水媒法燕麥分離蛋白的制備

王妙玲,張彩猛,李興飛,華欲飛

(江南大學(xué) 食品學(xué)院,江蘇 無錫 214122)

燕麥?zhǔn)呛瘫究蒲帑湆僖荒晟荼局参?依種子帶殼與否分為皮燕麥和裸燕麥兩大類型。我國(guó)以種植裸燕麥為主。其富含β-葡聚糖、不飽和脂肪酸、酚酸、維生素等功能性成分[1],具有預(yù)防心血管疾病、降低膽固醇和平穩(wěn)血糖等功效,因此受到人們的關(guān)注[2-3]。

燕麥中的蛋白質(zhì)含量較高,在11.35%～19.9%,在谷物中居于首位[4]；燕麥中的蛋白質(zhì)按其溶解性的不同,可分成4種蛋白質(zhì),分別為清蛋白(10%～20%)、球蛋白(12%～55%)、谷蛋白(23%～54%)和醇溶蛋白(12%～14%)[5]；燕麥蛋白的氨基酸構(gòu)成比較平衡,各種必需氨基酸的含量接近聯(lián)合國(guó)糧食及農(nóng)業(yè)組織(Food and Agriculture Organization of the United Nations,FAO)/世界衛(wèi)生組織(World Health Organization，WHO)推薦值[6-7],蛋白質(zhì)功效比超過2.0,生物價(jià)為72～75[8]。與大多數(shù)其他谷物不同,燕麥蛋白質(zhì)的麩質(zhì)(gluten)成分較少,因此其可以供乳糜瀉患者安全食用[9]。

在以往制備燕麥蛋白的工藝研究中[10-12],國(guó)內(nèi)外研究者們?yōu)樘岣哐帑湹鞍椎暮?會(huì)引入有機(jī)溶劑進(jìn)行脫脂或使用酶制劑,這些方法顯然不符合綠色生產(chǎn)的標(biāo)準(zhǔn),會(huì)使燕麥蛋白的使用范圍大大受限,不能應(yīng)用到食品工業(yè)中去。

本研究的主要目的是在不使用溶劑浸出,而且蛋白質(zhì)不被酶解的情況下制備蛋白質(zhì)含量大于90%的燕麥蛋白產(chǎn)品,提高蛋白質(zhì)含量的過程實(shí)際上就是去除燕麥中其他成分的過程。相對(duì)來說,燕麥中的碳水化合物類成分,包括淀粉、纖維、β-葡聚糖等[13-14],較容易與蛋白質(zhì)實(shí)現(xiàn)分離,而脂質(zhì)成分與蛋白質(zhì)之間有較強(qiáng)作用力,不容易分離[15]。作者經(jīng)過大量研究,提出了燕麥打漿、冷凍、分級(jí)沉淀的工藝路線,可以同時(shí)制備燕麥分離蛋白(oat protein isolate,OPI)和燕麥濃縮蛋白(oat protein concentrate,OPC)。

1 材料與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)材料

1.1.1 原料與試劑

裸燕麥,沈陽信昌糧食貿(mào)易有限公司；氫氧化鈉、硫酸、鹽酸、硫酸銅、葡萄糖、無水硫酸鈉、石油醚、三氯甲烷、甲醇、無水乙醇、酒石酸鉀鈉、亞鐵氰化鉀、亞甲藍(lán)、甲基紅等,均為分析純,國(guó)藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司。

1.1.2 儀器與設(shè)備

HimacCR21G Ⅱ型冷凍離心機(jī),日本Hitachi公司；BLST4090B-073打漿機(jī),東莞匯勛電器制品有限公司；K9840半自動(dòng)凱氏定氮儀,濟(jì)南海能儀器股份有限公司；UV2450型紫外分光光度計(jì),日本島津公司；PHS-3C數(shù)顯pH計(jì),梅特勒-托利多儀器(上海)有限公司；HH-S數(shù)顯恒溫水浴鍋,江蘇省金壇市醫(yī)療儀器廠；90型磁力攪拌器,上海滬西分析儀器廠有限公司。

1.2 實(shí)驗(yàn)方法

1.2.1 OPI與OPC制備的工藝路線

取一定質(zhì)量的裸燕麥,按料水比1∶12(g∶mL)加入去離子水,25 ℃浸泡12 h,浸泡結(jié)束后8 000 r/min打漿2 min。打漿后的漿液即為燕麥糊,使用2 mol/L NaOH溶液調(diào)節(jié)燕麥糊pH 至8.5,攪拌提取1.0 h,放入-18 ℃冰箱冷凍10 h,常溫水浴自然解凍,燕麥糊3 000×g離心15 min,棄去下層沉淀,收集上清液,上清液于50 ℃水浴加熱30 min,加入1 mol/L HCl溶液調(diào)節(jié)上清液pH至7.2,6 000×g離心15 min,下層沉淀即為OPI,上清液用1 mol/L HCl溶液調(diào)節(jié) pH 至5.2,3 000×g離心15 min得到OPC。

1.2.1.1 提取pH對(duì)OPI蛋白質(zhì)含量的影響

取100 g裸燕麥,浸泡12 h后,按料水比1∶12(g∶mL)打漿2 min(8 000 r/min)。取8份等質(zhì)量的燕麥糊,使用2 mol/L NaOH溶液調(diào)節(jié)pH分別為6.5、7.0、7.5、8.0、8.5、9.0、9.5、10.0,提取溫度25 ℃、提取時(shí)長(zhǎng)1.0 h,3 000×g離心15 min,得到上清液,使用1 mol/L HCl溶液將上清液調(diào)節(jié)pH至7.2,6 000×g離心15 min,得到OPI,測(cè)其蛋白質(zhì)含量。

1.2.1.2 離心分級(jí)pH對(duì)OPI蛋白質(zhì)含量的影響

取100 g裸燕麥,浸泡12 h后,按料水比1∶12(g∶mL)打漿2 min(8 000 r/min)。使用2 mol/L NaOH溶液調(diào)節(jié)燕麥糊pH為8.5,3 000×g離心15 min,得到上清液,將上清液分成等質(zhì)量的11份,使用1 mol/L HCl溶液將11份上清液分別調(diào)節(jié)pH為4.5、5.2、5.7、6.0、6.2、6.5、6.8、7.0、7.2、7.5、7.8,6 000×g離心15 min,溫度25 ℃、提取時(shí)長(zhǎng)0.5 h,6 000×g離心15 min,下層沉淀即為OPI,測(cè)其蛋白質(zhì)含量。

1.2.1.3 冷凍時(shí)長(zhǎng)對(duì)OPI蛋白質(zhì)含量的影響

取一定質(zhì)量的裸燕麥,按照1.2.1.1相同條件浸泡打漿,調(diào)節(jié)pH 8.5,攪拌提取后,將燕麥糊分為等質(zhì)量的8份,放在-18 ℃冰箱中,分別冷凍0、3、5、7、9、10、13、21 h,在常溫水浴自然解凍,3 000×g離心10 min,得到上清液,上清液50 ℃水浴加熱30 min后,加入1 mol/L HCl溶液調(diào)節(jié)上清液 pH 至7.2,6 000×g離心15 min,下層沉淀即為OPI,測(cè)其蛋白質(zhì)含量。

1.2.2 基本成分測(cè)定方法

蛋白質(zhì)含量參照GB 5009.5 —2016《食品安全國(guó)家標(biāo)準(zhǔn) 食品中蛋白質(zhì)的測(cè)定》中凱氏定氮法進(jìn)行測(cè)定,燕麥蛋白質(zhì)折算系數(shù)為5.83；脂肪含量參照氯仿甲醇法進(jìn)行測(cè)定[16]；淀粉含量參照GB 5009.9—2016《食品安全國(guó)家標(biāo)準(zhǔn) 食品中淀粉的測(cè)定》進(jìn)行測(cè)定；灰分含量參照GB 5009.4—2016《食品安全國(guó)家標(biāo)準(zhǔn) 食品中灰分的測(cè)定》進(jìn)行測(cè)定；水分含量參照GB 5009.3—2016《食品安全國(guó)家標(biāo)準(zhǔn) 食品中水分的測(cè)定》中直接干燥法進(jìn)行測(cè)定。

蛋白質(zhì)和脂肪提取率的計(jì)算如公式(1)所示：

蛋白質(zhì)(脂肪)提取率/%=

(1)

1.2.3 氨基酸的測(cè)定

稱取0.1 g蛋白樣品于水解管中,加入8 mL 6 mol/L HCl溶液,充分混合均勻后向水解管中氮吹3 min,置于120 ℃烘箱內(nèi)水解20 h。在室溫下自然冷卻后,轉(zhuǎn)移至試管中,用4.8 mL 10 mol/L NaOH溶液中和,定容至25 mL,混勻后用雙層濾紙過濾。濾液7 000×g離心10 min,取上清液進(jìn)行分析。采用OPA柱前衍生反相高效液相色譜紫外檢測(cè)法進(jìn)行氨基酸測(cè)定,用外標(biāo)法定量,計(jì)算氨基酸評(píng)分(amino acid score,AAS)。

1.2.4 數(shù)據(jù)處理

實(shí)驗(yàn)均重復(fù)3次,采用Origin對(duì)數(shù)據(jù)進(jìn)行分析和繪圖,結(jié)果用“平均值 ± 標(biāo)準(zhǔn)偏差”表示,使用SPSS 軟件對(duì)數(shù)據(jù)進(jìn)行顯著性分析(P<0.05表示具有顯著性差異)。

2 結(jié)果與分析

2.1 OPI的制備

2.1.1 燕麥原料的基本成分

小麥、玉米、大麥等糧食類谷物中的蛋白質(zhì)含量均在10%以下,由表1可知,裸燕麥中蛋白質(zhì)含量為12.5%,相比之下,燕麥中的蛋白質(zhì)含量在谷物中較高,因此從燕麥中提取蛋白質(zhì)意義重大。

表1 燕麥原料的基本成分 單位：%

2.1.2 提取pH對(duì)OPI蛋白質(zhì)含量的影響

將打漿后的燕麥糊調(diào)節(jié)至不同的pH提取蛋白質(zhì),結(jié)果表明在未加堿pH 6.5的條件下,蛋白質(zhì)的提取率和含量均為最低,提高pH可明顯提高蛋白質(zhì)的提取率和含量,因此燕麥中的蛋白質(zhì)在堿性條件下更易于溶出,在pH 8.5時(shí),蛋白質(zhì)含量達(dá)到最大,為78.58%,而且提取率也達(dá)到36.15%,雖然蛋白質(zhì)的提取率隨著pH的繼續(xù)升高仍會(huì)增大,但是增幅較小,而且過堿的條件會(huì)使燕麥漿液具有刺鼻的堿味。以蛋白質(zhì)含量為主要考察指標(biāo),選取最佳提取pH為8.5。

圖1 提取pH對(duì)OPI蛋白質(zhì)含量的影響Fig.1 The effect of extraction pH on OPI protein content

2.1.3 分級(jí)離心pH對(duì)OPI蛋白質(zhì)含量的影響

將上清液的pH分別調(diào)節(jié)至4.5～7.8,進(jìn)行離心沉淀,發(fā)現(xiàn)OPI的蛋白質(zhì)含量呈現(xiàn)出先升高后降低的趨勢(shì),在pH 7.2時(shí)達(dá)到最大,為77.65%,遠(yuǎn)遠(yuǎn)高于在等電點(diǎn)pH 5.2時(shí)的蛋白質(zhì)含量65.14%,表明燕麥中存在一部分蛋白質(zhì)在中性條件下先進(jìn)行沉淀,而且這一部分蛋白質(zhì)結(jié)合雜質(zhì)的量較少,所以燕麥蛋白的含量較高。因此,在進(jìn)行等電點(diǎn)沉淀之前,可以在中性條件下先進(jìn)行一次分級(jí)沉淀,得到蛋白質(zhì)含量較高的OPI,剩余的上清液再進(jìn)行等電點(diǎn)沉淀,回收剩余蛋白質(zhì),得到燕麥含量較低但提取率較高的OPC。

圖2 分級(jí)離心pH對(duì)OPI蛋白質(zhì)含量的影響Fig.2 The effect of pH in fractional centrifugation on OPI protein content

2.1.4 燕麥糊冷凍處理

圖3為燕麥蛋白提取工藝流程圖,本實(shí)驗(yàn)對(duì)蛋白質(zhì)和脂質(zhì)在各組分中的分配情況進(jìn)行了測(cè)定,數(shù)據(jù)見表2。由表2數(shù)據(jù)可知,燕麥糊是否進(jìn)行冷凍處理對(duì)OPI中蛋白質(zhì)和脂質(zhì)含量影響很大,未冷凍處理得到的OPI中脂質(zhì)含量為15.53%,冷凍以后,OPI中蛋白質(zhì)含量升高,脂質(zhì)含量降低至6.92%,提取率降低至7.35%。未冷凍處理的a 上清液1和冷凍處理的b 上清液1中蛋白質(zhì)和脂質(zhì)的提取率幾乎沒有差異,將pH調(diào)至中性沉淀后,未冷凍和冷凍處理的上清液2和沉淀2(OPI)的蛋白質(zhì)和脂質(zhì)的分配情況出現(xiàn)了差異,a OPI中的脂質(zhì)提取率為12.86%,而冷凍以后,b OPI中脂質(zhì)提取率僅為7.35%,與此同時(shí),a 上清液2中的脂質(zhì)提取率為72.3%,冷凍以后,提取到b 上清液2中的脂質(zhì)增加至77.68%。因此,原本傾向于沉降到OPI中的脂質(zhì)經(jīng)過冷凍處理后會(huì)轉(zhuǎn)移至上清液2中,所以沉淀b OPI中的蛋白質(zhì)含量得到提高。

a-未冷凍處理;b-冷凍處理圖3 從燕麥糊中提取OPI的流程圖Fig.3 Flow chart of extracting OPI from oat

表2 冷凍處理對(duì)各組分中蛋白質(zhì)與脂質(zhì)的影響 單位：%

孫旦[17]和朱敏敏等[18]均研究了冷凍對(duì)乳狀液破乳的影響,并認(rèn)為冷凍會(huì)形成冰晶刺穿包裹油滴的蛋白質(zhì)界面膜,使油滴能夠釋放并聚集。因此,未冷凍前,燕麥蛋白質(zhì)與脂質(zhì)之間具有相互作用,形成的蛋白質(zhì)-脂質(zhì)結(jié)合物在中性條件下會(huì)沉降,經(jīng)過冷凍處理后,冷凍條件下形成的冰晶使蛋白質(zhì)與脂質(zhì)間的相互作用被削弱,油滴被釋放聚集,進(jìn)入到清液中,所以沉降至OPI中的脂質(zhì)含量降低,蛋白質(zhì)含量升高。

2.1.5 冷凍時(shí)長(zhǎng)對(duì)OPI蛋白質(zhì)含量的影響

燕麥糊的冷凍時(shí)長(zhǎng)與OPI中蛋白質(zhì)含量的變化有密切聯(lián)系,蛋白質(zhì)含量隨冷凍時(shí)長(zhǎng)的延長(zhǎng)先升高后降低,在冷凍10 h時(shí),OPI的含量達(dá)到最大為92.31%,遠(yuǎn)超于未冷凍時(shí)的蛋白質(zhì)含量77.65%,而蛋白質(zhì)的提取率沒有隨著冷凍時(shí)長(zhǎng)的改變而發(fā)生明顯的變化。林暢[19]和程雪等[20]的研究發(fā)現(xiàn)在冷凍過程中,連續(xù)相產(chǎn)生的冰晶會(huì)刺穿界面膜進(jìn)入油滴內(nèi)部,解凍后引發(fā)油滴聚合；若冷凍時(shí)間過長(zhǎng),油相結(jié)晶增加緩慢,結(jié)晶達(dá)到最大程度,脂肪晶體刺穿界面膜的概率不再增加。因此綜合來看,冷凍時(shí)長(zhǎng)選為10 h時(shí)OPI的蛋白質(zhì)含量和提取率均為最高。

圖4 冷凍時(shí)長(zhǎng)對(duì)OPI蛋白質(zhì)含量的影響Fig.4 The effect of freezing time on OPI protein content

2.2 OPI與OPC的氨基酸分析

OPC與OPI的氨基酸含量見表3,可以看出OPI和OPC中谷氨酸、亮氨酸、天冬氨酸和精氨酸含量較高；氨基酸評(píng)分AAS值見表4,OPC的AAS值在70～162,OPI的AAS值在42～166,說明燕麥蛋白氨基酸配比比較平衡,為優(yōu)質(zhì)的蛋白質(zhì)資源。OPC中第一限制性氨基酸為賴氨酸,其AAS值為70；此結(jié)果與KLOSE等[21]的研究結(jié)果一致。而OPI中的限制性氨基酸為蛋氨酸、胱氨酸和賴氨酸。

表3 OPC與OPI的氨基酸組成 單位：g/100 g蛋白質(zhì)

續(xù)表3

表4 OPC與OPI的氨基酸評(píng)分Table 4 OPC and OPI amino acid score

3 結(jié)論與討論

本研究采用不引入有機(jī)溶劑的綠色加工工藝,以裸燕麥為原料,探究了提取pH、分級(jí)沉淀pH、冷凍處理等條件的影響,結(jié)果表明當(dāng)提取pH為8.5,回調(diào)pH為7.2,冷凍10 h時(shí),可以制備出蛋白質(zhì)含量為92.61%、提取率為42.46%的OPI,接著對(duì)上清液在等電點(diǎn)pH 5.2下進(jìn)行沉淀,可得到燕麥蛋白含量為65.14%,提取率為44.75%的OPC,此工藝流程可以提取出燕麥原料中大于80%的蛋白質(zhì),實(shí)現(xiàn)了燕麥中蛋白質(zhì)資源的最大利用,而且全過程不引入任何有機(jī)溶劑與酶制劑,工藝符合綠色生產(chǎn)標(biāo)準(zhǔn),此外OPI和OPC的氨基酸配比均十分均衡,是一種優(yōu)質(zhì)的植物蛋白資源,可應(yīng)用于食品工業(yè)。