傳統(tǒng)發(fā)酵過程微生物互作研究進(jìn)展

周袁璐，師 苑，陸躍樂，朱林江，陳小龍

（浙江工業(yè)大學(xué)生物工程學(xué)院 杭州310014）

發(fā)酵是人類最古老的食品保存方法之一，我國(guó)的傳統(tǒng)發(fā)酵技術(shù)有著悠久的歷史，且不同地區(qū)有著不同代表性的傳統(tǒng)發(fā)酵食品。傳統(tǒng)發(fā)酵過程呈開放式，環(huán)境中的微生物進(jìn)入發(fā)酵食品，使其微生物種類豐富多樣[1]。傳統(tǒng)發(fā)酵一般有2 種形式：一部分發(fā)酵食品直接依賴原料及環(huán)境中的微生物進(jìn)行發(fā)酵，而另一部分發(fā)酵食品通過人工接種后進(jìn)行開放式發(fā)酵。然而，無論是哪種形式，發(fā)酵過程中都存在豐富的微生物體系。不同的微生物同處于一個(gè)微環(huán)境中，其群落組成隨發(fā)酵條件的變化而發(fā)生變化，群落微生物生長(zhǎng)代謝的過程推動(dòng)了發(fā)酵的進(jìn)行。認(rèn)識(shí)發(fā)酵過程中的微生物群落結(jié)構(gòu)和不同微生物之間的協(xié)同作用機(jī)制對(duì)認(rèn)識(shí)傳統(tǒng)發(fā)酵有著十分重要的意義。

在自然環(huán)境中，微生物并不是單獨(dú)存在，往往是種類繁多的微生物形成一個(gè)微生態(tài)體系。不同種類的微生物之間普遍存在著多種類型的相互作用表型，包括互利共生、偏利共生、偏害共生、競(jìng)爭(zhēng)和寄生等，如圖1所示。食品傳統(tǒng)發(fā)酵過程也是一個(gè)由多種微生物協(xié)同發(fā)酵的微生態(tài)系統(tǒng)，存在微生物間的相互作用，并貫穿整個(gè)發(fā)酵過程，使得發(fā)酵過程各菌群的相對(duì)豐度呈現(xiàn)此消彼長(zhǎng)的狀態(tài)。此外，這種微生物相互作用存在可重復(fù)的特征，即在每批次發(fā)酵的起始階段，參與發(fā)酵的微生物的種類與數(shù)量可能有所不同，而發(fā)酵過程和成熟產(chǎn)品中，各批次之間微生物的種類與數(shù)量的變化卻都相對(duì)一致。不同批次間的微生物群落及其演變具有可再現(xiàn)性，如傳統(tǒng)發(fā)酵奶酪[2]、蠶豆醬[3]和食醋[4]等。研究并揭示發(fā)酵過程中微生物間的相互作用，對(duì)穩(wěn)定發(fā)酵食品質(zhì)量，提高發(fā)酵食品品質(zhì)等均有一定的指導(dǎo)意義[5]。此外，傳統(tǒng)發(fā)酵食品中可重復(fù)再現(xiàn)群落形成過程的特點(diǎn)，使其成為研究微生物群落生態(tài)形成機(jī)制的有效模型[6]，用于研究并揭示微環(huán)境中微生物是如何通過相互作用自然形成微生物群落體系。

圖1 微生物相互作用類型Fig.1 Types of microbial interaction

近些年來，組學(xué)分析技術(shù)快速發(fā)展，高通量DNA 測(cè)序技術(shù)、RNA-seq 技術(shù)、功能基因組技術(shù)以及代謝組學(xué)技術(shù)等被廣泛應(yīng)用于各種傳統(tǒng)發(fā)酵過程，能夠較全面地解析微生物群落的變化情況。Wu 等[7]為認(rèn)識(shí)四川小曲酒的糖化發(fā)酵劑小曲中的微生物群落，對(duì)3 個(gè)地區(qū)的成熟小曲樣品進(jìn)行MiSeq 高通量測(cè)序分析，結(jié)果表明，3 份小曲中細(xì)菌和真菌的多樣性都有一定差異，這種差異性在細(xì)菌群落中更為明顯，這可能是導(dǎo)致不同地區(qū)的風(fēng)味差異的重要因素之一。Xie 等[8]為了解紹興黃酒發(fā)酵過程中微生物群落結(jié)構(gòu)的變化，對(duì)發(fā)酵5 d 和30 d 的黃酒發(fā)酵樣品進(jìn)行宏基因組測(cè)序，結(jié)果表明，發(fā)酵過程中的群落結(jié)構(gòu)和功能都有所改變。在門水平上，發(fā)酵第5 天，放線菌門的菌群為優(yōu)勢(shì)菌落，相對(duì)豐度達(dá)87%；發(fā)酵第30 天，厚壁菌門和變形菌門的菌群成為優(yōu)勢(shì)菌。這些組學(xué)技術(shù)的協(xié)同應(yīng)用，可從宏觀和微觀的角度共同分析微生物的生長(zhǎng)代謝情況，為分析群落微生物的形成和功能提供技術(shù)支持。

1 傳統(tǒng)發(fā)酵食品中的微生物

1.1 傳統(tǒng)發(fā)酵食品中的微生物多樣性

傳統(tǒng)食品的發(fā)酵多為開放式的自然發(fā)酵，在發(fā)酵過程中呈現(xiàn)出了一個(gè)動(dòng)態(tài)且獨(dú)特的微生物群落結(jié)構(gòu)。參與發(fā)酵的微生物主要有3 個(gè)來源：1）人工接種，包括一些乳酸菌、酵母菌、米曲霉等。這些菌株一般都經(jīng)過篩選或人工改造，有著遺傳性狀穩(wěn)定，抗逆性強(qiáng)，發(fā)酵產(chǎn)品的品質(zhì)好等特點(diǎn)，如醬醪發(fā)酵過程中接種魯氏酵母和球擬酵母可顯著提高傳統(tǒng)發(fā)酵醬油產(chǎn)品的風(fēng)味和品質(zhì)，且縮短發(fā)酵時(shí)間[9]；人工接種凍干的乳酸菌可有效地啟發(fā)蘋果酸-乳酸，改善葡萄酒風(fēng)味[10]；醬曲、小曲等發(fā)酵時(shí)，人工接種高活性霉菌如米曲霉AS3.042、米根霉AS3.866 等。2）原料中存在的微生物。許多傳統(tǒng)發(fā)酵的食品并不是通過接種特定的菌種進(jìn)行發(fā)酵，而是直接依靠原料中存在的微生物進(jìn)行發(fā)酵，如天然發(fā)酵的葡萄酒，是直接利用葡萄表面的微生物進(jìn)行發(fā)酵的[11]，參與發(fā)酵的酵母菌除釀酒酵母外，還有漢遜酵母，假絲酵母，圓酵母等[12]。3）環(huán)境中的微生物，在發(fā)酵過程中會(huì)進(jìn)入發(fā)酵食品中且參與發(fā)酵，這是地理環(huán)境不同的發(fā)酵食品呈現(xiàn)出不同風(fēng)味的原因之一，這也導(dǎo)致了工業(yè)化生產(chǎn)發(fā)酵食品時(shí)，不同廠區(qū)的同種發(fā)酵食品有可能會(huì)呈現(xiàn)出不同風(fēng)味[13]。

人們通過控制鹽濃度、氧氣含量等發(fā)酵參數(shù)來引導(dǎo)發(fā)酵過程，如在泡菜的發(fā)酵過程中加入了2%和食鹽和1%白砂糖，并用水封住壇口，創(chuàng)造了一個(gè)高鹽缺氧的發(fā)酵環(huán)境，以抑制雜菌生長(zhǎng)[14]。Capece 等[11]連續(xù)4年研究了葡萄表面的釀酒酵母菌群，一共發(fā)現(xiàn)了6 種生物型（Biotype）的釀酒酵母。受每年葡萄收獲時(shí)降雨和溫度的影響，每年葡萄表面的釀酒酵母菌群都會(huì)有所不同，且釀酒酵母的豐度在葡萄表面并不占優(yōu)勢(shì)，然而由于釀酒酵母有著能在高糖環(huán)境下快速生長(zhǎng)，對(duì)酒精有良好耐受性等特點(diǎn)[15]，使得釀酒酵母在酒精發(fā)酵的過程中占據(jù)了主導(dǎo)地位。到發(fā)酵結(jié)束時(shí)，發(fā)酵食品中的微生物大多以推動(dòng)發(fā)酵進(jìn)行的菌種為主體，這部分菌種豐度大大高于其它菌種；有一小部分相對(duì)豐度較高的菌種，多為優(yōu)勢(shì)菌種同門的其它菌種[2]，能在發(fā)酵環(huán)境中進(jìn)行生長(zhǎng)代謝；剩下一小部分相對(duì)豐度較低的菌種則是來自于發(fā)酵環(huán)境，原料或容器的其它菌種，發(fā)酵環(huán)境雖不適合這部分菌種生長(zhǎng)，但對(duì)發(fā)酵環(huán)境有一定耐受程度，因此可以存在于發(fā)酵食品中。

1.2 發(fā)酵食品中的微生物群落演替

在傳統(tǒng)發(fā)酵的過程中，隨著發(fā)酵的進(jìn)行，微生物產(chǎn)生的代謝物，如酒精、乳酸、醋酸等，改變了發(fā)酵環(huán)境，使得各個(gè)菌群的相對(duì)豐度發(fā)生變化，菌群呈現(xiàn)出一種此消彼長(zhǎng)的狀態(tài)，表1 列舉了部分傳統(tǒng)發(fā)酵食品中的微生物群落變化。

表1 傳統(tǒng)發(fā)酵過程中的微生物群落變化Table 1 Changes in microbial communities during traditional fermentation processes

泡菜是中國(guó)北方的一種傳統(tǒng)發(fā)酵食品，Liang等[19]采用了Illumina MiSeq 測(cè)序技術(shù)，變性梯度凝膠電泳（Denaturing gradient gel electrophoresis，DGGE）以及定量PCR（qPCR）這3 種分析方法，研究了泡菜發(fā)酵過程中微生物相對(duì)豐度的變化。Illumina MiSeq 測(cè)序和DGGE 的結(jié)果都表明，隨著發(fā)酵時(shí)間的增長(zhǎng)，細(xì)菌菌群與真菌菌群的均勻度皆有所下降，即在發(fā)酵中后期，有優(yōu)勢(shì)菌群出現(xiàn)。由于在發(fā)酵過程中并沒有接種菌種，因此發(fā)酵初期時(shí)的菌種基本都來自原料，少量來自于環(huán)境。在發(fā)酵過程中，乳酸菌（Lactobacillus）產(chǎn)生乳酸，使得發(fā)酵環(huán)境中的pH 值下降，可滴定酸度（Total titratable acidity，TTA）上升，抑制了其它微生物的生長(zhǎng)，使得乳酸菌在發(fā)酵后期成為最主要的菌屬。因此，在發(fā)酵過程中可以觀察到，發(fā)酵初期相對(duì)豐度較高的假單胞菌（Pseudomonas）和變形桿菌（Proteobacteria），其相對(duì)豐度會(huì)隨著發(fā)酵的進(jìn)行而減少。

Zheng 等[20]應(yīng)用變性梯度凝膠電泳的技術(shù)研究了白酒大曲的制曲過程中微生物群落的演替過程。這與泡菜發(fā)酵中的演替有所不同的是，制曲是通過控制溫度與濕度，從而達(dá)到某類微生物在曲中得以富集的目的。首先在第1 階段，將溫度控制在20 ℃，使得來源于原料及環(huán)境中的中溫微生物得以快速生長(zhǎng)，接下來將溫度升高至38 ℃，使曲中的酵母、霉菌以及其它耐熱微生物得以富集。經(jīng)過這2 個(gè)階段，曲中的乳酸菌也得到了富集，產(chǎn)生的乳酸能夠調(diào)節(jié)大曲的pH 值處于弱酸性，使得淀粉酶、蛋白酶等酸性酶類可以有更高的活性[21]，并使得pH 值與溫度成為制曲后期微生物群落結(jié)構(gòu)形成的最重要因素。

食醋是由各類谷物進(jìn)行連續(xù)的酒精發(fā)酵和醋酸發(fā)酵后得到的產(chǎn)品，其釀造過程中也有著非常清晰的微生物群落演替過程[22]。首先，在處理過的谷物中加入大曲，曲中含有酵母（如畢赤酵母）、霉菌（如鏈霉菌、紅曲霉）等[23]微生物，其中霉菌是大曲中的優(yōu)勢(shì)菌種，霉菌分泌大量的酶如淀粉酶、蛋白酶、脂肪酶，可以水解原料中的大分子物質(zhì)，為酵母菌進(jìn)行酒精發(fā)酵提供了營(yíng)養(yǎng)。在發(fā)酵的前3 d，是一個(gè)有氧發(fā)酵過程，微生物迅速利用原料中的糖分進(jìn)行增殖，從第4 天開始隔絕氧氣，進(jìn)行厭氧發(fā)酵，在這期間酒精含量以及酵母菌的相對(duì)豐度迅速上升，酒精濃度上升會(huì)抑制雜菌的生長(zhǎng)，經(jīng)過糖化和酒精發(fā)酵階段，乳酸菌也得到一定程度的富集，為后續(xù)的醋酸發(fā)酵做準(zhǔn)備。酒精發(fā)酵結(jié)束后，加入老醅（上一批醋酸發(fā)酵的醋醅，含有較高豐度的醋酸菌[24]），通氣進(jìn)行醋酸發(fā)酵，充足的氧氣使得醋酸菌和乳酸菌[4]的豐度迅速上升，發(fā)酵環(huán)境中的有機(jī)酸持續(xù)積累[18]，使環(huán)境中的pH 值下降，抑制其它微生物的生長(zhǎng)，使得醋酸菌在該階段成為優(yōu)勢(shì)菌種[25]。醋酸菌代謝放熱使得環(huán)境溫度升高[25]，有利于產(chǎn)生更多代謝產(chǎn)物。

發(fā)酵工藝及其關(guān)鍵參數(shù)控制，可為傳統(tǒng)發(fā)酵過程中的優(yōu)勢(shì)微生物菌群結(jié)構(gòu)變化提供主要?jiǎng)恿Α４送?，微生物菌群?nèi)部也存在著許多菌種與菌種之間的相互作用。

2 傳統(tǒng)發(fā)酵中的微生物相互作用

在一個(gè)微生物群落中，不同微生物之間的相互作用可以通過多種機(jī)制進(jìn)行，如直接接觸或通過信號(hào)分子等[26]。對(duì)于傳統(tǒng)發(fā)酵過程過程，除發(fā)酵條件影響微生物群落結(jié)構(gòu)變化外，其群落結(jié)構(gòu)內(nèi)部的相互作用貫穿了整個(gè)發(fā)酵過程，表2 列舉了部分發(fā)酵食品中微生物的相互作用類型。微生物的相互作用可以賦予發(fā)酵食品特殊的風(fēng)味，也對(duì)發(fā)酵食品質(zhì)量的穩(wěn)定性有著很大的影響。

表2 傳統(tǒng)發(fā)酵中的微生物相互作用Table 2 Microbial interaction in traditional fermentation

2.1 傳統(tǒng)食品發(fā)酵過程中真菌與細(xì)菌之間的相互作用

傳統(tǒng)發(fā)酵過程中，有些發(fā)酵過程是由真菌主導(dǎo)的，如白酒小曲、白酒大曲、黃酒麥曲、豆腐乳、奶酪、葡萄酒等等的發(fā)酵過程，而細(xì)菌群落普遍存在于整個(gè)傳統(tǒng)發(fā)酵過程，因此這其中就會(huì)存在大量的真菌和細(xì)菌相互作用，主要表現(xiàn)為偏害共生和互利共生。

葡萄酒是葡萄經(jīng)由微生物的一系列發(fā)酵后產(chǎn)生的一種具有獨(dú)特風(fēng)味的酒類，具有較為明顯的區(qū)域特征。雖然葡萄酒產(chǎn)生區(qū)域特征的決定因素還沒有被確定，但目前有學(xué)者認(rèn)為，不同地區(qū)的氣候特點(diǎn)使得葡萄表面具有獨(dú)特的細(xì)菌與真菌的組合[27]，這些真菌與細(xì)菌對(duì)葡萄酒的風(fēng)味與質(zhì)量有著十分重要的影響。葡萄表面有著復(fù)雜的微生物生態(tài)環(huán)境，包括絲狀真菌、酵母菌和細(xì)菌，其中有能力在葡萄酒中生存和生長(zhǎng)的菌株就構(gòu)成了葡萄酒的微生物群落，該群落主要包括酵母、乳酸菌和醋酸菌[28]。植物乳桿菌可以通過乳酸發(fā)酵使葡萄酒脫酸，脫酸和酒精發(fā)酵過程同時(shí)進(jìn)行，可以縮短葡萄酒的釀造時(shí)間，使葡萄酒的口感更好，色澤更穩(wěn)定。此外，Lucio 等[29]將幾株植物乳桿菌和釀酒酵母共培養(yǎng)后發(fā)現(xiàn)，釀酒酵母對(duì)植物乳桿菌的生長(zhǎng)有較強(qiáng)的負(fù)面作用，這有可能是因?yàn)獒劸平湍冈诠才囵B(yǎng)體系中能夠快速吸收必需氨基酸，維生素和生長(zhǎng)因子，從而限制了植物乳桿菌的生長(zhǎng)。除此之外，釀酒酵母有較高的承受惡劣環(huán)境條件的能力（高濃度的乙醇和有機(jī)酸、較低的pH 值、缺乏氧氣等），使得其成為整個(gè)釀酒過程中的優(yōu)勢(shì)菌種。事實(shí)上，高含量酒精所產(chǎn)生的選擇性壓力已被定義為釀酒酵母在酒精發(fā)酵過程中具有優(yōu)勢(shì)的主要因素[30]，這也是在發(fā)酵過程中釀酒酵母與乳酸菌和非釀酒酵母呈現(xiàn)出偏害共生關(guān)系的主要原因。

除葡萄酒外，許多食品的發(fā)酵過程中都會(huì)出現(xiàn)酵母菌和乳酸菌的混合群落，如醬油、酸面團(tuán)、酸奶等，且在這個(gè)過程中存在著相互作用，如圖2所示。釀酒酵母和保加利亞乳桿菌在共同發(fā)酵酸奶的過程中呈現(xiàn)出互利共生關(guān)系，保加利亞乳桿菌會(huì)將釀酒酵母無法水解的乳糖水解成半乳糖和葡萄糖，并將無法利用的半乳糖排出作為釀酒酵母的碳源，釀酒酵母則為保加利亞乳桿菌提供生長(zhǎng)所需的丙氨酸[31]。

圖2 細(xì)菌與真菌之間的相互作用Fig.2 The interaction between bacteria and fungi

在酸面團(tuán)的發(fā)酵過程中，酵母菌和乳酸菌也存在互利共生關(guān)系。釀酒酵母可以產(chǎn)生一種生長(zhǎng)因子刺激舊金山乳桿菌生長(zhǎng)，且釀酒酵母還會(huì)消耗O2并產(chǎn)生CO2，可以改善舊金山乳桿菌的發(fā)酵性能[32]。

2.2 傳統(tǒng)食品發(fā)酵過程中的細(xì)菌與細(xì)菌之間的相互作用

在酸奶、泡菜發(fā)酵、食醋發(fā)酵等以細(xì)菌為主導(dǎo)的發(fā)酵過程，細(xì)菌與細(xì)菌的相互作用尤為明顯，主要類型表現(xiàn)為互利共生、競(jìng)爭(zhēng)和偏害共生。

乳酸菌是一類通常產(chǎn)生乳酸作為碳水化合物發(fā)酵的主要代謝終產(chǎn)物的菌種[33]，是酸奶發(fā)酵的主要菌種。嗜熱鏈球菌、雙歧桿菌等產(chǎn)乳酸的菌株雖然也能獨(dú)立執(zhí)行酸奶發(fā)酵過程，但多個(gè)菌種發(fā)酵酸奶存在著明顯的優(yōu)勢(shì)。Sieuwerts 等[34]研究表明嗜熱鏈球菌（Streptococcus thermophilus）和保加利亞乳桿菌（Lactobacillus bulgaricus）共同發(fā)酵酸奶時(shí)存在互利共生關(guān)系，如圖3所示，嗜熱鏈球菌可以為保加利亞乳桿菌提供嘌呤核苷酸生物合成的關(guān)鍵成分，包括前體甲酸和輔因子葉酸，提高保加利亞乳桿菌的生長(zhǎng)速率。除少數(shù)能分泌胞外蛋白酶的嗜熱鏈球菌菌株外，大部分嗜熱鏈球菌菌株沒有蛋白水解活性[26]，保加利亞乳桿菌則有著良好的蛋白水解活性，可以提供豐富的氨基酸，加快嗜熱鏈球菌生長(zhǎng)。除了互利共生外，有學(xué)者發(fā)現(xiàn)在不同的發(fā)酵環(huán)境中，這兩種菌之間存在競(jìng)爭(zhēng)作用。Liu 等[35]發(fā)現(xiàn)保加利亞乳桿菌和嗜熱鏈球菌在脫脂牛奶中進(jìn)行酸奶發(fā)酵時(shí)，發(fā)酵初期，由于保加利亞乳桿菌中不存在支鏈氨基酸（Branched-chain amino acids，BCAA）合成途徑，而且根據(jù)RNA 芯片分析表明嗜熱鏈球菌的存在會(huì)降低保加利亞乳桿菌中用于吸收氨基酸的通透酶的表達(dá)量，這使得嗜熱鏈球菌對(duì)環(huán)境中的BCAA 有著更大的利用優(yōu)勢(shì)，其在發(fā)酵初期表現(xiàn)出更高的生長(zhǎng)速率。隨著發(fā)酵的進(jìn)行，環(huán)境中pH 值下降，保加利亞乳桿菌對(duì)低pH 值有更好的耐受性，因此在發(fā)酵中期，保加利亞乳桿菌有著更高的生長(zhǎng)速率。

圖3 細(xì)菌與細(xì)菌之間的相互作用Fig.3 The interaction between bacteria and bacteria

嗜酸乳桿菌（L.acidophilus）是乳制品中常用的益生菌之一，其單獨(dú)發(fā)酵時(shí)生長(zhǎng)速率緩慢，因此在工業(yè)上不能單獨(dú)作為酸奶發(fā)酵劑使用。嗜酸乳桿菌在冷藏酸奶中的存活能力也比較差，為了改善其存活能力，Li 等[36]研究了嗜酸乳桿菌分別與保加利亞乳桿菌和嗜熱鏈球菌混合發(fā)酵時(shí)的發(fā)酵能力和生存能力，結(jié)果表明，保加利亞乳桿菌和嗜熱鏈球菌的存在都會(huì)增強(qiáng)嗜酸乳桿菌的發(fā)酵能力。然而，保加利亞乳桿菌對(duì)嗜酸乳桿菌的生存能力有著負(fù)面影響，嗜熱鏈球菌可以減弱這種影響，嗜酸乳桿菌與嗜熱鏈球菌進(jìn)行混合發(fā)酵時(shí)，嗜酸乳桿菌的產(chǎn)酸能力以及生存能力均有增強(qiáng)，即存在互利共生關(guān)系。

雙歧桿菌是一種被廣泛使用的益生菌，由于雙歧桿菌是專性厭氧菌，氧氣的存在會(huì)引起雙歧桿菌強(qiáng)烈的氧化應(yīng)激反應(yīng)，導(dǎo)致雙歧桿菌在食品發(fā)酵中的應(yīng)用受到限制。Wang 等[37]發(fā)現(xiàn)一株雙歧桿菌（Bifidobacterium animalissubsp.lactis）和一株納豆枯草芽孢桿菌（Bacillus subtilisnatto）在氧氣限制的條件下進(jìn)行大豆固態(tài)發(fā)酵時(shí)，雙歧桿菌的存活率較單獨(dú)發(fā)酵時(shí)提高了3 倍，利用RNASeq 對(duì)比了混合發(fā)酵和單獨(dú)發(fā)酵時(shí)的轉(zhuǎn)錄組后發(fā)現(xiàn)，當(dāng)納豆枯草芽孢桿菌存在時(shí)，雙歧桿菌有關(guān)分子轉(zhuǎn)運(yùn)功能、碳水化合物和活性氨基酸代謝、DNA修復(fù)，氧化應(yīng)激相關(guān)功能以及細(xì)胞生長(zhǎng)的基因的表達(dá)會(huì)被大幅度上調(diào)，這些基因的表達(dá)被上調(diào)后，可以大大雙歧桿菌在有氧條件下的生存能力。

2.3 真菌與真菌之間的相互作用

在葡萄酒發(fā)酵過程中，往往存在著多種酵母菌。釀酒酵母是進(jìn)行酒精發(fā)酵的最主要菌株，己經(jīng)被廣泛研究。由于非釀酒酵母菌在酒精發(fā)酵過程中產(chǎn)生的次級(jí)代謝物可以提升葡萄酒的風(fēng)味和品質(zhì)[38]，近年來，非釀酒酵母在酒精發(fā)酵中的作用被越來越重視。Ciani 等[39]認(rèn)為，酵母菌之間相互作用的影響因素可分為非生物影響因素和生物影響因素。非生物影響因素主要包括溫度、氮濃度、營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)濃度等，其中，溫度和氨基氮濃度等參數(shù)顯著調(diào)節(jié)酵母菌群的生長(zhǎng)。不同的釀酒酵母菌株有不同的適宜發(fā)酵溫度，有些菌株會(huì)在低溫時(shí)占據(jù)發(fā)酵的主導(dǎo)地位，但通常的適宜溫度處于20～35 ℃范圍，發(fā)酵溫度過高則會(huì)使剩余的糖分過多，從而導(dǎo)致其它微生物過多地生長(zhǎng)。Cheraiti 等[40]研究了酒精發(fā)酵過程中，不同酵母間通過代謝物質(zhì)進(jìn)行的相互作用。研究表明，在葡萄酒的發(fā)酵過程中，葡萄汁酵母（Saccharomyces uvarum）會(huì)產(chǎn)生大量的乙醛，釀酒酵母（Saccharomyces cerevisiae）則可以利用這些乙醛，從而使乙醛維持在一個(gè)較低的濃度，較低的乙醛濃度可以刺激釀酒酵母生長(zhǎng)。生物影響因素主要為抗菌物質(zhì)以及細(xì)胞間接觸。乙醇是一種微生物生長(zhǎng)抑制劑，在發(fā)酵初期，釀酒酵母能迅速地利用糖分產(chǎn)生乙醇以抑制其它微生物生長(zhǎng)，并且酵母菌能夠分泌抗菌肽（Antimicrobial peptides，AMPs）抑制其它微生物的生長(zhǎng)[41]。除此之外，不同酵母間還存在著細(xì)胞直接接觸介導(dǎo)的死亡機(jī)制。如Renault 等[42]觀察到了當(dāng)釀酒酵母與德爾布有孢圓酵母（Torulaspora delbrueckii）直接接觸時(shí)，會(huì)導(dǎo)致德爾布有孢圓酵母的迅速死亡。

在許多酵母菌株中都存在著葡萄糖效應(yīng)，早前有學(xué)者發(fā)現(xiàn)有部分酵母中存在的酵母朊病毒（GAR+）可以減輕葡萄糖效應(yīng)[43]，促進(jìn)酵母細(xì)胞的活力且不降低其酒精發(fā)酵能力。Watanabe 等[44]發(fā)現(xiàn)，乳酸菌的存在可以促使酵母菌中GAR+的出現(xiàn)，提高酵母菌的生存能力，同時(shí)GAR+也可以減輕葡萄糖快速減少以及低濃度酒精對(duì)乳酸菌帶來的不利影響。

3 微生物相互作用在發(fā)酵中的應(yīng)用

微生物發(fā)酵作用不但能延長(zhǎng)傳統(tǒng)發(fā)酵食物的保存周期，而且能提高營(yíng)養(yǎng)價(jià)值并產(chǎn)生了獨(dú)特風(fēng)味[45]。隨著對(duì)傳統(tǒng)發(fā)酵過程認(rèn)識(shí)的不斷加深，人們可以有效地利用微生物間的相互作用，對(duì)傳統(tǒng)發(fā)酵進(jìn)行改良，提高傳統(tǒng)發(fā)酵食品的品質(zhì)。

3.1 提高產(chǎn)品品質(zhì)

醬油是一種具有咸鮮味和醬香味的發(fā)酵豆制品，在我國(guó)乃至東亞地區(qū)，都深受廣大消費(fèi)者的喜愛。普通傳統(tǒng)釀造的醬油中的含鹽量約為18%，鹽度偏高。通過物理法對(duì)醬油成品進(jìn)行除鹽，會(huì)影響醬油本身的風(fēng)味。Singracha 等[46]通過接種耐鹽乳酸菌與耐鹽酵母菌發(fā)酵減鹽醬油。發(fā)酵初期乳酸菌產(chǎn)生乳酸降低了環(huán)境pH 值，抑制雜菌生長(zhǎng)且有利于酵母菌產(chǎn)生更多揮發(fā)性風(fēng)味物質(zhì)。酵母菌的存在會(huì)明顯增加醬油中醇類物質(zhì)以及呋喃酮的含量，呋喃酮可以賦予醬油特殊的焦糖味[47]。然而，耐鹽乳酸菌與耐鹽酵母菌之間也存在著明顯的拮抗作用，耐鹽乳酸菌的存在會(huì)抑制耐鹽酵母菌生長(zhǎng)，這種拮抗作用可以通過調(diào)整接種順序緩解，并有利于酵母菌產(chǎn)生更多風(fēng)味物質(zhì)[48]。

3.2 提高產(chǎn)品安全性能

在過去，人們往往更關(guān)注發(fā)酵產(chǎn)品的風(fēng)味而忽視了其在發(fā)酵過程中產(chǎn)生的一些有害物質(zhì)，隨著人們對(duì)食品安全重視程度的提高，去除或降低發(fā)酵食品中的有害代謝產(chǎn)物也越來越重要。

用脫羧酶陽(yáng)性菌發(fā)酵的酸奶中，都會(huì)產(chǎn)生一定量的酪胺，攝入過量的外源性酪胺會(huì)導(dǎo)致偏頭痛、高血壓等疾病。Yilmaz 等[49]研究了混合菌種發(fā)酵的酸奶中生物胺增長(zhǎng)量的變化，結(jié)果表明，嗜熱鏈球菌與植物乳桿菌混合發(fā)酵的酸奶中，生物胺的增長(zhǎng)倍數(shù)低于兩株菌種單獨(dú)發(fā)酵的酸奶，說明這兩株菌株在酪胺的形成中存在著拮抗作用。

赭曲霉毒素A（Ochratoxin A，OA）是一種真菌毒素，有劇毒且可以致癌，存在于食品中會(huì)對(duì)健康造成不利的影響。酵母菌和乳酸菌都有降解該化合物的能力，若將兩種菌共同接入發(fā)酵食品中時(shí)，降解效率明顯高于單株菌的降解效率[50]。

在傳統(tǒng)發(fā)酵的酸面團(tuán)中，存在著麩皮蛋白，可能會(huì)引起過敏反應(yīng)。Sakandara 等[51]從酸面團(tuán)中分離并挑選出了良好水解麩皮蛋白活性的菌株，可用于酸面團(tuán)的發(fā)酵過程中，以達(dá)到降解過敏原的目的。

氨基甲酸乙酯（Ethyl carbamate，EC）是一種潛在的致癌物質(zhì)，存在于許多酒精飲料，包括一些果酒和米酒產(chǎn)品。Fang 等[52]選用了幾株能產(chǎn)氨基甲酸乙酯水解酶的乳酸菌，與釀酒酵母進(jìn)行混合發(fā)酵，結(jié)果表明，細(xì)菌的存在可以抑制酵母菌產(chǎn)生EC，氨基甲酸乙酯水解酶可以水解EC，從而降低發(fā)酵產(chǎn)品中EC 的含量。

4 總結(jié)與展望

傳統(tǒng)發(fā)酵食品及其控制工藝是豐富多樣的，其發(fā)酵微生物的群落結(jié)構(gòu)和內(nèi)部的相互作用也是較為復(fù)雜，特別是我國(guó)傳統(tǒng)固體發(fā)酵過程?？偨Y(jié)已有的傳統(tǒng)發(fā)酵過程的微生物相互作用發(fā)現(xiàn)，其作用類型主要表現(xiàn)為原料利用的互利生長(zhǎng)關(guān)系、代謝物介導(dǎo)的偏害或偏利生長(zhǎng)關(guān)系、營(yíng)養(yǎng)吸收的競(jìng)爭(zhēng)性生長(zhǎng)關(guān)系以及適應(yīng)環(huán)境的共性生長(zhǎng)關(guān)系等。目前，這些微生物間相互作用的具體分子機(jī)理研究，主要集中在酒類、酸奶、奶酪等傳統(tǒng)發(fā)酵過程。針對(duì)我國(guó)較為豐富多樣的傳統(tǒng)固體發(fā)酵過程，其多菌種間相互作用的具體分子機(jī)理的研究較少。這可能由于傳統(tǒng)固態(tài)發(fā)酵過程中，代謝物介導(dǎo)的相互作用局限于固體發(fā)酵的某些微環(huán)境內(nèi)部，且具有空間限制性和固態(tài)介質(zhì)吸附性等物理特征。進(jìn)一步認(rèn)識(shí)多菌種聯(lián)動(dòng)發(fā)酵機(jī)制，可以更充分、更有效地利用發(fā)酵微生物人工接種技術(shù)，用以提高發(fā)酵食品的安全性以及風(fēng)味品質(zhì)，提升傳統(tǒng)發(fā)酵的生產(chǎn)技術(shù)水平。

發(fā)酵食品中的微生物群落由于其具有易操縱、可再現(xiàn)等特點(diǎn)，也成為了研究微生物群落形成機(jī)理的一種模型，為研究微生物群落中物種-物種和物種-環(huán)境相互作用提供了一個(gè)新的突破點(diǎn)。目前對(duì)微生物間相互作用的研究的重心逐漸從菌群結(jié)構(gòu)變化轉(zhuǎn)向基于轉(zhuǎn)錄組和代謝組分析的菌種相互作用分子機(jī)理方面，可以從分子生物學(xué)層面更直接地揭示微生物間的相互作用，為傳統(tǒng)發(fā)酵的發(fā)展提供更廣闊的思路。