原兒茶醛對福氏志賀菌的抑制作用

宋璐憶，李佳輝，王 碩，郭嘉璐，鄧海潮，石 超

（西北農(nóng)林科技大學(xué)食品科學(xué)與工程學(xué)院 陜西楊凌712100）

福氏志賀菌是一種棒狀、無莢膜、非運動、兼性厭氧的食源性致病菌，具有多種流行病學(xué)和病理學(xué)特征[1]。它是一類具有高度危害性的微生物，人體感染試驗表明，僅10 個福氏志賀菌即可引起成年人發(fā)病，食物和飲用水可以作為其傳播媒介[2]。它可以引起細菌性痢疾，感染的癥狀通常是腹部絞痛、腹瀉和發(fā)燒，有時伴隨其它癥狀，如嘔吐和頭痛[3]。它是在全球范圍引起腹瀉的主要原因，每年導(dǎo)致約8 000 萬～1.65 億病例[4]。福氏志賀菌通?？蓮募词呈称分蟹蛛x，如蔬菜沙拉、冷切肉類、熏魚、生牡蠣和海鮮等[5]，其往往會通過受污染的食物、個人、人群、學(xué)校和餐館快速傳播[6]。

傳統(tǒng)的食品殺菌技術(shù)雖然能保證食品微生物方面的安全，但是可能會影響食品的質(zhì)構(gòu)、色澤、風(fēng)味和營養(yǎng)成分等。如熱力殺菌可能會引起食品褐變、營養(yǎng)物質(zhì)破壞、風(fēng)味變化等熱化學(xué)反應(yīng)[7]。物理殺菌通常對設(shè)備要求較高，投入成本較大。而化學(xué)合成防腐劑的過量使用往往具有致癌性、致畸性以及殘留毒性[8-9]。尋找高效、安全、天然的食品保鮮方法，抑制或清除食源性致病菌，延長食品的貨架期，已成為食品工業(yè)的當務(wù)之急。一些植物源抑菌物質(zhì)被證明具有良好的抑菌效果，且因具有綠色安全的優(yōu)點而備受研究者的關(guān)注[10]。

原兒茶醛（Protocatechuicaldehyde，PC，C7H6O3）是一種從活血化瘀中藥丹參、鼠尾草和四季青葉等中提取出的酚酸類化合物，結(jié)構(gòu)式如圖1所示[11]。原兒茶醛具有抗菌消炎、增強冠狀動脈血流量、降血脂、抑制血小板聚集和清除自由基等生物活性[12-14]。有研究表明，原兒茶醛對食源性致病菌阪崎克羅諾腸桿菌具有良好的抑制作用[15]，而對于植物病原菌青枯雷爾氏菌，原兒茶醛也表現(xiàn)出一定的抑菌活性，100 μg/mL 的原兒茶醛處理后，青枯雷爾氏菌菌體數(shù)量降低99.40%[16]。

圖1 原兒茶醛的結(jié)構(gòu)式Fig.1 Structural formula of protocatechualdehyde

原兒茶醛被證明對一些微生物具有抑制效果，然而，目前原兒茶醛對福氏志賀菌的抑制作用及機理鮮有研究。本文探究原兒茶醛對福氏志賀菌的最小抑菌濃度（Minimal inhibitory concentration，MIC）、最小殺菌濃度（Minimum bactericidal concentration，MBC）以及其對福氏志賀菌細胞形態(tài)、胞內(nèi)ATP、膜電位、蛋白合成和破壞及生長曲線的影響，旨在探究原兒茶醛對福氏志賀菌的抑制作用。

1 材料與方法

1.1 菌株與試劑

原兒茶醛（HPLC≥98%）購于成都曼斯特生物科技有限公司，本研究使用的福氏志賀菌ATCC 12022 購自美國模式培養(yǎng)物集存庫（American Type Culture Collection，ATCC）。該菌株混合于含有體積分數(shù)25%甘油的LB 肉湯中置于-80 ℃保存。LB 瓊脂、LB 肉湯購于北京陸橋技術(shù)股份有限公司；細菌蛋白提取試劑盒購于上海貝博生物科技有限公司；試驗所用其它試劑均為國產(chǎn)分析純級。

1.2 儀器與設(shè)備

SPX-160B 細菌培養(yǎng)箱，上海南榮實驗室設(shè)備有限公司；SmartSpecTMPlus 分光光度計，美國Bio-Rad 公司；微生物全自動生長曲線分析儀，芬蘭Bioscreen 公司；S-4800 場發(fā)射掃描電子顯微鏡，日本Hitachi 公司；SCIENTZ-IID 超聲波裂解儀，寧波新芝生物科技股份有限公司；ChemiDoc MP蛋白凝膠成像儀，美國Bio-Rad 公司；Victor X3多功能酶標儀，珀金埃爾默企業(yè)管理（上海）有限公司。

1.3 方法

1.3.1 菌種活化 將凍存于-80 ℃冰箱的福氏志賀菌ATCC 12022 菌株采用平板劃線法于LB 瓊脂培養(yǎng)基上活化培養(yǎng)18 h，然后挑取單菌落于LB肉湯中，37 ℃搖床培養(yǎng)18 h（130 r/min）。用磷酸鹽緩沖鹽溶液（Phosphate-buffered saline，PBS，pH 7.0）離心清洗菌株兩次（8 000×g、4 ℃、5 min），隨后用LB 肉湯調(diào)整菌懸液濃度使得菌懸液在600 nm 處的光密度（Optical density，OD）即OD600nm=0.5（約3×108CFU/mL），得到備用菌懸液。

1.3.2 最小抑菌濃度和最小殺菌濃度的測定 最小抑菌濃度和最小殺菌濃度的測定具體方法參照美國臨床和實驗室標準協(xié)會采用的肉湯微量稀釋法[17]，具體方法如下：菌液制備同1.3.1 節(jié)，首先使用PBS 洗滌菌體兩次，用LB 肉湯重懸浮后調(diào)整菌懸液的OD600nm=0.5，將上述菌液用LB 肉湯稀釋600 倍（使菌液濃度為5×105CFU/mL）。在96 孔酶標板中接種福氏志賀菌ATCC 12022 懸浮液，每孔100 μL。配制原兒茶醛溶液，將原兒茶醛溶解于體積分數(shù)1%的DMSO 水溶液中，利用等倍稀釋法使原兒茶醛的質(zhì)量濃度分別為4.0，2.0，1.0，0.5，0.25，0.125，0.0625 mg/mL，每孔100 μL 加入96 孔酶標板中，將原兒茶醛溶液與菌懸液吹打均勻于37 ℃培養(yǎng)24 h。以不含有原兒茶醛的菌懸液作為陰性對照，含有體積分數(shù)0.5% DMSO 的LB肉湯為陽性對照。測定培養(yǎng)前、后樣品的OD600nm，若測定值相差小于0.05，則認為測試濃度能夠抑制菌體生長，抑制菌體生長的原兒茶醛的最小濃度即為MIC。然后從能夠抑制細菌生長的不同質(zhì)量濃度的原兒茶醛孔中吸取100 μL 涂布于LB 瓊脂平板上，置于37 ℃培養(yǎng)箱培養(yǎng)48 h 后觀測培養(yǎng)皿中菌的生長狀況，在LB 平板上無菌落生長的最小濃度定義為MBC。

1.3.3 原兒茶醛對福氏志賀菌ATCC 12022 生長曲線的影響 生長曲線的測定按照Guo 等[18]描述的方法。菌液制備同1.3.1 節(jié)，調(diào)整菌懸液的濃度為106CFU/mL。在百孔板中每孔接種125 μL 福氏志賀菌ATCC 12022 菌懸液，然后每孔加入等量的原兒茶醛溶液（溶解于含體積分數(shù)1% DMSO的LB 肉湯中），使最終原兒茶醛質(zhì)量濃度為2×MIC、MIC、1/2×MIC、1/4×MIC、1/8×MIC 和0。以不添加原兒茶醛的菌懸液為對照組，并設(shè)置含有體積分數(shù)0.5% DMSO 的LB 肉湯作為背景空白對照組。樣品放置在微生物全自動生長曲線分析儀中于37 ℃恒溫培養(yǎng)24 h，每隔1 h 檢測記錄

OD600nm，用培養(yǎng)時間和OD600nm繪制生長曲線。

1.3.4 原兒茶醛對福氏志賀菌ATCC 12022 細胞形態(tài)的影響 場發(fā)射掃描電子顯微鏡對福氏志賀菌細胞形態(tài)的觀測參照Lü 等[19]的方法，具體過程如下：首先按照1.3.1 節(jié)所述方法制備菌懸液，配制原兒茶醛溶液質(zhì)量濃度為（0、2×MIC、4×MIC），菌懸液與原兒茶醛溶液混合后置于37 ℃培養(yǎng)箱中培養(yǎng)，分別在3 h 和6 h 取出樣品。將菌液進行離心（5 000×g、4 ℃、5 min），用PBS 清洗菌體2次。隨后用PBS 重懸浮，離心去上清液（5 000×g、4℃、5 min），加入體積分數(shù)2.5%戊二醛于4 ℃初步固定12 h。用PBS 和無菌水先后清洗菌體一次，置于體積分數(shù)1%鋨酸中再次固定8 h。使用30%，50%，70%，80%，90%和100%體積分數(shù)的乙醇梯度洗脫菌體，10 min/次。最后吸取5 μL 樣品于潔凈的玻片上并晾干，玻片在真空狀態(tài)下進行鍍金處理，在場發(fā)射掃描電子顯微鏡下觀測細菌細胞形態(tài)并拍照。

1.3.5 原兒茶醛對福氏志賀菌ATCC 12022 胞內(nèi)ATP 濃度的影響 菌液制備同1.3.1 節(jié)，用LB 肉湯調(diào)整菌懸液濃度使OD600nm=0.5，用不同質(zhì)量濃度（0、2×MIC、4×MIC）的原兒茶醛處理菌體，空白對照組與菌懸液等體積的PBS 溶液，所有樣品于37 ℃恒溫培養(yǎng)30 min。隨后在冰上用超聲波破碎細菌樣品以提取胞內(nèi)ATP，超聲時每個樣品超聲7 min，工作3 s，間隔6 s，探頭位于樣品液面下0.7 cm。每輪超聲結(jié)束后立即將樣品置于100 ℃下處理2 min 滅活樣品中的ATP 酶，處理后將樣品立即置于冰上。隨后離心取上清液（8 000×g、4 ℃、5 min），使用ATP 檢測試劑盒測定胞內(nèi)ATP，分別添加125 μL ATP 檢測工作液及樣品上清液于96孔白色酶標板中，使用多功能酶標儀檢測樣品熒光強度。將ATP 標準溶液稀釋為0.01，0.10，1.00，10.00 μmol/L，用ATP 標準溶液濃度和對應(yīng)的熒光強度值構(gòu)建標準曲線并計算細胞內(nèi)ATP 濃度。

1.3.6 原兒茶醛對福氏志賀菌ATCC 12022 膜電位的影響 原兒茶醛對福氏志賀菌膜電位的影響參照Shi 等[20]的方法測定，菌液制備同1.3.1 節(jié)，使用PBS 清洗菌體兩次并用PBS 重懸浮使OD600nm=0.5。向96 孔黑色酶標板中加入125 μL 菌懸液，所有樣品于37 ℃恒溫培養(yǎng)40 min。隨后向每孔中加入1 μL 濃度為1 μmol/L 細胞膜電位熒光探針DiBAC4（3），37 ℃孵育30 min。加入不同質(zhì)量濃度的原兒茶醛【0（對照組）、2×MIC、4×MIC】處理5 min，隨后使用多功能酶標儀檢測激發(fā)波長/發(fā)射波長為492 m/515 nm 下的熒光強度。其中背景對照組為不含有菌懸液的原兒茶醛（0、2×MIC 和4×MIC）溶液，通過計算處理組檢測所得熒光強度與背景對照組檢測所得熒光強度的差值，得到原兒茶醛作用組的相對熒光強度，細菌膜電位以相對熒光強度表示。

1.3.7 原兒茶醛對福氏志賀菌ATCC 12022 菌體蛋白的影響 原兒茶醛對福氏志賀菌胞內(nèi)可溶性蛋白的影響按照Wang 等[21]的方法測定，通過十二烷基硫酸鈉-聚丙烯酰胺凝膠電泳（Sodium dodecyl sulfate -polyacrylamide gel electrophoresis，SDS-PAGE）分析。按照1.3.1 節(jié)所述方法制備菌懸液，用原兒茶醛溶液【0（對照組）、2×MIC 和4×MIC】處理福氏志賀菌，將樣品置于37 ℃培養(yǎng)箱中培養(yǎng)12 h，用PBS（8 000×g、4 ℃、5 min）進行離心清洗，收集上清液。隨后制備裂解液（2 mL 蛋白提取液，8 μL 蛋白酶抑制劑，20 μL 蛋白穩(wěn)定劑）與樣品充分混勻后置于冰上振蕩30 min，再將樣品于室溫持續(xù)振蕩至澄清。利用BCA 試劑盒測定蛋白樣品濃度，并調(diào)整所有樣品的蛋白濃度為一致，加入上樣緩沖液 【25 μL 100 mmol/L pH 6.8 的Tris-HCl，體積分數(shù)10%十二烷基硫酸鈉（Sodium dodecyl sulfate，SDS），體積分數(shù)0.5%溴酚藍，體積分數(shù)50%甘油，200 mmol/L 二硫蘇糖醇（Dithiothreitol，DTT）】，100 ℃加熱5 min 后冰封，進行SDS-PAGE 分析。電泳后，用考馬斯亮藍R-250 對蛋白條帶進行染色，最后脫色得到分離的蛋白條帶。

1.4 數(shù)據(jù)處理分析

所有數(shù)據(jù)均以平均值±標準差的形式表示（n＝3），利用IBM SPSS 軟件（version 19.0；SPSS，Inc.，Chicago，IL）處理數(shù)據(jù)，采用t檢驗進行分析。若P＜0.05 認為樣本存在顯著差異，P＜0.01 則認為樣本存在極顯著差異。所有試驗均獨立進行，重復(fù)3 次。

2 結(jié)果與分析

2.1 原兒茶醛對福氏志賀菌的MIC 和MBC

本文通過測定MIC 和MBC 反映原兒茶醛對福氏志賀菌的抑菌和殺菌活性。由表1 可知，當原兒茶醛質(zhì)量濃度為0.25 mg/mL 及以下時，樣品培養(yǎng)前后的OD600nm數(shù)值變化大于0.05，當原兒茶醛質(zhì)量濃度為0.5 mg/mL 及以上時，培養(yǎng)前后樣品的OD600nm測定值相差小于0.05。由于樣品培養(yǎng)前與培養(yǎng)24 h 后的OD600nm測定值相差小于0.05 則可認為該測試濃度能夠抑制菌體生長，因此原兒茶醛對福氏志賀菌ATCC 12022 的MIC 為0.5 mg/mL。

表1 不同質(zhì)量濃度原兒茶醛處理前、后的福氏志賀菌ATCC 12022 菌懸液的OD600nm 數(shù)值變化Table 1 Changes of OD600nm values in bacterium suspension with different mass concentrations of protocatechualdehyde before and after against Shigella flexneri ATCC 12022

圖2 為不同質(zhì)量濃度的原兒茶醛處理后的福氏志賀菌菌落生長情況，當原兒茶醛質(zhì)量濃度為8.0 mg/mL 和4.0 mg/mL 時，LB 培養(yǎng)基上無菌落生長（圖2a 和b），表現(xiàn)出原兒茶醛的殺菌作用。當原兒茶醛質(zhì)量濃度為2.0 mg/mL 時，LB 培養(yǎng)基上出現(xiàn)菌落生長（圖2c），且隨著原兒茶醛質(zhì)量濃度的減小，菌落數(shù)量逐漸增加。根據(jù)MBC 的判定原則（1.3.2 節(jié)中的描述），原兒茶醛對福氏志賀菌ATCC 12022 的MBC 為4.0 mg/mL。

圖2 不同質(zhì)量濃度原兒茶醛處理后福氏志賀菌ATCC 12022 的菌落分布Fig.2 Colony distribution of Shigella flexneri ATCC 12022 after treatment with different mass concentrations of protocatechualdehyde

2.2 原兒茶醛對福氏志賀菌生長曲線的影響

試驗測定了質(zhì)量濃度2×MIC～1/8×MIC 的原兒茶醛對福氏志賀菌生長曲線的影響。從圖3 可以看出，質(zhì)量濃度為2×MIC 和MIC 的原兒茶醛完全抑制了福氏志賀菌的生長。此外，與對照組相比，當原兒茶醛質(zhì)量濃度為1/2×MIC、1/4×MIC 和1/8×MIC 時，福氏志賀菌的最大生長量有所下降。并且隨著原兒茶醛質(zhì)量濃度的減小，細菌生長延滯期減小。

圖3 原兒茶醛對福氏志賀菌ATCC 12022生長曲線的影響Fig.3 Effects of protocatechualdehyde on growth curve of Shigella flexneri ATCC 12022

2.3 原兒茶醛對福氏志賀菌細胞形態(tài)的影響

原兒茶醛對福氏志賀菌細胞形態(tài)的影響如圖4所示，未經(jīng)原兒茶醛處理的福氏志賀菌細胞完整，菌體呈短桿狀，形態(tài)飽滿，表面光滑（圖4a 和d），經(jīng)原兒茶醛處理后（圖4b、4c、4e、4f），福氏志賀菌表面粗糙，細胞皺縮。隨著原兒茶醛質(zhì)量濃度和孵育時間的增加，細胞受損程度增大。經(jīng)4×MIC的原兒茶醛處理6 h 后（圖4f），福氏志賀菌菌體出現(xiàn)大面積塌陷，喪失了其固有形態(tài)。

圖4 場發(fā)射掃描電子顯微鏡觀測原兒茶醛對福氏志賀菌ATCC 12022 細胞形態(tài)的影響（20 000×）Fig.4 Effects of protocatechuic aldehyde on the morphology of Shigella flexneri ATCC 12022 cells observed by field emission scanning electron microscope（20 000×）

2.4 原兒茶醛對福氏志賀菌胞內(nèi)ATP 的影響

試驗利用螢火蟲熒光素酶檢測原兒茶醛對福氏志賀菌胞內(nèi)ATP 的影響。試驗結(jié)果表明，ATP標準溶液濃度（x）與相對熒光強度（y）具有良好的線性關(guān)系（y＝91376x＋7171.4，R2＝0.9999），因此，可以根據(jù)ATP 的標準曲線計算各組樣品中胞內(nèi)ATP 的濃度。如圖5所示，不經(jīng)原兒茶醛處理的對照組胞內(nèi)ATP 濃度為（1.66±0.02）μmol/L，經(jīng)2×MIC 質(zhì)量濃度的原兒茶醛處理的細菌胞內(nèi)ATP濃度為（0.25±0.02）μmol/L，而經(jīng)4×MIC 質(zhì)量濃度的原兒茶醛處理的細菌胞內(nèi)ATP 濃度為（0.13±0.01）μmol/L。數(shù)據(jù)分析可知，原兒茶醛對福氏志賀菌胞內(nèi)ATP 濃度具有極顯著的降低作用（P＜0.01）。而對比2×MIC 和4×MIC 濃度的原兒茶醛處理，細菌胞內(nèi)ATP 濃度之間無顯著差異（P≥0.05）。

圖5 原兒茶醛對福氏志賀菌ATCC 12022胞內(nèi)ATP 的影響Fig.5 Effects of protocatechualdehyde on intracellular ATP production by Shigella flexneri ATCC 12022

2.5 原兒茶醛對福氏志賀菌膜電位的影響

試驗通過檢測DiBAC4（3）熒光染料與細菌胞漿內(nèi)蛋白結(jié)合后發(fā)出的熒光強度，來指示細胞膜電位的變化。試驗結(jié)果表明，原兒茶醛處理后，福氏志賀菌細菌膜電位相比于對照組有極顯著的差異（P＜0.01）。如圖6所示，與對照組相比，經(jīng)過原兒茶醛處理的福氏志賀菌細胞顯示出熒光強度降低，表示細菌細胞膜電位出現(xiàn)超極化現(xiàn)象，且經(jīng)質(zhì)量濃度為4×MIC 原兒茶醛處理比質(zhì)量濃度為2×MIC 原兒茶醛處理后的變化現(xiàn)象更加明顯。

圖6 原兒茶醛對福氏志賀菌ATCC 12022細胞膜電位的影響Fig.6 Effects of protocatechualdehyde on the membrane potentials of Shigella flexneri ATCC 12022

2.6 原兒茶醛對福氏志賀菌菌體蛋白的影響

原兒茶醛對福氏志賀菌菌體蛋白的影響如圖7所示。未經(jīng)處理的福氏志賀菌細胞有清晰度較高的蛋白條帶。與對照組相比，2×MIC 和4×MIC質(zhì)量濃度的原兒茶醛處理后的細菌細胞的蛋白條帶清晰度明顯減弱，且質(zhì)量濃度為4×MIC 原兒茶醛處理后的變化現(xiàn)象比2×MIC 明顯。

圖7 SDS-PAGE 分析原兒茶醛對福氏志賀菌ATCC 12022 菌體蛋白的影響Fig.7 SDS-PAGE analysis of the effect of protocatechualdehyde on intracellular proteins of Shigella flexneri ATCC 12022

3 討論

植物源活性物質(zhì)是從植物中提取的有效活性成分。近年來，一些食源性致病菌已被證明可利用植物源活性物質(zhì)進行抑制和殺滅，如沙門氏菌、金黃色葡萄球菌、李斯特菌、副溶血性弧菌和銅綠假單胞菌等[22-23]，這為食源性致病菌的控制提供了新的方法。福氏志賀菌作為一種重要的食源性致病菌，是引起人類腹瀉的重要原因之一，具有高度傳染性并且嚴重危害人類的健康和生命安全[24]。目前，天然植物源活性物質(zhì)對福氏志賀菌的抑殺作用及機理研究報道較少。本文旨在探究原兒茶醛對福氏志賀菌的抑制作用及可能的機理。

本試驗結(jié)果表明原兒茶醛對福氏志賀菌ATCC 12022 有良好的抑殺作用，其MIC 為0.5 mg/mL，MBC 為4.0 mg/mL。前期一些研究也探究了部分天然化合物對福氏志賀菌的抑殺作用，Kang 等[25]通過肉湯稀釋法測定了沒食子酸對福氏志賀菌的MIC 為2.0 mg/mL，MBC 為8.0 mg/mL。Chan 等[26]證明了巴丹桂皮、中國肉桂和牛至提取物對福氏志賀菌具有一定的抑菌效果，且MIC 都大于2.5 mg/mL。Oh 等[27]發(fā)現(xiàn)綠茶提取物對福氏志賀菌有抗菌作用，其MIC 為10.0 mg/mL。對比于以上已報道的對福氏志賀菌有抑菌效果的物質(zhì)，原兒茶醛對福氏志賀菌具有良好的抑殺效果。

本研究利用場發(fā)射掃描電鏡觀測了原兒茶醛對福氏志賀菌細胞形態(tài)的影響，發(fā)現(xiàn)原兒茶醛可使福氏志賀菌表面干癟皺縮，但沒有造成細胞表面出現(xiàn)孔洞以及細胞破碎（圖4）。Shi 等[15]發(fā)現(xiàn)質(zhì)量濃度為4×MIC 原兒茶醛作用于阪崎克羅諾桿菌后，菌體表面粗糙凹陷，且受損程度和數(shù)量隨原兒茶醛質(zhì)量濃度的增加而增大。Becerril 等[28]觀測發(fā)現(xiàn)月桂酰精氨酸乙酯處理5 min 時大腸桿菌細胞外觀發(fā)生不規(guī)則改變，表面有明顯的孔隙形成，菌體嚴重皺縮并出現(xiàn)破裂的細菌。本研究未發(fā)現(xiàn)福氏志賀菌表面破裂，推測細胞形態(tài)改變是由于原兒茶醛處理后菌體細胞膜透性增強，從而使內(nèi)容物流出，使細胞形態(tài)發(fā)生變化。

原兒茶醛可以極顯著降低（P＜0.01）福氏志賀氏菌ATCC 12022 細胞內(nèi)ATP 的濃度，且呈質(zhì)量濃度依賴性（圖5）。Peng 等[29]發(fā)現(xiàn)與對照組相比，經(jīng)質(zhì)量濃度為MIC 和2×MIC 橄欖油多酚提取物處理細菌2 h 后，細菌胞內(nèi)ATP 濃度顯著降低（P＜0.05），推測可能是細菌細胞膜完整性受到破壞以及驅(qū)動ATP 合成的質(zhì)子動力勢的消耗導(dǎo)致胞內(nèi)ATP 丟失。Burt 等[30]報道了香芹酚作用于蠟樣芽孢桿菌細胞后，細菌胞內(nèi)ATP 濃度下降，而細胞外ATP 濃度沒有相應(yīng)增加，認為可能是由于ATP水解速率增加造成的。同樣的，Paul 等[31]研究了MIC 質(zhì)量濃度的沙棘果精油處理枯草芽孢桿菌ATCC 6633 30 min 后，細胞外ATP 濃度顯著增加（P＜0.05），并觀察到細菌的膜結(jié)構(gòu)被精油破壞，表明這種現(xiàn)象是由于精油引起的細胞膜損傷或者細胞膜通透性增加所致。在本研究中，胞內(nèi)ATP 濃度的降低可能是由于原兒茶醛增加了福氏志賀菌自身ATP 水解的速度，另一方面可能是由于原兒茶醛使細胞膜的通透性增強，使得細胞內(nèi)ATP 流出，此原因與場發(fā)射掃描電鏡試驗中推測原因相同。

膜電位在細胞對抗生素的吸收和殺菌過程中起著重要的作用，膜電位的變化與細胞的通透性有關(guān)[32]。本研究發(fā)現(xiàn)，與對照組相比，經(jīng)原兒茶醛處理后的細菌細胞膜電位降低，即引起細胞膜超極化。Zhang 等[33]用羅丹明123 熒光染料測定膜電位的變化，發(fā)現(xiàn)與對照相比，經(jīng)0.5×MIC～2×MIC質(zhì)量濃度的香附香精油處理的金黃色葡萄球菌細胞熒光強度顯著降低（P＜0.05），即精油作用后的金黃色葡萄球菌細胞膜呈現(xiàn)超極化。Cho 等[34]研究表明野山藥中提取的薯蕷皂苷對白色念珠菌膜電位呈現(xiàn)去極化作用，推測熒光強度的增加可能是由于細胞膜受損，導(dǎo)致膜電位發(fā)生去極化所致。Bot 等[32]發(fā)現(xiàn)細胞膜電位發(fā)生超極化或去極化是由于抑菌物質(zhì)影響了細菌細胞膜上離子的運動，特別是K＋，從而影響胞體的自動調(diào)節(jié)，使得菌體細胞膜電位出現(xiàn)極化現(xiàn)象。

蛋白質(zhì)是生物合成的基礎(chǔ)，在細菌細胞的生命活動中起著至關(guān)重要的作用。Wang 等[21]利用SDS-PAGE 研究了乳酸對沙門氏菌、大腸桿菌、單核增生李斯特菌等可溶性蛋白的影響，發(fā)現(xiàn)乳酸能夠通過破壞或抑制細菌蛋白質(zhì)合成導(dǎo)致細菌死亡。Chen 等[35]報道稱金黃色葡萄球菌、單核增生李斯特菌、大腸桿菌和鼠傷寒沙門氏菌經(jīng)甜菜糖蜜多酚處理后蛋白質(zhì)含量明顯降低。本試驗利用SDS-PAGE 分析發(fā)現(xiàn)原兒茶醛能夠破壞福氏志賀菌的蛋白質(zhì)或抑制蛋白質(zhì)的合成，進而干擾細菌的能量代謝。

4 結(jié)論

綜上所述，本研究結(jié)果表明原兒茶醛對福氏志賀菌具有較好的抑制作用，其通過降低細菌胞內(nèi)ATP 濃度，作用于細胞膜改變細胞膜電位使其出現(xiàn)超極化現(xiàn)象，影響菌體形態(tài)使細胞表面干癟皺縮，破壞蛋白質(zhì)或抑制蛋白質(zhì)合成，導(dǎo)致細菌正常的生理功能紊亂從而達到抑菌效果。研究結(jié)果為原兒茶醛作為一種有潛力的、天然安全的抑菌物質(zhì)提供了理論依據(jù)。然而，原兒茶醛對福氏志賀菌的其它抑菌作用機制以及其在食品生產(chǎn)加工中的應(yīng)用方式需要在實際應(yīng)用前進一步探討。