番石榴葉藥材質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)研究

鮑 鋒 趙室梅 楊 文 孫 剛 李開斌

貴州省安順市食品藥品檢驗(yàn)所，貴州 安順 561000

番石榴葉別名雞矢茶、番桃葉等，為桃金娘科植物番石榴(PsidiumguajavaLinn)的干燥葉，在沿海及西南諸省均有分布[1-3]。其性平，味澀，微苦。歸大腸、肝經(jīng)，具有燥濕健脾，清熱解毒，收斂止瀉的功效；主治瀉痢腹痛、食積腹脹、齒齦腫痛、風(fēng)濕痹痛、濕疹臁瘡、疔瘡腫毒、跌打損傷、外傷出血、蛇蟲咬傷等[1-3]。現(xiàn)代藥理研究[5-8]表明番石榴葉主要具有降血糖血脂、抗氧化、抗病毒、抗菌抗、腫瘤等活性。番石榴葉主要含萜類、黃酮類、酚類、多糖、揮發(fā)油等成分，黃酮類是其重要的活性成分[9-11]，選擇黃酮類作為該藥材的質(zhì)量控制指標(biāo)，以金絲桃苷[12]和異槲皮苷作為質(zhì)量評(píng)價(jià)指標(biāo)，采用HPLC測(cè)定其含量，進(jìn)行質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)研究，為規(guī)范藥材質(zhì)量，保證臨床療效提供科學(xué)依據(jù)。

1 儀器與材料

1.1 儀器 Agilent 1260高效液相色譜儀(美國(guó)安捷倫公司)；梅特勒AB-265型電子天平(瑞士梅特勒托利多公司)；TU-1901型雙光束紫外可見分光光度計(jì)(北京普析通用儀器有限責(zé)任公司)；LEIKCA DM500顯微鏡和LAS EZ顯像系統(tǒng)(德國(guó)萊卡公司)；DHG-9041A型電熱恒溫干燥箱(上海精宏實(shí)驗(yàn)設(shè)備有限公司)。

1.2 材料 番石榴葉藥材由課題組采自貴州，廣西和廣東等地，具體信息見表1，由貴州中醫(yī)藥大學(xué)藥學(xué)院藥用植物栽培與鑒定教研室魏生華教授鑒定為桃金娘科植物番石榴(PsidiumguajavaLinn)的干燥葉；乙腈為色譜純( 天津市科密歐化學(xué)試劑有限公司)，其余所用試藥試劑均為分析純；番石榴葉對(duì)照藥材由中國(guó)食品藥品檢定研究院提供(批號(hào):121212-0101)、槲皮素對(duì)照品(批號(hào)：100081-201610)、金絲桃苷對(duì)照品(批號(hào):111521-201507，含量94.3%)、異槲皮苷對(duì)照品(批號(hào):111809-201403，含量92.9%)均由中國(guó)食品藥品檢定研究院提供。

表1 供試樣品來源表

2 方法與結(jié)果

2.1 性狀鑒別[13]番石榴葉藥材性狀為皺縮、卷曲或破碎，完整者展平后呈長(zhǎng)橢圓形或長(zhǎng)卵形，長(zhǎng)5～13cm，寬3～6cm；先端急尖或鈍，基部鈍圓形，全緣。上表面深綠色至棕黃綠色，疏生黑褐色小腺點(diǎn)，嫩時(shí)疏生短毛；下表面暗綠色至灰褐色，密被白色短柔毛，主脈隆起，側(cè)脈7～11對(duì)，于近邊緣處相連。質(zhì)硬而脆。氣微，揉之有香氣，味澀。如圖1所示。

圖1 番石榴葉藥材圖

2.2 顯微鑒別[13]

2.2.1 橫切面 通過觀察番石榴葉的橫切片，其顯微鑒別特征如下。

上表皮為1列細(xì)胞，扁平，有的向外突起形成非腺毛；上表皮下方厚角組織3～7層，下表皮細(xì)胞較小，下表皮厚角組織2～3層，均有含晶細(xì)胞及溶生型分泌腔分布。海綿組織不發(fā)達(dá)，草酸鈣簇晶分布于葉肉組織。主脈維管束外韌型，束鞘纖維斷續(xù)成環(huán)[15]。如圖2所示。

1.上表皮；2.厚角組織；3.木質(zhì)部；4.韌皮部；5.分泌腔； 6.下表皮；7.海綿組織。番石榴葉橫切面1.草酸鈣晶體；2.上表皮；3.韌皮部；4.厚角組織；5.分泌腔；6.木質(zhì)部。番石榴葉橫切(主脈維管束)圖2 番石榴葉藥材橫切圖

2.2.2 葉表面觀 上表皮細(xì)胞類方形或不規(guī)則多邊形，排列緊密，細(xì)胞壁稍增厚，氣孔稀少；上表皮散在的油細(xì)胞較多，油細(xì)胞周圍被7～9個(gè)排列整齊的表皮細(xì)胞包圍；上表皮細(xì)胞內(nèi)含有較多草酸鈣簇晶。下表皮細(xì)胞多為多邊形；氣孔較密集，均為平軸式，保衛(wèi)細(xì)胞新月形，副衛(wèi)細(xì)胞2個(gè)；單細(xì)胞非腺毛較多，油細(xì)胞分布較稀疏。如圖3所示。

番石榴葉上表皮顯微特征圖 番石榴葉下表皮顯微特征圖圖3 番石榴葉藥材葉表皮顯微圖(×40)

2.2.3 粉末鑒別 通過對(duì)10個(gè)藥材樣品的粉末進(jìn)行觀察和測(cè)量，其顯微鑒別特征總結(jié)如下：本品粉末呈黃綠色或草綠色；非腺毛單細(xì)胞，有的初生壁與次生壁分離皺縮，長(zhǎng)20～350 μm，直徑約10 μm。草酸鈣簇晶多見，直徑10～30 μm，偶見菱晶。導(dǎo)管多成束，多為螺紋導(dǎo)管, 偶見網(wǎng)紋導(dǎo)管, 直徑8～20 μm；纖維多成束散在，長(zhǎng)條形，直徑約12 μm；表皮細(xì)胞多見，類方形或不規(guī)則多角形；氣孔突起，副衛(wèi)細(xì)胞2個(gè)。分泌腔多破碎，完整者呈類圓形或類長(zhǎng)圓形，周圍分泌細(xì)胞含淡黃色或棕色物。如圖4所示。

1.草酸鈣結(jié)晶(a、簇晶 b、棱晶); 2.導(dǎo)管(a、螺紋 b、網(wǎng)紋);3.纖維束;4.非腺毛;5.表皮細(xì)胞圖4 番石榴葉藥材粉末顯微圖(×40)

2.3 對(duì)照品鑒別

2.3.1 對(duì)照品薄層鑒別[13]取本品粉末1 g，精密加入80%乙醇20 mL，鹽酸1 mL，加熱回流1 h，濾過，濃縮濾液至5 mL作為供試品溶液，另取槲皮素對(duì)照品，加80%的乙醇制成每1 mL含0.1 mg的溶液，作為對(duì)照品溶液。吸取上述兩種溶液各3μL，分別點(diǎn)于同一硅膠G薄層板上，以二氯甲烷-乙酸乙酯-甲酸(4∶3∶0.5)為展開劑，展開，取出，晾干，噴以3%的三氯化鋁乙醇溶液，置紫外光燈(365 nm)下檢視。供試品色譜圖中，在與對(duì)照品相應(yīng)位置上，顯相同顏色的熒光斑點(diǎn)。如圖5所示。

S1～S10.10批番石榴葉藥材a槲皮素對(duì)照品圖5 番石榴葉藥材樣品TCL圖

2.3.2 對(duì)照藥材薄層色譜鑒別 取番石榴葉粉末1 g置錐形瓶中，加水20 mL，加熱回流30 min,放冷，過濾，濾液用乙醚萃取兩次，每次10 mL，合并乙醚層，蒸干，殘?jiān)? mL乙醚溶解作為供試品溶液，另取番石榴葉對(duì)照藥材，同法制得對(duì)照藥材溶液。吸取上述兩種溶液各3μL，分別點(diǎn)于同一硅膠G薄層板上，以二氯甲烷-乙酸乙酯-甲酸(6∶4∶1)為展開劑，展開，取出，晾干，噴以5%的香草醛硫酸溶液，熱風(fēng)吹至斑點(diǎn)清晰，在與對(duì)照藥材相應(yīng)位置上，顯相同顏色的熒光斑點(diǎn)。如圖6所示。

S1～S10.10批番石榴葉藥材 A1番石榴葉對(duì)照藥材圖6 各樣品TLC圖

2.4 成分檢查 對(duì)10批不同產(chǎn)地番石榴葉藥材進(jìn)行檢查。

2.4.1 水分 按照中國(guó)藥典2015年版(四部)通則0832第二烘干法[4]測(cè)定10批藥材的含水量為10.1%～13.6%，平均值11.3%。

2.4.2 總灰分 按照中國(guó)藥典2015年版(四部)通則2302灰分規(guī)定項(xiàng)下總灰分測(cè)定[4]測(cè)定10批藥材中總灰分的含量為4.8%～6.9%，平均值5.5%，暫定總灰分6.5%。結(jié)果見表2。

2.4.3 酸不溶性灰分 按照中國(guó)藥典2015年版(四部)通則 2302灰分規(guī)定項(xiàng)下酸不溶性灰分測(cè)定法[4]測(cè)定10批藥材中酸不溶性灰分的含量為0.1%～0.6%，平均值0.3%。結(jié)果見表2。

表2 10批番石榴葉藥材的檢查項(xiàng)測(cè)定結(jié)果 (n=10)

2.4.4 醇溶性浸出物 按照中藥典2015年版(四部)通則 2201醇溶性浸出物項(xiàng)下熱浸法測(cè)定[4]。 以70%乙醇為溶劑，測(cè)定10批藥材中醇溶性浸出物的含量為浸出物在18.6%～35.2%范圍內(nèi)，平均值為29.2%。

2. 5 樣品含有量測(cè)定

2.5.1 色譜條件[14]色譜柱為Agilent XDB-C18柱(4.6 mm×250 mm，5 μm)；流動(dòng)相為乙腈-0.1%甲酸水溶液(13∶87)恒度洗脫，柱溫25 ℃，檢測(cè)波長(zhǎng)257 nm；流速1.0 mL/min；進(jìn)樣體積為10 μL。在此色譜條件下，其他成分對(duì)金絲桃苷、異槲皮苷的色譜峰無干擾。 對(duì)照品及樣品色譜圖。如圖7所示。

2.5.2 標(biāo)準(zhǔn)溶液的制備[14]分別精密稱取金絲桃苷對(duì)照品10.61 mg，異槲皮苷對(duì)照品10.78 mg，分別置100 mL量瓶中，加甲醇溶解并稀釋至刻度，作為對(duì)照品貯備液。精密量取對(duì)照品貯備液各3 mL于同一25 mL容量瓶中，加60%甲醇溶液稀釋至刻度即得。

2.5.3 供試品溶液的制備[14]取番石榴葉粉末(過四號(hào)篩)約0.2g，精密稱定，置25 mL容量瓶中，加入60%甲醇20 mL，超聲提取(功率500W,頻率40kHz)40 min，取出放冷，用60%甲醇稀釋至刻度，搖勻，用0.45 μm微孔濾膜濾過，取續(xù)濾液即得。

2.5.4 方法學(xué)考察[14]線性關(guān)系考察、穩(wěn)定性和重復(fù)性考察，儀器精密度、加樣回收率試驗(yàn)和耐用性考察均滿足含量測(cè)定要求。

2.5.5 樣品測(cè)定 對(duì)表1所有樣品照2.5.3項(xiàng)下方法提取供試品溶液，測(cè)定含量，按干燥品計(jì)算藥材中金絲桃苷與異槲皮苷的總量，結(jié)果見表3，HPLC 色譜圖如圖7所示。

圖7 混合對(duì)照品HPLC圖

圖8 10批番石榴葉藥材HPLC圖

表3 各成分含有量測(cè)定結(jié)果 (n=3)

3 討論

3. 1 薄層色譜條件選擇 槲皮素薄層鑒別時(shí)，考察甲苯-氯仿-丙酮-甲酸(8∶5∶7∶1)[13]、三氯甲烷-乙酸乙酯-甲酸、二氯甲烷-乙酸乙酯-甲酸等展開系統(tǒng)，結(jié)果選用二氯甲烷-乙酸乙酯-甲酸(4∶3∶0.5)為展開劑，噴以3%三氯化鋁乙醇溶液，置紫外光燈(365 nm)下檢視，結(jié)果分離度好、斑點(diǎn)清晰。對(duì)照藥材鑒別時(shí)，考察甲苯-三氯甲烷-甲酸、三氯甲烷-丙酮-甲酸和二氯甲烷-乙酸乙酯-甲酸等展開系統(tǒng)，結(jié)果選二氯甲烷-乙酸乙酯-甲酸(6∶4∶1)為展開劑，展開，取出，晾干，噴以5%的香草醛硫酸溶液，熱風(fēng)吹至斑點(diǎn)清晰，日光下檢視，結(jié)果分離度好、斑點(diǎn)清晰，斑點(diǎn)色彩層次分明。結(jié)合對(duì)照品與對(duì)照藥材鑒別，該方法具有簡(jiǎn)便易行、分離度好、斑點(diǎn)清晰、特征性強(qiáng)等優(yōu)點(diǎn)，可以作為番石榴葉藥材的鑒別。

3.2 對(duì)照品分析 10批樣品都含有金絲桃苷和異槲皮苷，但從含量測(cè)定結(jié)果看，不同產(chǎn)地批次之間兩者含量差異較大，同產(chǎn)地不同采收時(shí)間兩者之間也存在較大差異。 但總體來說，10批番石榴葉藥材金絲桃苷與異槲皮苷總量均超過0.3%，含量是否與采收時(shí)間、產(chǎn)地和保存條件和保存時(shí)間有關(guān)聯(lián)，課題組將繼續(xù)探索。

3. 3 HPLC條件選擇 分別考察了甲醇-水、乙腈-水、甲醇-水 ( 含 0.1% 甲酸) 、乙腈-水(含0.1%甲酸)等不同比例洗脫溶劑對(duì)HPLC色譜圖的影響，結(jié)果顯示乙腈-水(含0.1%甲酸) 為較優(yōu)洗脫溶劑; 并結(jié)合全波長(zhǎng)掃描，結(jié)果顯示在“2.5.1”項(xiàng)色譜條件下，化合物分離效果最好。

3.4 含有量限度確定 考察了10批番石榴葉藥材，金絲桃苷與異槲皮苷含有量差異較大，兩者的總量介于2.586～5.887 mg/g，平均含有量 4.124 mg/g；故應(yīng)以最低測(cè)定值設(shè)限，可暫定番石榴葉中黃酮醇苷限度應(yīng)≥2.5mg/g。初步用于控制該藥材質(zhì)量，為制定番石榴葉的質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)提供科學(xué)依據(jù)。

本文對(duì)番石榴葉藥材質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)作了較深入的研究，提出了較系統(tǒng)的質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)方案，為番石榴葉質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)的制定提供了較詳實(shí)的實(shí)驗(yàn)室研究基礎(chǔ)，但在有害元素、農(nóng)藥殘留及真菌毒素等方面的控制與安全評(píng)價(jià)的研究尚未開展，課題組還有待進(jìn)一步研究。