傳統(tǒng)大豆醬不同發(fā)酵階段微生物多樣性變化

沈弘洋,鄧微,趙云珠,陳丹丹,王夢竹,劉國彥,劉俊梅,陳海燕

1(吉林農(nóng)業(yè)大學(xué) 食品科學(xué)與工程學(xué)院,吉林 長春,130118)2(吉林省田野泉釀造有限公司,吉林 長春,130507) 3(擺渡創(chuàng)新工廠集團(tuán)有限公司,吉林 長春,130012)4(長春科技學(xué)院,吉林 長春,100300)

傳統(tǒng)大豆醬是中國的四大發(fā)酵豆制品之一[1],以大豆為原料,經(jīng)過蒸煮、制醅、晾曬、前發(fā)酵、鹽封固態(tài)發(fā)酵和后發(fā)酵等工序加工而成,采用自然發(fā)酵,保留了傳統(tǒng)大豆醬獨(dú)特的風(fēng)味。其中前發(fā)酵階段是將大豆浸泡、蒸煮和擠壓后制成長方體的醬醅,置于發(fā)酵室中進(jìn)行為期約2個月的自然發(fā)酵,在此階段主要是霉菌分泌多種酶類發(fā)揮主要作用；低鹽固態(tài)發(fā)酵階段,是將發(fā)酵室中成熟的醬醅刷洗粉碎后放入發(fā)酵桶中,加入鹽度為(20±1)°B的鹽水混合均勻再繼續(xù)發(fā)酵3個月左右,此階段中霉菌基本停止生長,耐鹽乳酸菌和酵母菌開始大量繁殖,可發(fā)酵糖被代謝生成乙醇、乳酸乙酯和乙酸乙酯等香氣物質(zhì)[2],賦予傳統(tǒng)大豆醬獨(dú)特的風(fēng)味。本研究采用Illumina MiSeq測序技術(shù)對傳統(tǒng)大豆醬前發(fā)酵階段和低鹽固態(tài)發(fā)酵階段進(jìn)行細(xì)菌和真菌群落結(jié)構(gòu)的分析,明確在不同發(fā)酵階段中發(fā)揮主要作用的微生物,有利于挖掘功能性菌株,縮短發(fā)酵時(shí)間,改善傳統(tǒng)大豆醬的風(fēng)味。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

傳統(tǒng)大豆醬由吉林省田野泉釀造有限公司提供,對同一發(fā)酵室2個不同發(fā)酵階段的5個時(shí)間節(jié)點(diǎn)的傳統(tǒng)大豆醬進(jìn)行取樣,第1個階段為醬醅放入發(fā)酵室的第1天(A),醬醅發(fā)酵的中間時(shí)間節(jié)點(diǎn)30 d(B)和在發(fā)酵室的最后一天50 d(C),稱之為前發(fā)酵階段；第2個階段為醬醅刷醬粉碎后加入鹽水進(jìn)入低鹽固態(tài)發(fā)酵階段的起始點(diǎn)75 d(D)和結(jié)束點(diǎn)165 d(E),在每個時(shí)間節(jié)點(diǎn)取5個平行樣品共25個樣品,分別標(biāo)記為A1～A5、B1～B5、C1～C5、D1～D5、E1～E5,樣品無菌采集后立即置于-20 ℃冰箱中保藏待用。

表1 材料信息Table 1 Material information

M0491L-Q5?High-Fidelity DNA Polymerase擴(kuò)增聚合酶,美國紐英倫生物技術(shù)有限公司；P7589-Quant-iT PicoGreen dsDNA Assay Kit熒光定量染料、75510-019-Agarose瓊脂糖凝膠試劑、AM9870-TAE瓊脂糖凝膠電泳緩沖液,美國英杰公司；DL2000-DNA Marker,日本寶生物股份有限公司。

1.2 儀器與設(shè)備

2720 PCR儀,美國應(yīng)用生物系統(tǒng)公司；FLX800T酶標(biāo)儀,美國伯騰儀器(BioTek)有限公司；DYY-6C電泳儀,北京六一生物科技有限公司；BG-gdsAUTO 130型凝膠成像系統(tǒng),北京百晶生物技術(shù)有限公司；高通量測序平臺,美國Illumina公司。

1.3 實(shí)驗(yàn)方法

1.3.1 傳統(tǒng)大豆醬不同發(fā)酵階段微生物多樣性測定

將采集的5個不同發(fā)酵時(shí)間段的大豆醬樣本,每個樣本5個平行,送至上海派森諾生物科技股份有限公司進(jìn)行測定。測定流程主要包括：微生物組總DNA的提取,對細(xì)菌使用引物338F(5′-ACTCCTACGGGAGGCGCAGCA-3′)和806R(5′-GG-ACTACHVGGGTWTCTAAT-3′)擴(kuò)增16S rRNA基因的V3～V4結(jié)構(gòu)域。真菌使用內(nèi)部轉(zhuǎn)錄間隔區(qū)ITS區(qū)用引物ITS5(5′-GGAAGTAAAAGTCGTAACAAGG-3′)和ITS1(5′-GCTGCGTTCTTCATCGATGC-3′)擴(kuò)增。將擴(kuò)增產(chǎn)物進(jìn)行回收純化,熒光定量處理,使用Illumina公司的TruSeq Nano DNA LT Library prep Kit進(jìn)行測序文庫的制備,上機(jī)進(jìn)行高通量測序。

1.3.2 生物信息分析

采用Illumina平臺對群落DNA片段進(jìn)行雙端(Paired-end)測序,使用QIIME2(2019.4)對測序原始數(shù)據(jù)進(jìn)行分析處理,得到有效序列；通過UCLUST序列比對工具,對獲得的序列按97%的序列相似度進(jìn)行歸并和操作分類單元數(shù)(operational taxonomic unit,OTU)劃分,并選取每個OTU中豐度最高的序列注釋；利用R語言工具繪制各分類水平下的微生物多樣性群落結(jié)構(gòu)圖,對各樣本在不同分類水平上的群落結(jié)構(gòu)進(jìn)行分析。

2 結(jié)果與分析

2.1 傳統(tǒng)大豆醬不同發(fā)酵階段微生物多樣性分析

2.1.1 傳統(tǒng)大豆醬α多樣性分析

α多樣性是以Chao1指數(shù)表征豐富度,以Shannon和Simpson指數(shù)表征多樣性,以coverage指數(shù)表征覆蓋度[3]。本研究得到的傳統(tǒng)大豆醬不同發(fā)酵階段微生物群落α多樣性指數(shù)詳情見表2。

通過測序,去除嵌合體后序列量,得到的高質(zhì)量序列量,16S rRNA 測序得到 1 795 797條高質(zhì)量的序列,ITS 結(jié)果共得到2 615 938條高質(zhì)量的序列。Chao1指數(shù)越大,說明群落豐富度越高[4],本研究結(jié)果中細(xì)菌的 Chao 1指數(shù)均比真菌高很多,說明傳統(tǒng)大豆醬發(fā)酵過程中主要優(yōu)勢菌群是細(xì)菌,所有豆醬樣品coverage指數(shù)都在99.71%以上,這表明樣品中菌群型基本被鑒定出來。

表2 傳統(tǒng)大豆醬α多樣性分析Table 2 α-diversity index of bacteria and fungi in traditional soybean pastes

2.1.2 傳統(tǒng)大豆醬不同發(fā)酵階段微生物多樣性Venn圖分析

Venn圖中1個圓圈代表1組樣本,不同的顏色代表不同的分組。由圖1-a可知,不同分組間細(xì)菌群落共有OTU數(shù)為20,獨(dú)有的OTU數(shù)量分別為320、805、599、554和1 072。由圖1-b可知,不同分組間真菌群落共有OTU數(shù)為27,獨(dú)有的OTU數(shù)量分別為20、86、62、143和131。其中,細(xì)菌在A時(shí)獨(dú)有的OTU數(shù)最少,在E時(shí)最多。真菌OTU數(shù)在A時(shí)最少,在D時(shí)最多。

在前發(fā)酵階段,細(xì)菌和真菌OTU數(shù)呈現(xiàn)的趨勢相同,在B(30 d)時(shí)最多；但在低鹽固態(tài)發(fā)酵階段D(75 d)和E(165 d)中,E時(shí)的細(xì)菌OTU數(shù)高于D,但真菌OTU數(shù)不及E時(shí),可能由于在低鹽固態(tài)發(fā)酵階段,高的食鹽含量使得豆醬的水分活度降低,微生物生長受到抑制,一些厭氧耐高滲透壓的細(xì)菌適應(yīng)了環(huán)境細(xì)菌迅速增長[5-6],使得好氧性真菌數(shù)量下降。

a-細(xì)菌；b-真菌圖1 傳統(tǒng)大豆醬細(xì)菌和真菌Venn圖分析Fig.1 Venn diagram analysis of traditional soybean paste

由圖2可知,細(xì)菌第一主成分(PC1)貢獻(xiàn)率為35.3%,第二主成分(PC2)的貢獻(xiàn)率為25.9%；真菌的第一主成分(PC1)貢獻(xiàn)率和第二主成分(PC2)的貢獻(xiàn)率分別為46.7%和36.4%。傳統(tǒng)東北大豆醬5個不同發(fā)酵時(shí)間的樣品細(xì)菌豐富度整體相對分散,說明不同發(fā)酵階段細(xì)菌群落結(jié)構(gòu)具有差異性,但是D、E相對較近,有重疊現(xiàn)象出現(xiàn),說明鹽封入缸半固態(tài)發(fā)酵階段細(xì)菌群落結(jié)構(gòu)具有相似性；而真菌在 B和C、D與E相對較近,即發(fā)酵30和50 d(發(fā)酵室醬醅階段)、75 和165 d(鹽封入缸半固態(tài)發(fā)酵階段)可說明在同一環(huán)境下真菌群落非常相似。

2.2 傳統(tǒng)大豆醬不同發(fā)酵階段微生物群落組成分析

2.2.1 細(xì)菌群落結(jié)構(gòu)分析

根據(jù)物種注釋結(jié)果,從微生物分類門的水平上來看,細(xì)菌門主要包括厚壁菌門(Firmicutes)、變形菌門(Proteobacteria)和放線菌門(Actinobacteria)等。其中厚壁菌門在不同發(fā)酵階段中占比均較高。

從微生物分類屬水平上來看,不同的發(fā)酵階段有不同的優(yōu)勢細(xì)菌屬,但在所有樣品中芽孢桿菌屬(Bacillus)均存在。在傳統(tǒng)大豆醬發(fā)酵1 d時(shí),主要細(xì)菌屬有芽胞桿菌屬占比55.19%、狹義梭菌(Clostridiumsensustricto12)占比19.07%、魏斯氏菌屬(Weissella)和明串珠菌屬(leuconostoc)均為乳酸菌屬,占比分別為11.23%和9.28%。這一結(jié)果與陳浩等[7]的研究結(jié)果相似。乳酸菌是人體腸道系統(tǒng)中最主要的有益菌,能夠產(chǎn)生良好的感官風(fēng)味和豐富的營養(yǎng)物質(zhì),在各種發(fā)酵食品中發(fā)揮關(guān)鍵作用[8-10]。芽胞桿菌屬能分泌多種酶類和抗生素；魏斯氏菌屬可以增加在食品發(fā)酵過程中的有機(jī)酸、酯等含量[11],促進(jìn)風(fēng)味物質(zhì)的合成,是參與食品發(fā)酵的微生物;明串珠菌可以作為食品發(fā)酵中的起始劑、調(diào)味劑和膨松劑,改善食品的安全性和感官特性[12]。李璐等[13]用腸膜明串珠菌發(fā)酵的菠蘿果汁能夠延緩維生素C的流失,感官評價(jià)較優(yōu)。

在醬醅發(fā)酵中后期30和50 d(B和C)時(shí),隨著發(fā)酵時(shí)間增長,芽胞桿菌屬在逐漸降低,枝芽胞菌屬(Virgibacillus)在30 d時(shí)出現(xiàn)且增長迅猛,在50 d達(dá)到最大占比為85.47%。在發(fā)酵30 d時(shí)還有厭氧菌(Anaerosalibacter)、片球菌屬(Pediococcus)和克羅彭斯特菌屬(Kroppenstedtia)等,發(fā)酵50 d時(shí)優(yōu)勢細(xì)菌屬與30 d基本一致,說明醬醅在發(fā)酵室中相同環(huán)境下細(xì)菌群落結(jié)構(gòu)基本相似。左麗麗等[14]對傳統(tǒng)發(fā)酵豆醬中乳酸菌進(jìn)行分離和鑒定,初步推斷出戊糖片球菌是吉林市農(nóng)家醬發(fā)酵過程中的優(yōu)勢乳酸菌群,對傳統(tǒng)豆醬的風(fēng)味起著至關(guān)重要的作用。

在低鹽固態(tài)發(fā)酵起始階段75 d(D)主要優(yōu)勢細(xì)菌屬為四聯(lián)球菌屬(Tetragenococcus)占總數(shù)52.71%,還有少量狹義梭菌(Clostridiumsensustricto12)；在終止階段165 d(E)四聯(lián)球菌和芽孢桿菌屬有降低趨勢,但同時(shí)出現(xiàn)了乳桿菌屬(Lactobacillus)占比32.94%,主要優(yōu)勢細(xì)菌屬同75 d時(shí)一致。嗜鹽四聯(lián)球菌是發(fā)酵食品常用的微生物之一[15],可以用于釀造醬油、發(fā)酵食品和腌制品中,改善產(chǎn)品的風(fēng)味。

a-門水平；b-屬水平圖3 不同分類水平下的傳統(tǒng)大豆醬主要細(xì)菌群落結(jié)構(gòu)Fig.3 Bacterial community structure of traditional soybean paste under different classification levels

2.2.2 真菌群落結(jié)構(gòu)分析

由圖4-a可知,在門水平下,最豐富真菌菌門是子囊菌門(Ascomycota)、比較豐富的毛霉菌門(Mucoromycota)、擔(dān)子菌門(Basidiomycota) 以及被孢霉門(Mortierellomycota)、壺菌門(Chytridiomycota)、球囊菌門(Glomeromycota)和芽枝霉門(Blastocladiomycota)等少量豐度菌門。其中,在發(fā)酵1 d時(shí)毛霉菌門為優(yōu)勢菌門,相對豐度高達(dá) 96.77%,隨著發(fā)酵時(shí)間的延長,毛霉菌門銳減,子囊菌門增加,在發(fā)酵30 d時(shí)達(dá)到頂峰；在發(fā)酵后期出現(xiàn)少量擔(dān)子菌門,相對豐度僅為 0.32%。

a-門水平；b-屬水平圖4 不同分類水平下的傳統(tǒng)大豆醬主要真菌群落結(jié)構(gòu)Fig.4 Community structure of main fungi in traditional soybean paste under different classification levels

由圖4-b可見,屬水平下,樣品在真菌中檢測出最豐富菌屬是曲霉屬(Aspergillus),次之是毛霉屬(Mucor)、青霉屬(Penicillum)。在發(fā)酵初期1 d時(shí)毛霉屬為主要優(yōu)勢菌,30 d以后曲霉屬為主要優(yōu)勢菌；在發(fā)酵的最后階段165 d時(shí)出現(xiàn)假絲酵母屬(Candida)、耐干霉菌屬(Xeromyces),其余還有小囊菌屬(Microascus)、根毛霉屬(Rhizomucor)、赤霉菌(Gibberrella)、狹義梭菌屬。其中,曲霉屬[16]具有較強(qiáng)的酶活性,廣泛應(yīng)用于食品發(fā)酵；毛霉屬能產(chǎn)生果膠酶、凝乳酶和脂肪酶等[17],可用于制曲和釀酒。因此,有必要對豆醬的微生物多樣性進(jìn)行研究,了解豆醬的微生物群落結(jié)構(gòu),充分利用優(yōu)勢菌株。

2.3 傳統(tǒng)大豆醬不同發(fā)酵階段微生物群落差異分析

采用線性判別分析(linear discriminant analysis effect size,LEfSe)法分析傳統(tǒng)大豆醬前發(fā)酵醬醅微生物群落的差異顯著性,尋找生物標(biāo)識物[18]。由圖5-a可知,不同發(fā)酵時(shí)期豆醬細(xì)菌群落結(jié)構(gòu)存在顯著豐度差異的。在發(fā)酵1 d時(shí),芽胞桿菌屬、魏斯氏菌屬、明串珠菌屬等為顯著差異菌屬；在30 d時(shí),有Anaerosalibacter、Pediococcus、Kroppenstedtia、Oceanobacillus等為顯著差異菌屬；在50 d時(shí)只有Virgibacillus差異顯著；在75 d時(shí),Oligella、Vibrio等為差異顯著菌屬；在165 d時(shí),只有Lactobacillus為差異顯著菌屬。由圖5-b可知，不同發(fā)酵時(shí)期豆醬存在真菌有4組是有顯著差異的,但是在165 d時(shí)差異不顯著。發(fā)酵1 d時(shí)Mucor為顯著差異菌屬,在30 d時(shí)Licanicillum為差異顯著菌屬；在50 d時(shí)Lichtheimia差異顯著菌屬；在75 d時(shí)沒有顯著差異菌屬,但165 d差異顯著菌屬相對來說比較多,包括Aspergillus、Curvularia、Tausonia、Fusarium和Pichia等。

3 討論

目前采用高通量測序技術(shù)對于大豆醬發(fā)酵過程中微生物群落結(jié)構(gòu)的分析已有報(bào)道。張穎等[19]利用PCR-DGGE結(jié)合高通量測序技術(shù)分析了自然發(fā)酵豆醬過程中細(xì)菌的多樣性和動態(tài)變化,并得出細(xì)菌多樣性也隨著發(fā)酵時(shí)間的變化而變化的結(jié)論。向凡舒等[20]對鶴峰地區(qū)渣豆醬中的微生物研究結(jié)果表明芽孢桿菌屬和葡萄球菌屬是主要的細(xì)菌屬,青霉屬、耐堿酵母屬和接合酵母屬是主要的真菌屬。JUNG等[21]利用焦磷酸測序法研究了韓國豆醬發(fā)酵過程中微生物,發(fā)現(xiàn)芽孢桿菌和毛霉是主要的細(xì)菌和真菌。馬巖石等[22]對東北5個不同產(chǎn)地的豆醬微生物群落進(jìn)行分析,表明細(xì)菌屬主要為葡萄球菌屬、腸桿菌屬、明串珠菌屬和芽胞桿菌屬。本研究采用 Illumina MiSeq高通量測序技術(shù)對傳統(tǒng)大豆醬2個不同發(fā)酵階段5個時(shí)間節(jié)點(diǎn)微生物多樣性差異分析。其中在傳統(tǒng)大豆醬前發(fā)酵階段的細(xì)菌群落結(jié)構(gòu)上,主要以厚壁菌門和芽胞菌屬為主,在低鹽固態(tài)發(fā)酵階段中75和165 d時(shí),四聯(lián)球菌屬為主要優(yōu)勢細(xì)菌屬,還有部分乳桿菌屬。在真菌的群落結(jié)構(gòu)上,發(fā)酵1 d時(shí)毛霉菌門優(yōu)勢菌門,毛霉屬為主要優(yōu)勢菌屬,其他發(fā)酵階段均以子囊菌門為優(yōu)勢菌門,曲霉屬為主要優(yōu)勢菌屬。此結(jié)果與韓俊燕等[23]對4個不同地區(qū)的發(fā)酵辣椒制品的研究結(jié)果具有相似性。但本研究在細(xì)菌屬水平和真菌屬水平不同發(fā)酵階段優(yōu)勢菌有很大差異,可能與地域及加工環(huán)境有密切關(guān)系,微生物群落多樣性在細(xì)菌門上差異原因與部分報(bào)道相一致,如上述馬巖石等[22]的結(jié)論。

a-傳統(tǒng)大豆醬細(xì)菌LEfSe分析；b-傳統(tǒng)大豆醬真菌LEfSe分析圖5 傳統(tǒng)大豆醬不同發(fā)酵階段LEfSe分析Fig.5 Analysis of LEfSe in different fermentation stages of traditional soybean paste

在細(xì)菌群落結(jié)構(gòu)上,主要優(yōu)勢菌屬也包括明串珠菌屬和芽胞桿菌屬,與其不同的是四聯(lián)球菌屬和乳桿菌屬也均為優(yōu)勢菌屬,有研究表明二者會產(chǎn)生優(yōu)良風(fēng)味且對人體有益,比如CUI等[24]通過在醬醪中先接種嗜鹽四聯(lián)球菌,后接種耐鹽酵母菌的方式,明顯提高了醇類、酮類和吡嗪類物質(zhì)等風(fēng)味物質(zhì)的含量。乳桿菌屬可以通過發(fā)酵碳水化合物產(chǎn)生ATP,廣泛用于生產(chǎn)商業(yè)酸奶,含乳桿菌的酸奶對腸道有益[25]。

本研究從前發(fā)酵醬醅階段到鹽封半固態(tài)發(fā)酵實(shí)驗(yàn)研究,該結(jié)果對了解傳統(tǒng)大豆醬不同發(fā)酵微生物多樣性變化能夠提供一定的理論數(shù)據(jù)。為進(jìn)一步明確優(yōu)勢菌株和風(fēng)味物質(zhì)的相關(guān)性研究提供依據(jù),可以通過不同發(fā)酵天數(shù)的傳統(tǒng)大豆醬中優(yōu)勢菌屬進(jìn)行篩選,定植發(fā)酵,以縮短生產(chǎn)周期,控制和改善風(fēng)味。