卵形鯧鲹黃嘌呤氧化酶抑制肽的制備及其工藝優(yōu)化

侯夢(mèng)凡,胡曉,楊賢慶*,陳勝軍,吳燕燕,許加超

1(中國(guó)海洋大學(xué) 食品科學(xué)與工程學(xué)院,山東 青島,266003) 2(中國(guó)水產(chǎn)科學(xué)研究院 南海水產(chǎn)研究所,農(nóng)業(yè)農(nóng)村部水產(chǎn)品加工重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室,廣東 廣州,510300)

高尿酸血癥是由于體內(nèi)嘌呤代謝紊亂而導(dǎo)致的一種代謝性疾病。當(dāng)體內(nèi)肝臟產(chǎn)生尿酸的量超出腎臟的排泄能力時(shí),就會(huì)導(dǎo)致血清尿酸水平升高,從而引起高尿酸血癥[1]。當(dāng)血清尿酸水平過(guò)飽和時(shí),尿酸鹽容易在關(guān)節(jié)、軟骨和腎臟等組織中沉積,形成尿酸鹽結(jié)晶,最終導(dǎo)致痛風(fēng)的產(chǎn)生[2]。此外,高尿酸血癥也與高脂血、高血壓、二型糖尿病和心血管疾病等疾病的發(fā)生有著密切的關(guān)系[3]。據(jù)不完全統(tǒng)計(jì),我國(guó)高尿酸血癥的患病率約為13%,其中男性為18.5%,明顯高于女性,且沿海和經(jīng)濟(jì)發(fā)達(dá)地區(qū)高尿酸血癥患病率高達(dá)20%以上,已達(dá)到或接近歐美發(fā)達(dá)國(guó)家水平[4]。目前臨床上主要使用別嘌呤醇、非布斯坦等藥物進(jìn)行有效的治療,然而這些藥物會(huì)產(chǎn)生嚴(yán)重的副作用,如頭痛發(fā)熱、過(guò)敏反應(yīng)、高血壓、慢性腎炎、心血管疾病、關(guān)節(jié)及肌肉骨骼功能障礙等,且治療費(fèi)用較高[5]。因此開(kāi)發(fā)出具有較少的不良反應(yīng)和更加經(jīng)濟(jì)的新型降尿酸藥物是目前亟待解決的問(wèn)題。目前,多酚、黃酮、皂苷類等天然提取物,蛋白酶解物及多肽,益生菌等已被證明具有降尿酸活性[6]。與其他生物活性物質(zhì)相比,多肽往往表現(xiàn)出較高的活性、穩(wěn)定性和特異性,且容易吸收,可以進(jìn)行批量生產(chǎn)且成本較低[7]。食源性生物活性肽來(lái)源廣泛且安全性高,從食物蛋白源中開(kāi)發(fā)降尿酸活性肽,在預(yù)防與治療高尿酸血癥及痛風(fēng)方面具有較高的研究?jī)r(jià)值和廣闊的應(yīng)用前景[8]。黃嘌呤氧化酶(xanthine oxidase,XOD)是嘌呤代謝中的關(guān)鍵酶,催化黃嘌呤或次黃嘌呤氧化生成尿酸[9],因此,XOD活性過(guò)高會(huì)加快尿酸的生成,造成高尿酸血癥。此外,在XOD的再氧化過(guò)程中,還會(huì)產(chǎn)生內(nèi)源性活性氧,包括超氧自由基和過(guò)氧化氫,會(huì)對(duì)組織造成氧化損傷[10],對(duì)機(jī)體造成進(jìn)一步的損害。因此,抑制XOD活性可以阻止生物體從嘌呤到尿酸的生物合成,從而有效降低血清尿酸含量以及血管氧化應(yīng)激反應(yīng)[11]。

卵形鯧鲹(Trachinotusovatus)又稱金鯧魚(yú),為暖水性中上層洄游魚(yú)類,廣泛分布于我國(guó)南海、日本沿海、地中海、印度洋等熱帶亞熱帶海域,在我國(guó)廣東、海南已進(jìn)行大規(guī)模的人工養(yǎng)殖[12]。2016年,我國(guó)卵形鯧鲹年養(yǎng)殖產(chǎn)量達(dá)12萬(wàn)t以上[13]。卵形鯧鲹富含蛋白質(zhì)、脂肪、脂肪酸、氨基酸等多種營(yíng)養(yǎng)成分,且必需氨基酸及不飽和脂肪酸比例較高[14],具極佳的保健及綜合利用開(kāi)發(fā)價(jià)值。目前,鰹魚(yú)[15]、秋刀魚(yú)[16]、鯊魚(yú)軟骨[17]、海參[18]等海產(chǎn)品中已經(jīng)提取出具有XOD抑制活性的多肽,本文對(duì)卵形鯧鲹XOD抑制肽的制備進(jìn)行了研究,并對(duì)其肽分子質(zhì)量分布及氨基酸組成進(jìn)行了分析,以期為卵形鯧鲹降尿酸活性產(chǎn)品的研發(fā)提供指導(dǎo)。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

卵形鯧鲹(選擇體長(zhǎng)為20 cm左右,質(zhì)量為500 g左右,產(chǎn)地為湛江的個(gè)體),廣州華潤(rùn)萬(wàn)家超市,取魚(yú)肉,洗凈后放入絞肉機(jī)中絞成肉糜,置于聚乙烯袋中于-20 ℃凍藏備用。

中性蛋白酶(≥100 U/mg)、木瓜蛋白酶(≥1 500 U/mg)、復(fù)合蛋白酶(≥90 U/mg)、堿性蛋白酶(≥200 U/mg)、胰酶(≥4 000 U/g),合肥博美生物科技有限公司；黃嘌呤、黃嘌呤氧化酶,美國(guó)Sigma公司；三氟乙酸，上海阿拉丁生化科技股份有限公司；乙腈、甲醇，美國(guó)BCR；氫氧化鈉、鹽酸、硫酸、硫酸銅、硫酸鉀，廣州化學(xué)試劑廠；磷酸氫二鈉、磷酸二氫鈉，上海源葉生物科技有限公司；甲醛，廣東廣試試劑科技有限公司。

1.2 儀器與設(shè)備

GB204電子天平,瑞士梅特勒-托利多公司；3K30臺(tái)式高速冷凍離心機(jī),德國(guó)Sigma公司；KjeltecTM 2300蛋白自動(dòng)分析儀,丹麥福斯分析儀器公司；THZ-82水浴恒溫振蕩器,金壇市精達(dá)儀器制造廠；809 Titrando自動(dòng)電位滴定儀,瑞士萬(wàn)通公司；Sunrise-basic Tacan SUNRISE吸光酶標(biāo)儀,瑞士TECAN公司；Alpha1-4真空冷凍干燥機(jī),德國(guó)Christ公司；N-EVAP24氮吹儀,美國(guó)ORGANOMATION公司；Agilent 1100液相色譜儀,美國(guó)安捷倫科技公司；LC-20AD高效液相色譜儀,日本島津公司。

1.3 實(shí)驗(yàn)方法

1.3.1 卵形鯧鲹XOD抑制肽的制備

取一定質(zhì)量的卵形鯧鲹魚(yú)糜于錐形瓶中,按1∶3(g∶mL)的料液比加入去離子水,混合均勻后調(diào)節(jié)至所需pH,加入一定比例的酶(以魚(yú)糜質(zhì)量計(jì)),在不同實(shí)驗(yàn)條件下酶解。酶解結(jié)束后,沸水浴滅酶15 min,冷卻,于4 ℃、6 793 r/min條件下離心20 min,收集上清液,冷凍干燥后得到卵形鯧鲹XOD抑制肽,于-20 ℃保存?zhèn)溆谩?/p>

1.3.2 蛋白酶的篩選

取10 g魚(yú)糜加入30 mL去離子水,選用中性蛋白酶、木瓜蛋白酶、堿性蛋白酶、復(fù)合蛋白酶、胰酶在各自最適pH和溫度下酶解6 h,加酶量為0.3%。以水解度和XOD抑制活性為指標(biāo)篩選出最佳蛋白酶。不同酶的最佳酶解溫度和pH如表1所示。

表1 不同蛋白酶的酶解條件Table 1 Hydrolysis conditions of different proteases

1.3.3 單因素試驗(yàn)

按1.3.1方法進(jìn)行酶解、制備,以水解度(degree of hydrolysis,DH)和XOD抑制活性為指標(biāo),分別考察中性蛋白酶的酶解時(shí)間(1、2、4、6、8 h)、酶解溫度(40、45、50、55、60 ℃)、酶解pH(6.0、6.5、7.0、7.5、8.0)、加酶量(質(zhì)量分?jǐn)?shù)0.1%、0.2%、0.3%、0.4%、0.5%)以及料液比(g∶mL)(1∶1、1∶2、1∶3、1∶4、1∶5)5個(gè)因素對(duì)2個(gè)指標(biāo)的影響。

1.3.4 響應(yīng)面法優(yōu)化實(shí)驗(yàn)

根據(jù)單因素試驗(yàn)結(jié)果,選取酶解時(shí)間(A)、加酶量(B)以及酶解溫度(C)為響應(yīng)因素,以水解度和XOD抑制活性為響應(yīng)值,根據(jù)Box-Behnken原理設(shè)計(jì)3因素3水平實(shí)驗(yàn),優(yōu)化XOD抑制肽的最佳制備工藝。實(shí)驗(yàn)因素及水平設(shè)計(jì)見(jiàn)表2。

表2 響應(yīng)面實(shí)驗(yàn)因素和水平Table 2 Factors and levels in response surface design

1.3.5 水解度測(cè)定

采用甲醛電位滴定法測(cè)定酶解后上清液中氨基酸態(tài)氮質(zhì)量,采用凱氏定氮法(參照GB 5009.5—2016《食品安全國(guó)家標(biāo)準(zhǔn) 食品中蛋白質(zhì)的測(cè)定》)測(cè)定原料中總氮質(zhì)量,水解度按公式(1)計(jì)算。

(1)

1.3.6 XOD抑制活性測(cè)定

于96孔酶標(biāo)板中依次加入50 μL待測(cè)樣品溶液(20 g/L),50 μL黃嘌呤氧化酶溶液(0.05 U/mL),混勻,37 ℃孵育30 min,加入150 μL黃嘌呤溶液(0.40 mmol/L)啟動(dòng)反應(yīng),記錄6 min內(nèi)反應(yīng)體系在290 nm處吸光值的動(dòng)力學(xué)變化,以pH 7.4磷酸緩沖鹽溶液(phosphate buffer solution,PBS)做空白對(duì)照。XOD抑制活性按公式(2)計(jì)算。

(2)

式中：dA，吸光度；dt，時(shí)間；(dA/dt)空白，未加抑制劑的反應(yīng)速率；(dA/dt)樣品，加抑制劑的反應(yīng)速率。

1.3.7 肽分子質(zhì)量分布測(cè)定

將凍干粉稀釋至2 g/L,采用高效體積排阻色譜法(high performance size exclusion chromatography，HPSEC)測(cè)定肽分子質(zhì)量分布。檢測(cè)條件：色譜柱為T(mén)SK-GELG2000SWXL(7.8 mm×300 mm)；流動(dòng)相A是含體積分?jǐn)?shù)0.1%三氟乙酸的乙腈溶液,流動(dòng)相B是超純水配制的體積分?jǐn)?shù)為0.1%三氟乙酸溶液,洗脫比例為V(A)∶V(B)=20∶80；進(jìn)樣體積10 μL；流速0.5 mL/min；檢測(cè)波長(zhǎng)214 nm。將標(biāo)準(zhǔn)品細(xì)胞色素C(12 400 Da)、桿菌肽(6 511.83 Da)、抑肽酶(1 422.69 Da)、氧化型谷胱甘肽(612.63 Da)、還原型谷胱甘肽(307.3 Da)用流動(dòng)相配制成質(zhì)量濃度為2 g/L的混合液,過(guò)0.22 μm微孔濾膜后按上述方法進(jìn)行分析,根據(jù)標(biāo)準(zhǔn)品出峰時(shí)間分析樣品的分子質(zhì)量分布。

1.3.8 氨基酸組成測(cè)定

參考GB 5009.124—2016《食品安全國(guó)家標(biāo)準(zhǔn) 食品中氨基酸的測(cè)定》酸水解法測(cè)定17種基本氨基酸；參考GB/T 18246—2019《飼料中氨基酸的測(cè)定》堿水解法測(cè)定色氨酸。

1.4 數(shù)據(jù)分析

采用Origin 2019軟件繪圖,實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)利用Excel 2019和SPSS Statistics 22.0進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析,以單因素ANOVA法及Duncan多重比較分析組間差異性,P<0.05表示有顯著性差異。

2 結(jié)果與分析

2.1 蛋白酶篩選結(jié)果

用5種不同蛋白酶酶解得到的XOD抑制肽其水解度和XOD抑制活性如表3所示。由于酶的專一性,不同蛋白酶具有不同的酶切位點(diǎn)和酶解產(chǎn)物,因此酶解效果和產(chǎn)物活性具有明顯差異[19]。從水解度來(lái)看,復(fù)合蛋白酶的水解程度最好,胰蛋白酶次之,其余3種酶的水解程度相對(duì)較低,這可能與卵形鯧鲹蛋白中氨基酸組成及排列方式有關(guān)。然而這2種酶解產(chǎn)物的XOD抑制活性低,中性蛋白酶酶解產(chǎn)物雖水解度較低,但具有最高的抑制率,達(dá)到61.94%,顯著高于其他酶解產(chǎn)物。因此,綜合考慮選取中性蛋白酶為本研究最佳用酶進(jìn)行一下步實(shí)驗(yàn)優(yōu)化。

表3 不同蛋白酶對(duì)水解度和XOD抑制活性的影響Table 3 Effect of different proteases on degree of hydrolysis and XOD inhibition activity

2.2 單因素試驗(yàn)結(jié)果

2.2.1 酶解時(shí)間對(duì)水解度和XOD抑制活性的影響

如圖1-a所示,水解度隨酶解時(shí)間的延長(zhǎng)而增加,4 h后增加趨勢(shì)有所減緩。這主要是隨著反應(yīng)的進(jìn)行,酶的作用位點(diǎn)逐漸減少,底物濃度降低,因而水解度的增幅程度有所減緩[20]。由于中性蛋白酶作用于底物的水解程度較低,在酶解的8 h內(nèi)并未到達(dá)反應(yīng)終點(diǎn)。各時(shí)間段的XOD抑制活性差異不大,4 h酶解產(chǎn)物的XOD抑制活性最高,達(dá)到62.02%,顯著高于2 h(P<0.05),但與6 h的XOD抑制活性無(wú)顯著差異。綜合時(shí)間及經(jīng)濟(jì)成本考慮,選擇4 h為最佳酶解時(shí)間。

2.2.2 酶解溫度對(duì)水解度和XOD抑制活性的影響

如圖1-b所示,隨著酶解溫度的升高,水解度呈現(xiàn)先上升后下降的趨勢(shì),在其最適溫度50 ℃時(shí)達(dá)到最大。水解度反映著酶催化生成肽鏈的能力,當(dāng)酶解溫度超過(guò)酶促反應(yīng)最適溫度時(shí),酶本身蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)的分子熱能增加,多重弱非共價(jià)鍵相互作用破裂的機(jī)會(huì)增加,導(dǎo)致酶變性,從而使酶活性降低[21]。50 ℃時(shí)酶解產(chǎn)物的水解程度達(dá)到最高,而XOD抑制活性卻低于55 ℃,這可能是由于較高的水解程度破壞某些氨基酸殘基,因而降低了其活性。因此選擇55 ℃為最佳酶解溫度。

2.2.3 酶解pH對(duì)水解度和XOD抑制活性的影響

中性蛋白酶的最適pH介于6.0～7.5,如圖1-c所示,當(dāng)pH為6.5～7.5時(shí),pH 7.0組與pH 6.5組、pH 7.0組和 pH 7.5組的XOD抑制活性都沒(méi)有顯著性差異。因此在pH 6.5～7.5對(duì)酶解效果影響不大,考慮到工業(yè)生產(chǎn)的實(shí)際應(yīng)用,確定酶解的最佳pH為7.0。

2.2.4 加酶量對(duì)水解度和XOD抑制活性的影響

如圖1-d所示,隨著加酶量的增加,底物與酶的接觸幾率增大,水解程度和酶解產(chǎn)物也隨之增加。當(dāng)加酶量為0.2%時(shí)XOD抑制活性最高,與其他組分具有顯著性差異(P<0.05),因此選擇0.2%為最佳加酶量。

2.2.5 料液比對(duì)水解度和XOD抑制活性的影響

如圖1-e所示,隨著料液比的增加,水解程度逐漸增加,當(dāng)料液比為1∶3(g∶mL)時(shí)逐漸趨于平緩。底物濃度高可增加酶與底物的接觸面積,從而促進(jìn)反應(yīng)的進(jìn)行,然而當(dāng)?shù)孜餄舛冗^(guò)高時(shí),反應(yīng)體系過(guò)于黏稠,影響了蛋白酶的分散性和活性物質(zhì)的釋放,因而減弱了酶解效果[22]。當(dāng)料液比達(dá)到1∶2(g∶mL)后,各組間的XOD抑制活性沒(méi)有顯著差異,說(shuō)明料液比對(duì)其影響不大,綜合考慮選擇最佳料液比為1∶3(g∶mL)。

圖1 時(shí)間、溫度、pH、加酶量、料液比對(duì)水解度和XOD抑制活性的影響Fig.1 Effects of enzymatic hydrolysis time,temperature,pH,enzyme dosage,and liquid-material ratio on the degree of hydrolysis and XOD inhibition activity注：圖中的不同字母表示在P<0.05范圍內(nèi)存在顯著性差異

2.3 響應(yīng)面試驗(yàn)分析

2.3.1 實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)及結(jié)果

由單因素試驗(yàn)結(jié)果發(fā)現(xiàn),pH和料液比對(duì)酶解效果的影響不明顯,因而本研究選擇酶解時(shí)間(A)、加酶量(B)、酶解溫度(C)3個(gè)條件進(jìn)一步優(yōu)化,固定酶解pH為7.0,料液比為1∶3(g∶mL)。實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)及水解度和XOD抑制活性結(jié)果見(jiàn)表4。以XOD抑制活性為主要指標(biāo)，水解度為輔助指標(biāo)，當(dāng)酶解時(shí)間為4h,加酶量為0.2%，酶解溫度為55℃時(shí)結(jié)果最佳。

表4 響應(yīng)面實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)及結(jié)果Table 4 Experimental design and results for response surface methodology

續(xù)表4

2.3.2 響應(yīng)面優(yōu)化模型的建立及方差分析

利用Design-Expert 10軟件對(duì)表4中的結(jié)果進(jìn)行多元回歸擬合,得到水解度和XOD抑制活性對(duì)于酶解時(shí)間(A)、加酶量(B)、酶解溫度(C)的二次回歸方程：Y1=11.73+0.92A+1.09B-2.27C+0.082AB-1.02AC-(6.963E+003)BC-0.17A2-0.35B2-0.85C2,R2=0.977 2；Y2=54.60-0.85A-1.11B-3.09C+0.081AB-0.32AC-0.50BC-5.16A2-4.05B2-5.84C2,R2=0.969 9。對(duì)擬合的回歸模型方程進(jìn)行方差分析及顯著性檢驗(yàn),結(jié)果見(jiàn)表5。研究發(fā)現(xiàn),各因素對(duì)水解度和XOD抑制活性影響的強(qiáng)弱順序?yàn)闇囟?加酶量>時(shí)間,A、B、C、AC、C2對(duì)水解度的影響為極顯著(P<0.01)；C、A2、B2、C2對(duì)XOD抑制活性的影響為極顯著(P<0.001)。結(jié)果表明回歸模型與實(shí)驗(yàn)結(jié)果的擬合度較好,模型構(gòu)建合理,可用于蛋白水解度和酶解產(chǎn)物XOD抑制活性的分析和預(yù)測(cè)。

表5 回歸模型方差分析Table 5 Variance analysis of the regression model

2.3.3 響應(yīng)面交互作用分析

曲面圖中曲線的陡峭程度了反映各個(gè)因素對(duì)響應(yīng)值影響的大小,曲線越陡,影響越大；響應(yīng)圖中等高線的形狀反映了2因素間交互作用的顯著性,形狀越陡,說(shuō)明交互作用越顯著[23]。由圖2可知,在各因素中,溫度對(duì)水解度的影響最為顯著,加酶量和時(shí)間對(duì)水解度的影響相對(duì)較小。酶解時(shí)間、加酶量和酶解溫度的兩兩交互作用不顯著。由圖3可知,加酶量與酶解時(shí)間和酶解溫度的交互作用均顯著,酶解時(shí)間和溫度2因素間的交互作用對(duì)XOD抑制活性的影響相對(duì)次之。

a-加酶量和時(shí)間交互作用；b-溫度和時(shí)間交互作用；c-溫度和加酶量交互作用圖2 各因素相互作用對(duì)水解度影響的響應(yīng)面及等高線圖Fig.2 Response surface and contour lines of interaction of factors on the degree of hydrolysis

a-加酶量和時(shí)間交互作用；b-溫度和時(shí)間交互作用；c-溫度和加酶量交互作用圖3 各因素相互作用對(duì)XOD抑制活性影響的響應(yīng)面及等高線圖Fig.3 Response surface and contour lines of interaction of factors on XOD inhibition activity

2.3.4 響應(yīng)面模型優(yōu)化及驗(yàn)證

綜合響應(yīng)面優(yōu)化結(jié)果及現(xiàn)實(shí)因素,確定卵形鯧鲹魚(yú)糜最佳酶解工藝如下,酶解時(shí)間3.85 h,加酶量0.19%,酶解溫度54 ℃。對(duì)應(yīng)的的水解度及XOD抑制活性的預(yù)測(cè)值分別為12.03%和55.10%。為了驗(yàn)證模型預(yù)測(cè)的準(zhǔn)確性,用此優(yōu)化條件重復(fù)試驗(yàn)3次,實(shí)際得到的水解度和XOD抑制活性值分別為11.82%和52.41%。由此可見(jiàn),該回歸模型可以較好地預(yù)測(cè)卵形鯧鲹蛋白的酶解情況。

2.4 肽分子質(zhì)量分布分析

大量研究表明,小分子質(zhì)量的多肽具有更高的XOD抑制活性。HE等[24]通過(guò)乙醇分級(jí)將鰹魚(yú)酶解凍干產(chǎn)物TPH分為2組,發(fā)現(xiàn)醇溶性組分富含分子質(zhì)量<1 000 Da的肽段且XOD抑制活性顯著高于其余2個(gè)組分。LI等[15]用尺寸排阻凝膠色譜對(duì)鰹魚(yú)酶解物的分離組分進(jìn)一步純化,發(fā)現(xiàn)分子質(zhì)量<1 000 Da的肽段組分其XOD抑制活性顯著高于其他組分。MUROTA等[25]研究發(fā)現(xiàn),醇溶性組分的鯊魚(yú)軟骨蛋白酶解物的肽分子質(zhì)量分布于300～7 000 Da,經(jīng)體內(nèi)外實(shí)驗(yàn)驗(yàn)證,該組分可提高大鼠血清X(qián)OD抑制活性,但其本身在較高濃度下也沒(méi)有體外XOD抑制活性,這說(shuō)明乙醇溶性組分中的肽段在消化、吸收和代謝過(guò)程中可能轉(zhuǎn)化為具有XOD抑制活性的小肽段。卵形鯧鲹酶解產(chǎn)物肽分子質(zhì)量分布如圖4所示,分子質(zhì)量<1 000 Da的肽段高達(dá)53.57%,顯著高于其他組分；其次為分子質(zhì)量1 000～3 000 Da的肽段,占比為40.35%；分子質(zhì)量<3 000 Da的肽段占據(jù)總量的93.92%。肽分子質(zhì)量分布結(jié)果表明,卵形鯧鲹酶解物的XOD抑制活性可能主要來(lái)源于分子質(zhì)量<3 000 Da的肽段。

圖4 卵形鯧鲹酶解產(chǎn)物HPLC色譜圖以及分子質(zhì)量分布圖Fig.4 HPLC chromatogram of hydrolysates of Trachitus ovatus and its molecular weight distribution

2.5 氨基酸組成分析

已有研究證實(shí),蛋白質(zhì)或多肽的氨基酸的組成決定了其生物活性[26]。XOD活性位點(diǎn)附近氨基酸殘基能形成疏水空腔,某些氨基酸能進(jìn)入疏水空腔,與XOD中的氨基酸殘基間以疏水相互作用、氫鍵、靜電相互作用、范德華力等作用力發(fā)生競(jìng)爭(zhēng)性或非競(jìng)爭(zhēng)性結(jié)合,從而改變其空間結(jié)構(gòu),進(jìn)而抑制XOD活性,達(dá)到減少尿酸生成的效果[8]。該疏水空腔是XOD抑制劑發(fā)揮抑制作用的重要區(qū)域,疏水性較強(qiáng)的肽段可能更易通過(guò)疏水相互作用進(jìn)入此區(qū)域,從而影響鉬碟呤中心的催化活性。由表6可知,卵形鯧鲹原料中總疏水氨基酸占氨基酸總量的30.68%,酶解后的產(chǎn)物其總疏水氨基酸占比提高至36.95%,其中含量較高的為亮氨酸和苯丙氨酸,其次為纈氨酸和異亮氨酸,這可能與XOD抑制活性有關(guān)。李宇娟等[27]的研究也表明,富含疏水氨基酸肽段組分的XOD抑制活性顯著高于其他組分,本研究結(jié)果與其具有相似性,都說(shuō)明了疏水氨基酸可能在多肽的XOD抑制活性中發(fā)揮著重要的作用。

表6 卵形鯧鲹魚(yú)肉及酶解物的氨基酸組成 單位：%

3 結(jié)論與討論

本研究比較了5種酶對(duì)卵形鯧鲹魚(yú)糜蛋白水解度和XOD抑制活性的影響?；趩我蛩卦囼?yàn),采用Box-Behnken設(shè)計(jì)分析,確定了以卵形鯧鲹為原料制備XOD抑制肽的最佳酶解工藝：采用中性蛋白酶,料液比為1∶3(g∶mL),酶解溫度為54 ℃,pH為7.0,酶解時(shí)間為3.85 h,加酶量為0.19%。在此條件下測(cè)得水解度和XOD抑制活性值分別為11.82%和52.41%,與預(yù)測(cè)值基本相符,說(shuō)明在該實(shí)驗(yàn)范圍內(nèi)建立的二次線性回歸模型準(zhǔn)確有效,具有一定的參考價(jià)值。肽分子質(zhì)量及氨基酸分析結(jié)果表明,具有高XOD抑制活性的卵形鯧鲹酶解產(chǎn)物大多為分子質(zhì)量<3 000 Da的肽段,且亮氨酸、苯丙氨酸等疏水性氨基酸含量較高。本研究表明,卵形鯧鲹是制備XOD抑制肽較為理想的原料來(lái)源,制備得到的產(chǎn)物活性較高,可為卵形鯧鲹高值化利用提供方法和技術(shù)指導(dǎo)。