石斑魚肉肽粉的氨基酸組成分析與營養(yǎng)價(jià)值評價(jià)

徐杰,廖津,林澤安,唐振冬,范秀萍,3,4*,孫欽秀,3,4,劉書成,3,4*,蘇偉明

1(廣東海洋大學(xué) 食品科技學(xué)院,廣東省水產(chǎn)品加工與安全重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室,廣東省海洋食品工程技術(shù)研究中心,水產(chǎn)品深加工廣東普通高等學(xué)校重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室,廣東 湛江,524088)2(暨南大學(xué) 食品科學(xué)與工程系,廣東 廣州,510632) 3(南方海洋科學(xué)與工程廣東省實(shí)驗(yàn)室(湛江),廣東 湛江,524088) 4(海洋食品精深加工關(guān)鍵技術(shù)省部共建協(xié)同創(chuàng)新中心,大連工業(yè)大學(xué),遼寧 大連,116034)

珍珠龍膽石斑魚(♀Epinephelusfuscoguttatus×♂E.lanceolatus),屬于鱸形目、鮨科、石斑魚屬,具有成長快、病害少、抗逆性強(qiáng)、肉質(zhì)細(xì)膩、營養(yǎng)豐富等優(yōu)點(diǎn),是我國南方海水養(yǎng)殖的重要經(jīng)濟(jì)魚類之一,年產(chǎn)量高達(dá)10萬t,產(chǎn)值超100億元[1-3]。其銷售主要以活魚為主,但由于?；盍魍夹g(shù)的限制,其死亡率較高,死亡石斑魚的銷售價(jià)格大大降低。針對死亡的珍珠龍膽石斑魚,采用一些技術(shù)手段開發(fā)高附加值產(chǎn)品(如酶解制備活性肽、提取魚油等),可以提高其經(jīng)濟(jì)價(jià)值。

目前,利用水產(chǎn)蛋白通過酶解制備生物活性肽是科學(xué)研究和消費(fèi)市場關(guān)注的熱點(diǎn)之一。因?yàn)檫@類生物活性肽具有抗氧化、降血壓、抗凝血、提高免疫力等多種生理功能,且容易被機(jī)體吸收[4-7]。珍珠龍膽石斑魚肉是一種優(yōu)質(zhì)蛋白質(zhì)來源(85.19%,干背基),必需氨基酸(essential amino acid,EAA)含量高(34.56%,干背基)[8],是開發(fā)生物活性肽的優(yōu)質(zhì)原料。本研究以?；盍魍ㄟ^程中死亡的珍珠龍膽石斑魚為對象,采用生物酶解制備小分子肽,并對其超濾處理,分析超濾組分的蛋白質(zhì)含量和氨基酸組成,評價(jià)其營養(yǎng)價(jià)值,為利用珍珠龍膽石斑魚肉酶解產(chǎn)物開發(fā)生物活性肽提供基礎(chǔ)數(shù)據(jù),實(shí)現(xiàn)其高值化利用。

1 材料與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)材料

珍珠龍膽石斑魚是實(shí)驗(yàn)室?；盍魍ㄔ囼?yàn)中剛死亡的魚,魚體完整、健康,個(gè)體質(zhì)量為(500±50)g。取魚肌肉,經(jīng)高速組織搗碎機(jī)搗碎后,等量分裝,-20 ℃冰箱保存?zhèn)溆谩?/p>

風(fēng)味蛋白酶(酶活力30 000 U/g),廣西南寧東恒華道生物科技有限責(zé)任公司；檸檬酸鈉,上海碧云天生物技術(shù)有限公司；分子標(biāo)準(zhǔn)品：桿菌酶(M：1 450 Da)、乙氨酸-乙氨酸-酪氨酸-精氨酸(M：451 Da)、乙氨酸-乙氨酸-乙氨酸(M：189 Da)、乙腈(色譜純),西格瑪奧德里奇(上海)貿(mào)易有限公司；羥脯氨酸測試盒,南京建成生物工程研究所；鹽酸(優(yōu)級純),國藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司；其他試劑均為國產(chǎn)分析純。

1.2 儀器與設(shè)備

HHS型電熱恒溫水浴鍋,上海博迅實(shí)業(yè)有限公司醫(yī)療設(shè)備廠；BSA224S-CW型萬分之一電子天平,賽多利斯科學(xué)儀器(北京)有限公司；Varioskan Flash型酶標(biāo)儀,美國賽默飛世爾科技公司；pHS-3C型雷磁pH計(jì),上海儀電科學(xué)儀器股份有限公司；VAP450型全自動(dòng)凱氏定氮儀,德國格哈特分析儀器有限公司；L-8900型全自動(dòng)氨基酸分析儀,日本日立公司；LC20AD型高效液相色譜儀,日本島津公司。

1.3 實(shí)驗(yàn)方法

1.3.1 石斑魚肉酶解產(chǎn)物超濾組分的制備

采用課題組前期優(yōu)化的酶法工藝[9]制備珍珠龍膽石斑魚肉酶解產(chǎn)物(enzymatic hydrolysates,EH)：魚肉與水的比例1∶3.5(g∶mL)、pH 7、溫度53 ℃、風(fēng)味蛋白酶添加量1 050 U/g,酶解5.5 h后煮沸滅酶,再冷卻至室溫,離心取上清液。分別采用8 k、5 k、3 kDa的超濾膜對酶解液進(jìn)行分離,獲得4種組分：EH-1(>8 kDa)、EH-2(5 k～8 kDa)、EH-3(3 k～5 kDa)和EH-4(<3 kDa)；對4種組分分別進(jìn)行蒸發(fā)濃縮和真空冷凍干燥,獲得4種魚肉肽粉產(chǎn)品。

1.3.2 蛋白質(zhì)含量測定

參考GB 5009.5—2016《食品安全國家標(biāo)準(zhǔn) 食品中蛋白質(zhì)的測定》,采用凱式定氮法測定魚肉肽粉的蛋白質(zhì)含量。

1.3.3 膠原蛋白含量測定

羥脯氨酸主要存在于膠原蛋白中,而在其他蛋白中含量較少,甚至不存在。本實(shí)驗(yàn)采用試劑盒法測定魚肉肽粉中的羥脯氨酸含量,然后乘以換算系數(shù)轉(zhuǎn)換為膠原蛋白含量。水生動(dòng)物的換算系數(shù)一般為11.1[10],膠原蛋白含量計(jì)算如公式(1)所示：

膠原蛋白含量/(μg·mg-1)=羥脯氨酸含量(μg·mg-1)×11.1

(1)

1.3.4 氨基酸組成測定

參考GB 5009.124—2016《食品安全國家標(biāo)準(zhǔn) 食品中氨基酸的測定》,采用酸水解進(jìn)行前處理后測定魚肉肽粉的氨基酸組成。

1.3.5 相對分子質(zhì)量分布測定

參考GB/T 22729—2008《海洋魚低聚肽粉》,采用高效凝膠過濾色譜法測定魚肉肽粉的相對分子質(zhì)量分布。

1.3.6 營養(yǎng)價(jià)值評價(jià)

采用氨基酸評分(amino acid score,AAS)、化學(xué)評分(chemical score,CS)、氨基酸比值(ratio of amino acid,RAA)、氨基酸比值系數(shù)(ratio coefficient,RC)、氨基酸比值系數(shù)分(score of ratio coefficient,SRC),對魚肉肽粉進(jìn)行營養(yǎng)價(jià)值評價(jià)[11-12]。

1.3.7 數(shù)據(jù)處理與分析

每個(gè)試驗(yàn)重復(fù)3次,數(shù)據(jù)用平均值±標(biāo)準(zhǔn)差表示；用SPSS軟件進(jìn)行單因素方差分析和Duncan多重比較進(jìn)行組間顯著性分析,P<0.05表示顯著性差異。

2 結(jié)果與分析

2.1 魚肉肽粉的粗蛋白和膠原蛋白含量測定

從表1可知,石斑魚肉肽粉中粗蛋白含量較高,達(dá)到63%以上,是優(yōu)質(zhì)的蛋白質(zhì)來源。包斐[13]采用酶解法制備長蛇鯔魚肉蛋白粉,其蛋白含量高達(dá)74.68%,略高于本實(shí)驗(yàn)結(jié)果,這可能與酶解制備工藝有關(guān),還可能與魚的品種有關(guān)。石斑魚肉肽粉的膠原蛋白含量較低,在5%左右。張延華等[14]測定了鱸魚、鮻魚、草魚和鯉魚等魚肉中的膠原蛋白,其含量與本實(shí)驗(yàn)結(jié)果接近。雖然石斑魚肉肽粉中膠原蛋白含量偏低,但其具有較強(qiáng)的抗氧化等生物活性,可以增強(qiáng)其肽粉的功能特性。

表1 魚肉肽粉的粗蛋白與膠原蛋白含量 單位：g/100 g

2.2 魚肉肽粉的氨基酸組成

從表2可知,EH-2未檢出天冬氨酸和絲氨酸,EH、EH-1、EH-3、EH-4均含有16種氨基酸；5種魚肉肽粉均含有7種人體EAA(色氨酸未測),總氨基酸含量(total amino acids,TAA)在16.47～18.81 g/100 g,EAA含量在11.11～13.44 g/100 g,其EAA占TAA的比例在67.09%～71.52%。F值是指支鏈氨基酸(亮氨酸、異亮氨酸、纈氨酸)與芳香族氨基酸(苯丙氨酸、酪氨酸)含量的比值,F值越大說明蛋白質(zhì)潛在的生物活性可能越好[15]。從表2可知,魚肉肽粉經(jīng)過超濾分離后,各分離組分的F值比未分離EH高,說明超濾分離可以提高肽粉的潛在生物活性功能。

從表2還可知,石斑魚肉肽粉的亮氨酸含量最高(2.95～3.85 g/100 g),較高的亮氨酸水平飲食對激活胰島素信號(hào)通路有著重要作用,從而增強(qiáng)機(jī)體的糖酵解和脂肪酸的合成[16],此外,與亮氨酸同屬于支鏈氨基酸的纈氨酸和異亮氨酸的含量也比較豐富,有增強(qiáng)免疫力、防止肌肉損傷的功能。石斑魚肉肽粉的賴氨酸含量也較高,占氨基酸總量的8.6%以上。賴氨酸是谷物類食品的第一限制氨基酸,故石斑魚肉肽粉可作為以谷物為主的膳食模式的賴氨酸補(bǔ)充劑,同時(shí)賴氨酸還具有促鈣吸收、促食欲、促進(jìn)幼兒生長發(fā)育、減輕焦慮等功能[17]。石斑魚肉肽粉的苯丙氨酸含量也較高,達(dá)到了1.96 g/100 g以上。苯丙氨酸可以調(diào)節(jié)人體中酪氨酸的濃度[18],合成神經(jīng)遞質(zhì)和激素,參與機(jī)體代謝。石斑魚魚肉肽粉的精氨酸同樣含量豐富,均在1.7 g/100 g以上,占TAA含量的10%左右。精氨酸是嬰兒的EAA,也是人體多種物質(zhì)的合成底物,如肌酸、NO、多胺、脯氨酸、谷氨酸和高精氨酸等,與血管舒張、免疫、神經(jīng)傳遞、能量代謝和預(yù)防多個(gè)系統(tǒng)的功能障礙有關(guān)[19]。因此,石斑魚肉肽粉是一種較好的人體EAA來源,可作為開發(fā)適合各年齡階段的功能食品原料。

表2 石斑魚肉肽粉的氨基酸含量 單位：g/100 g

2.3 魚肉肽粉的呈味特征

蛋白酶解產(chǎn)物的呈味特征很大程度取決于氨基酸的種類與含量[20]。味道強(qiáng)度值(taste activity value,TAV)是評價(jià)呈味物質(zhì)對呈味特征貢獻(xiàn)程度的重要指標(biāo),它是指呈味物質(zhì)的濃度與其呈味閾值的比值。當(dāng)TAV<1時(shí),該呈味物質(zhì)對呈味特征的貢獻(xiàn)較?。籘AV越大說明該呈味物質(zhì)對呈味特征的貢獻(xiàn)越大。石斑魚肉肽粉的呈味特征見表3。石斑魚肉肽粉的呈味特征為苦味>鮮味>甜味。且除脯氨酸和酪氨酸TAV<1外,魚肉肽粉中其他氨基酸TAV均>1。

谷氨酸和天冬氨酸能為食品提供鮮味,決定食品的鮮美程度,且普遍認(rèn)為谷氨酸對鮮味的作用大于天冬氨酸,同時(shí)各組分谷氨酸的TAV值均>天冬氨酸的TAV值,因此,谷氨酸是石斑魚肉肽粉的主要鮮味來源。各組分的甜味氨基酸TAV值均為丙氨酸最高,明顯高于其他甜味氨基酸,是甜味的主要來源。研究表明[15],丙氨酸是水產(chǎn)品中重要的甜味氨基酸,可與谷氨酸等鮮味氨基酸協(xié)同呈鮮。

表3 石斑魚肉肽粉氨基酸的TAVTable 3 TAV of amino acids in peptides powder from grouper muscle

蛋氨酸、精氨酸、賴氨酸、纈氨酸、苯丙氨酸等為魚肉肽粉貢獻(xiàn)較多的苦味,故該肽粉整體呈現(xiàn)苦味。有研究表明[23],水產(chǎn)蛋白的酶解產(chǎn)物通常具有一定的苦味,這是由于在酶解過程中大分子蛋白質(zhì)水解成小肽,較多的疏水性氨基酸和堿性氨基酸暴露。根據(jù)相關(guān)研究[24],含有苦味的物質(zhì)分子質(zhì)量在1 kDa以下的占85.1%,而魚肉肽粉正是小分子肽產(chǎn)品。通過促進(jìn)多肽的卷曲,使疏水性氨基酸隱藏在肽鏈內(nèi)部,以及深度酶解促使疏水性氨基酸殘基轉(zhuǎn)化為游離氨基酸,都能使肽粉的苦味減少[25]。

2.4 魚肉肽粉的營養(yǎng)價(jià)值評價(jià)

AAS和CS是評價(jià)氨基酸營養(yǎng)價(jià)值最主要的方法,但是具有片面性,而世界衛(wèi)生組織(World Health Organization,WHO)/聯(lián)合國糧食及農(nóng)業(yè)組織(Food and Agriculture Organization of the United Nations,FAO)提出以氨基酸模式來評價(jià)蛋白質(zhì)營養(yǎng)價(jià)值,同時(shí)根據(jù)氨基酸模式來計(jì)算RAA、RC以及SRC,可以較為直觀反映樣品氨基酸含量偏離氨基酸模式的程度及EAA對氨基酸平衡的影響[26],綜合運(yùn)用這些方法可以較為全面、準(zhǔn)確地評價(jià)樣品的相對營養(yǎng)價(jià)值。

AAS是指樣品中某種EAA的含量與FAO/WTO推薦的理想蛋白同種氨基酸含量的比值,其中最小的AAS值就是該樣品的氨基酸評分,AAS最小的EAA被稱為該樣品的第一限制氨基酸。如果樣品中某種EAA的AAS<1,說明該樣品的EAA模式不滿足FAO/WTO推薦的理想蛋白模式,其蛋白質(zhì)的營養(yǎng)價(jià)值偏低；如果樣品所有EAA的AAS都>1,說明該樣品的蛋白質(zhì)營養(yǎng)價(jià)值較高。

石斑魚肉肽粉的AAS為1.56(表4),經(jīng)超濾處理后除了EH-2組分外,其他分離組分的AAS均>1,這也說明石斑魚肉肽粉及其超濾分離組分均有較高的營養(yǎng)價(jià)值。李慧凝等[27]以酶解法制備鰹魚肽,鰹魚肽的AAS均近似或大于1.0。因此,從蛋白質(zhì)角度來講,魚肉肽具有較高的營養(yǎng)價(jià)值。

表4 石斑魚肉肽粉的氨基酸評分Table 4 Amino acid score(AAS) of peptides powder from grouper muscle

CS是指樣品中某種EAA含量與雞蛋蛋白中同種氨基酸含量的比值,其比值的意義與AAS一樣。石斑魚肉肽粉的CS分別為1.19、1.19、0.32、1.12、1.10(表5),說明除EH-2外其他組分的蛋白質(zhì)營養(yǎng)價(jià)值在一定程度上優(yōu)于雞蛋蛋白質(zhì)。

表5 石斑魚肉肽粉的化學(xué)評分Table 5 Chemical score(CS) of peptides powder from grouper muscle

蛋白質(zhì)的營養(yǎng)價(jià)值與其EAA的種類、數(shù)量及平衡狀態(tài)密切相關(guān)。從表6可知,石斑魚肉肽粉的EAA占TAA的比值除EH-2組分的蘇氨酸外,均優(yōu)于模式值。石斑魚肉肽粉EAA中亮氨酸占比特別高,為模式值的2.5倍以上；苯丙氨酸+酪氨酸以及賴氨酸占比也較高,為模式值的2倍左右。單個(gè)氨基酸占比過高或過低于模式值均會(huì)影響氨基酸平衡,但是各組分的EAA占比的變化規(guī)律與模式值相似。總體而言,該肽粉的EAA種類齊全,含量豐富,且組成合理,是1種優(yōu)質(zhì)氨基酸產(chǎn)品。

表6 石斑魚肉肽粉的EAA模式 單位：%

通過計(jì)算EAA的RAA、RC、SRC來評價(jià)樣品的營養(yǎng)價(jià)值。從表7可知,EH-3的SRC值最高達(dá)到了80.43,EH-2的SRC值較低為53.44,各樣品的氨基酸平衡性為：EH-3>EH-1>EH>EH-4>EH-2,且蛋氨酸、異亮氨酸、賴氨酸及苯丙氨酸+酪氨酸的RC值接近1,表明5種EAA含量比例與氨基酸模式最接近。各組分的亮氨酸的RC值最高,但蘇氨酸和纈氨酸的RC值均<1,EH、EH-1、EH-2的第一限制氨基酸為蘇氨酸,同時(shí)EH-2的蘇氨酸RC值只有0.19,對氨基酸平衡起著很大的負(fù)作用；而EH-3、EH-4的第一限制氨基酸為纈氨酸。綜上所述,石斑魚肉肽粉是1種營養(yǎng)價(jià)值較高的海洋來源蛋白。

表7 石斑魚肉肽粉EAA的RAA、RC、SRCTable 7 RAA,RC and SRC of EAA in peptides powder from grouper muscle

2.5 魚肉肽粉的相對分子質(zhì)量分布

根據(jù)實(shí)驗(yàn)前期結(jié)果[9]及SRC,選取石斑魚肉肽粉中抗氧化活性較高同時(shí)比值系數(shù)分最高的組分EH-3,分析其相對分子質(zhì)量分布。EH-3分子質(zhì)量為249 Da,且EH-3組分中分子質(zhì)量在1 kDa以下的含量為97%,說明經(jīng)過酶解之后的魚肉大部分降解為小分子肽,容易被人體吸收[29]。巫楚君等[30]通過復(fù)合蛋白酶酶解黃鰭金槍魚肉,其酶解產(chǎn)物分子質(zhì)量大部分在1 kDa以下,本試驗(yàn)結(jié)果與之相似。

3 結(jié)論

珍珠龍膽石斑魚肉肽粉是一種高蛋白食物,粗蛋白質(zhì)含量達(dá)63.41%以上；魚肉肽粉的EAA組成齊全、含量豐富、比例相對均衡,具有較高的營養(yǎng)價(jià)值。經(jīng)過超濾分離的石斑魚肉肽粉為開發(fā)具有多種生物活性功能產(chǎn)品提供了優(yōu)質(zhì)的原料,然而肽粉還呈現(xiàn)出一定的苦味,如何消減或消除肽粉的苦味還有待于進(jìn)一步深入研究。