提供的納米級(jí)表面能充分加速抗體抗原反應(yīng)，為免疫檢測(cè)提供放大信號(hào)[46-48]。目前，以膠體金為標(biāo)記物的免疫層析技術(shù)報(bào)道最多。

2017年Ding 等[49]制備了一種針對(duì)3-[（4-硝基苯基）-亞甲基]-氨基]-2-惡唑烷酮【3-[（4-Nitrophenyl）methylene]amino]-2 -oxazolidinone，NPAOZ】的超靈敏特異性單克隆抗體（5G12），其半抑制濃度（Half-inhibitory concentration，IC50）為0.2 ng/mL，CV 極低。將膠體金標(biāo)記于5G12 抗體作為檢測(cè)探針，建立快速檢測(cè)鯰魚(yú)中AOZ 的免疫層析法。該方法實(shí)際加標(biāo)樣品的回收率為86.2%～118.5%，CV 為4.3%～9.4%，制備的5G12抗體具有良好的重復(fù)性。實(shí)際樣品中的目測(cè)檢測(cè)限與磷酸緩沖鹽溶液（Phosphate buffer saline，PBS）中的結(jié)果一致，檢測(cè)時(shí)間為10 min。說(shuō)明該方法可作為檢測(cè)鯰魚(yú)樣品中AOZ 的一種快速現(xiàn)場(chǎng)篩選工具。

2017年，Xie 等[50]利用膠體金作為抗體標(biāo)記物，以3-[（4-羧基苯基）-亞甲基]-氨基]-2-惡唑烷酮【3-[（4-Carboxyphenyl）monomethyl]amino-2-oxazolidinone，CPAOZ】 包被抗原作為檢測(cè)線(xiàn)，羊抗鼠免疫球蛋白作為質(zhì)控線(xiàn)，構(gòu)建免疫層析試紙條，用于檢測(cè)雞肉、豬肉、鯉魚(yú)和蝦中AOZ。該試紙條的目測(cè)檢測(cè)限為10 μg/L。當(dāng)用試紙條閱讀器讀數(shù)時(shí)，實(shí)際動(dòng)物組織樣品中的LOD 和定量限（Limit of quantitation，LOQ）分別達(dá)0.15 μg/kg和0.31 μg/kg。此外，作者還通過(guò)LC-MS/MS 證實(shí)該方法在實(shí)際動(dòng)物中的適用性。

2018年，Dou 等[51]研制出檢測(cè)奶粉、蝦、雞、魚(yú)、豬肉中AOZ 的新型信號(hào)增強(qiáng)免疫層析試紙，利用金納米粒子分別偶聯(lián)抗CPAOZ 抗體（一抗）和羊抗鼠免疫球蛋白（二抗）形成兩種探針，并固定于共軛墊的不同位置，當(dāng)有目標(biāo)溶液流過(guò)時(shí)，一抗和二抗通過(guò)特異性識(shí)別自組裝形成一種能聚集大量金納米顆粒的網(wǎng)絡(luò)結(jié)構(gòu)復(fù)合物，最終在檢測(cè)線(xiàn)實(shí)現(xiàn)信號(hào)放大的作用，該方法通過(guò)降低抗體用量提高方法的靈敏度。該法對(duì)PBS 中CPAOZ 的LOD 和LOQ 分別為0.13 ng/mL 和0.42 ng/mL，其靈敏度比傳統(tǒng)的金免疫層析提高5 倍；實(shí)際樣品中AOZ 的靈敏度為0.44 ng/mL，回收率為87%～120%，證實(shí)該方法在真實(shí)樣品中的實(shí)用性。

3.3 磁珠標(biāo)記的免疫層析技術(shù)

磁珠標(biāo)記物主要由磁性元素（如Fe，Ni，Co）及其氧化物組成。通常情況下，研究人員主要借助磁珠標(biāo)記物的磁性開(kāi)發(fā)樣品前處理技術(shù)，在外加磁鐵的作用下，可快速將復(fù)合體系中被磁珠標(biāo)記的物質(zhì)分離出來(lái)。然而，磁珠標(biāo)記物自身具有較強(qiáng)的顏色屬性，若將其應(yīng)用于免疫層析技術(shù)中，磁珠標(biāo)記物的聚集可在試紙條上呈現(xiàn)一條可視化條帶[52-53]。近年來(lái)，有研究者將磁珠標(biāo)記物的顯色屬性引入免疫層析技術(shù)中。

圖3 基于信號(hào)增強(qiáng)型金納米顆粒的免疫層析示意圖[51]Fig.3 Schematic diagram of immunochromatography based on signal-enhanced gold nanoparticles[51]

2016年，Lu 等[54]建立了可單一或同時(shí)檢測(cè)多種硝基呋喃類(lèi)藥物的多重免疫層析技術(shù)，采用羧基化的磁珠與抗硝基呋喃類(lèi)藥物代謝物的衍生化抗體共價(jià)偶聯(lián)作為檢測(cè)探針，通過(guò)羧基苯甲醛修飾的萊克多巴胺與硝基呋喃類(lèi)藥物代謝物反應(yīng)，形成具有兩種功能結(jié)構(gòu)的的混合物（萊克多巴胺部分和硝基呋喃類(lèi)藥物代謝物部分），并將抗多巴胺單克隆抗體和羊抗鼠免疫球蛋白（IgG）分別噴涂于硝酸纖維素膜形成檢測(cè)線(xiàn)與質(zhì)控線(xiàn)，當(dāng)存有目標(biāo)分析物的樣品溶液流過(guò)時(shí)，硝基呋喃代謝物部分被免疫磁珠捕獲，萊克多巴胺部分被檢測(cè)線(xiàn)上的相應(yīng)抗體捕獲，最終在檢測(cè)線(xiàn)上形成可視化的檢測(cè)結(jié)果。將該技術(shù)應(yīng)用于AOZ、AMOZ、SEM、AHD 的檢測(cè)，當(dāng)對(duì)4 種硝基呋喃代謝物進(jìn)行單一檢測(cè)時(shí)，LOD 均為0.1 μg/L；而用等量混合的4 種磁珠-抗體結(jié)合物進(jìn)行樣品的磁性分離后對(duì)多種硝基呋喃同時(shí)檢測(cè)時(shí)，LOD 低至0.05 μg/L，證明，該方法不僅檢出限低、靈敏度高，而且可用于多種硝基呋喃代謝物的檢測(cè)。

圖4 基于MNPs 的信號(hào)增強(qiáng)競(jìng)爭(zhēng)形免疫層析法示意圖[55]Fig.4 Schematic diagram of signal-enhanced competitive immunochromatography based on magnetic nanoparticles[55]

2018年Yan 等[55]為快速測(cè)定牛奶中的AOZ殘留物，建立了以四氧化三鐵磁性納米顆粒（Magnetic nanoparticles，MNPs）為標(biāo)記物的雙探針免疫層析法，通過(guò)EDC/NHS 反應(yīng)將MNPs 分別標(biāo)記于抗CPAOZ 單克隆抗體和羊抗鼠IgG 形成兩種探針，并固定于共軛墊，當(dāng)含有目標(biāo)分析物的溶液經(jīng)過(guò)時(shí)，兩種預(yù)先混合的探針會(huì)與目標(biāo)分析物結(jié)合，產(chǎn)生一個(gè)聚集大量MNPs 的網(wǎng)絡(luò)結(jié)構(gòu)復(fù)合物，以實(shí)現(xiàn)檢測(cè)信號(hào)的放大，從而達(dá)到通過(guò)減少抗體的使用量提高免疫層析檢測(cè)技術(shù)的靈敏度。該法對(duì)PBS 中AOZ 的LOD 為0.044 ng/mL，半定量分析能力（閾值）為0.88 ng/mL，遠(yuǎn)低于基于傳統(tǒng)的膠體金免疫層析方法。在實(shí)際樣品奶粉中AOZ 的LOD 和閾值與PBS 中的數(shù)值基本一致，說(shuō)明該方法可用于實(shí)際樣品中AOZ 的檢測(cè)。

3.4 其它標(biāo)記物

隨著技術(shù)的發(fā)展與進(jìn)步，有研究者將結(jié)晶紫染料、乳膠珠、Co3O4納米顆粒、聚多巴胺納米球等標(biāo)記材料引入免疫層析技術(shù)中，對(duì)食品中的硝基呋喃類(lèi)藥物進(jìn)行檢測(cè)。

2019年，Dou 等[56]首次將非納米材料結(jié)晶紫（Crystal violet，CV）染料通過(guò)非共價(jià)結(jié)合作用染色于抗體，開(kāi)發(fā)出定量檢測(cè)蝦、魚(yú)、肉中AOZ 的結(jié)晶紫免疫層析法。該方法檢測(cè)迅速，在不同的樣品基質(zhì)中的LOD 幾乎一致。同年，Wang 等[57]以顏色多樣的彩色乳膠珠（Latex bead，LB）作為光學(xué)信號(hào)，通過(guò)鏈霉素-親和素的方法形成4 種顏色的LB-抗體探針，建立高通量乳膠珠免疫層析方法，并應(yīng)用于雞、魚(yú)、蝦中AOZ、AMOZ、AHD、SEM 殘留的快速檢測(cè)。該方法靈敏度高，檢測(cè)快速，可實(shí)現(xiàn)對(duì)動(dòng)物源食品中多種分析物的高通量現(xiàn)場(chǎng)篩選。

2020年，Su 等[58]發(fā)現(xiàn)Co3O4納米顆粒（Nanoparticles，NPs）自身的棕色屬性可以實(shí)現(xiàn)免疫條帶中信號(hào)標(biāo)記材料的要求，合成了二巰基丁二酸修飾的Co3O4NPs，通過(guò)靜電作用與抗CPAOZ 抗體連接，構(gòu)建定量檢測(cè)蜂蜜、雞肉、豬肉、奶粉中AOZ的Co3O4納米粒子側(cè)流免疫層析法。該方法精確度高，其LOD 是傳統(tǒng)膠體金免疫層析的3 倍。此外，基于聚多巴胺納米球（Polydopamine nanospheres，PDA NPs）自身較強(qiáng)的顏色屬性，Liu 等[59]創(chuàng)新性地以PDA NPs 為抗體標(biāo)記物，通過(guò)簡(jiǎn)單的混合方式將PDA NPs 修飾到抗CPAOZ 抗體上，構(gòu)建用于蝦、豬肉、奶粉中AOZ 定量或半定量檢測(cè)的免疫層析法。該方法避免了傳統(tǒng)抗體有機(jī)交聯(lián)劑導(dǎo)致抗體活性降低甚至變性的可能，提高了檢測(cè)的靈敏度。

圖5 基于Co3O4 NPs（a）[58]、PDA NPs（b）[59]、結(jié)晶紫[56]（c）檢測(cè)CPAOZ 的免疫層析結(jié)構(gòu)圖與過(guò)程圖Fig.5 The immunochromatography structure and detection process diagram based on Co3O4 NPs[58]（a），PDA NPs[59]（b），rystal violet [56]（c）

除上述舉例外，本文對(duì)近10年來(lái)基于免疫層析技術(shù)檢測(cè)動(dòng)物性食品中硝基呋喃類(lèi)藥物的相關(guān)報(bào)道進(jìn)行總結(jié)，詳見(jiàn)表1。

表1 近10年基于免疫層析技術(shù)檢測(cè)動(dòng)物性食品中硝基呋喃類(lèi)藥物的文獻(xiàn)報(bào)道Table 1 The reports on the detection of nitrofuran drugs in animal food based on immunochromatography in recent ten years

（續(xù)表1）

4 結(jié)語(yǔ)

硝基呋喃類(lèi)藥物具有致突變性和致癌性，可危及消費(fèi)者健康及生命安全。目前，免疫層析技術(shù)被廣泛應(yīng)用于檢測(cè)食品中的硝基呋喃藥物及其代謝物，其中的一些方法能夠滿(mǎn)足歐盟和中國(guó)設(shè)定的最大殘留限，然而，大多數(shù)研究集中在檢測(cè)單一硝基呋喃類(lèi)藥物的代謝物上，很少涉及硝基呋喃類(lèi)藥物的多重免疫層析分析。嘗試結(jié)合多種標(biāo)記材料，開(kāi)發(fā)出一種可同時(shí)檢測(cè)食品中多種硝基呋喃類(lèi)藥物殘留的高通量篩查免疫層析技術(shù)是未來(lái)的發(fā)展趨勢(shì)。

此外，近年由于膠體金易于制備和表面功能化，因此有關(guān)膠體金的免疫層析技術(shù)在食品中硝基呋喃藥物及其代謝物的檢測(cè)報(bào)道很多。實(shí)際情況是：該方法容易受到背景信號(hào)影響，存在靈敏度低的缺陷，且僅適合目標(biāo)分析物的定性與半定量檢測(cè)。隨著免疫層析技術(shù)中標(biāo)記材料的不斷發(fā)展，開(kāi)發(fā)新型的標(biāo)記材料（如富勒烯與石墨烯）應(yīng)用于免疫層析技術(shù)的構(gòu)建，對(duì)于提高檢測(cè)的信號(hào)強(qiáng)度與靈敏度很關(guān)鍵。為獲得更準(zhǔn)確的定量結(jié)果，構(gòu)建的免疫層析試紙條應(yīng)與帶式閱讀器相結(jié)合。

研究表明，以體外SELEX（指數(shù)富集的配體系統(tǒng)進(jìn)化技術(shù)）過(guò)程產(chǎn)生的核酸適配體（Aptamer）作為一種具有高特異性識(shí)別特點(diǎn)的人工寡核苷酸片段，其具有標(biāo)記過(guò)程和結(jié)構(gòu)修飾簡(jiǎn)單，穩(wěn)定性、重復(fù)性好，靈敏度高等特點(diǎn)，優(yōu)于抗體，近年來(lái)成為試紙條生物傳感器中一種特殊的生物識(shí)別因子。然而，在利用免疫層析技術(shù)檢測(cè)食品中硝基呋喃類(lèi)藥物及代謝物的眾多研究中，都是尋找最合適的特異性抗體作為目標(biāo)分析物的生物認(rèn)知分子，而使用硝基呋喃類(lèi)藥物代謝物的適配體作為目標(biāo)分析物的特異性識(shí)別分子未見(jiàn)報(bào)道。開(kāi)發(fā)硝基呋喃類(lèi)藥物的適配體，將其應(yīng)用于構(gòu)建其分子識(shí)別元件，具有較好的發(fā)展前景。免疫層析技術(shù)可高通量快速分析食品中硝基呋喃類(lèi)藥物，對(duì)保障食品安全發(fā)揮了重要作用。