體外模擬消化對(duì)暗紋東方鲀魚(yú)皮膠原蛋白肽結(jié)構(gòu)特征及抗氧化活性的影響

曹振海,樂(lè)彩虹,陶寧萍,2*,鄧尚貴

1(上海海洋大學(xué) 食品學(xué)院,上海,201306) 2(上海水產(chǎn)品加工及貯藏工程技術(shù)研究中心,上海,201306) 3(浙江海洋大學(xué) 食品與藥學(xué)學(xué)院,浙江 舟山,316000)4(浙江興業(yè)集團(tuán)有限公司,浙江 舟山,316000)

膠原蛋白肽是以膠原蛋白或明膠為原料,在物理、化學(xué)和酶解的作用下得到水解物。與膠原蛋白相比,低分子質(zhì)量的膠原蛋白肽表現(xiàn)出了更廣泛的生物活性和更強(qiáng)的生物利用度而受到市場(chǎng)的青睞,如抗氧化、抑菌,降血壓、抑制肥胖以及增強(qiáng)骨質(zhì)特性等[1-2]。水生動(dòng)物由于其優(yōu)異的生物相容性和功能性以及無(wú)宗教信仰問(wèn)題已成為膠原蛋白肽的最佳來(lái)源,被廣泛應(yīng)用于食品、醫(yī)藥、化妝品行業(yè)。前人[3]等研究了來(lái)源于金槍魚(yú)、鳳尾魚(yú)、魷魚(yú)等的混合副產(chǎn)物中不同級(jí)分的酸溶性膠原蛋白肽的生物功能活性,發(fā)現(xiàn)分子質(zhì)量<1 kDa組分其抗氧化活性最高,DPPH自由基清除率可達(dá)81.6%,·OH清除活性高達(dá)91.0%,且乳化活性指數(shù)高達(dá)130 m2/g；JIN等[2]使用胰蛋白酶水解三文魚(yú)皮膠原,并從中篩選出了具備抑制與糖尿病發(fā)病機(jī)制有關(guān)的DPP-IV活性肽組分,其IC50為(0.79±0.13)mg/mL。LIU等[4]發(fā)現(xiàn)泥鰍皮膠原蛋白肽可通過(guò)Wnt/β-catenin通路減輕小鼠骨質(zhì)疏松癥,并增強(qiáng)其骨生物力學(xué)特性。

隨著養(yǎng)殖暗紋東方鲀技術(shù)的成熟,規(guī)?；B(yǎng)殖暗紋東方鲀的需求日益增長(zhǎng),其魚(yú)皮是生產(chǎn)加工中主要的副產(chǎn)物之一,據(jù)前期實(shí)驗(yàn)表明,暗紋東方鲀魚(yú)皮中膠原蛋白含量豐富,可達(dá)到總蛋白含量80%以上,是膠原蛋白肽理想來(lái)源。周瑞等[5]使用不同酶處理暗紋東方豚魚(yú)皮以提取膠原蛋白,結(jié)果表明胃蛋白酶提取的膠原蛋白得率最高,且能較好地保留膠原蛋白三股螺旋結(jié)構(gòu),但目前國(guó)內(nèi)外對(duì)于暗紋東方鲀魚(yú)皮中的膠原蛋白活性肽的提取及其活性的探討研究極少。

研究表明,在體外顯示出生理活性的活性肽只有一小部分在體內(nèi)被證明是有效的[6]。體內(nèi)胃腸道消化會(huì)改變多肽的結(jié)構(gòu),進(jìn)而影響其生物利用度。本實(shí)驗(yàn)使用INFOEGEST體外模擬消化系統(tǒng)模型對(duì)不同分子質(zhì)量的自制暗紋東方鲀魚(yú)皮膠原蛋白肽(Takifuguobscurusskin collagen peptide,TOSCP)和市售魚(yú)皮膠原蛋白肽(commercial fish skin collagen peptide,CFSCP)進(jìn)行體外消化實(shí)驗(yàn),探究了膠原蛋白肽在消化過(guò)程中的結(jié)構(gòu)特征變化(微觀結(jié)構(gòu)、分子質(zhì)量、二級(jí)結(jié)構(gòu)以及氨基酸含量)及其對(duì)抗氧化活性的影響。

1 材料與方法

1.1 材料和試劑

暗紋東方鲀魚(yú)皮膠原蛋白肽,實(shí)驗(yàn)室自制；市售魚(yú)皮膠原蛋白肽,山東邁德豐生物科技有限公司。

胃蛋白酶(V900497,750 U/mg)、牛血清蛋白(色譜級(jí)),美國(guó)sigma公司；胰蛋白酶(YT7553,250 U/mg),合肥博美生物科技有限責(zé)任公司；異硫氰酸熒光素(fluorescein isothiocyanate,FITC),北京索萊寶科技有限公司；乙腈(色譜級(jí)),德國(guó)默克公司；其他試劑均為分析純,上海麥克林生物科技有限公司。

1.2 儀器和設(shè)備

SW22SET1恒溫振蕩水浴鍋,北京優(yōu)萊博技術(shù)有限公司；H1850臺(tái)式高速離心機(jī),長(zhǎng)沙湘儀離心機(jī)儀器有限公司；L—8800氨基酸自動(dòng)分析儀,日本日立公司；SU5000掃描電子顯微鏡,日立高新技術(shù)公司；Spotlight 400傅里葉變換紅外光譜儀,英國(guó)PerkinElmer公司；LSM710 NL0激光共聚焦顯微鏡,德國(guó)蔡司股份公司；Waters e2695高效液相儀,美國(guó)沃特世公司。

1.3 實(shí)驗(yàn)方法

1.3.1 TOSCP的制備

將1 cm×1 cm的暗紋東方鲀魚(yú)皮與3倍魚(yú)皮質(zhì)量的水混合,于95 ℃水浴鍋中熱水浸提3 h,取出并冷卻后,調(diào)節(jié)浸提液的pH至6.0,在50 ℃下預(yù)熱10 min,加入復(fù)合蛋白酶(魚(yú)酶質(zhì)量比50∶1)酶解1.5 h,待酶解反應(yīng)完成后,將酶解液放入90 ℃水浴鍋中滅酶15 min,冷卻至室溫后以10 000 r/min轉(zhuǎn)速離心10 min,冷凍干燥上清液得TOSCP,得率為93.80%。

1.3.2 體外消化模擬

按INFOGEST體外模擬消化系統(tǒng)[7]對(duì)膠原蛋白肽進(jìn)行消化,該模型包括胃、腸2個(gè)階段。胃液模擬液(simulated gastric fluid,SGF)和腸液模擬液(simulated intestinal fluid,SIF)的配制具體見(jiàn)表1。

模擬胃液消化液的配制以200 mL為例：稱(chēng)取1.20 g胃蛋白酶與150 mL SGF濃縮液混合后,加入0.1 mL 0.3 mol/L的CaCl2·2H2O并用去離子水定容至200 mL,然后調(diào)節(jié)pH至2.0。模擬腸液消化液的配制同樣以200 mL為例,分別稱(chēng)取0.16 g胰蛋白酶和1.70 g膽鹽與150 mL SIF濃縮液混合后,加入0.4 mL 0.3 mol/L的CaCl2·2H2O并定容至200 mL,調(diào)節(jié)pH至7.0。

表1 模擬消化液的配制Table 1 Preparation of simulated digestion fluids

將TOSCP和CFSCP溶解于去離子水中(5 g/L),預(yù)備等體積模擬胃液消化液并37 ℃水浴預(yù)熱5 min后,加入樣品,37 ℃恒溫振蕩(120 r/min)2 h。將胃消化后的消化液用1 mol/L NaOH調(diào)節(jié)pH至7.6,加入等體積模擬腸液消化液(37 ℃),37 ℃恒溫振蕩(120 r/min)2 h,完成消化。樣品經(jīng)模擬胃、腸道消化,立即取出,通過(guò)沸水浴(5 min)滅酶,調(diào)節(jié)pH至7.0,10 000 r/min離心10 min,冷凍干燥,備用。

1.3.3 消化前后多肽表面微觀結(jié)構(gòu)觀察

參考余韻[8]的方法并稍作修改,取少量粉末涂抹于貼有導(dǎo)電膠的樣品盤(pán)上,置于離子濺射儀的樣品艙中,噴金2 min,將樣品盤(pán)放入掃描電子顯微鏡觀察室,選取清晰視野進(jìn)行觀察。

1.3.4 消化前后多肽微觀結(jié)構(gòu)觀察

參考王笑涵等[9]的方法并稍作修改,取1 mL樣品和10 μL FITC溶液(1 mg/mL)混勻,靜置20 min。取10 μL染色液于載玻片上,靜置20 min,晾干后在FITC通道,20倍激光掃描共聚焦顯微鏡(confocal laser scanning microscope,CLSM)下進(jìn)行觀察,溶液配制及實(shí)驗(yàn)操作全程避光。

1.3.5 消化前后多肽分子質(zhì)量測(cè)定

參照GB 31645—2018《食品安全國(guó)家標(biāo)準(zhǔn) 膠原蛋白肽》中附錄A進(jìn)行測(cè)定。

1.3.6 消化前后多肽消化率測(cè)定

參照J(rèn)IANG等[10]的方法測(cè)定多肽消化率,計(jì)算方法如公式(1)所示:

(1)

式中：ρ0,消化前多肽含量,mg/mL；ρ1,消化后多肽含量,mg/mL。

標(biāo)準(zhǔn)曲線的繪制參考汪旭[11]的方法并稍作修改。用牛血清蛋白構(gòu)建蛋白定量標(biāo)準(zhǔn)曲線,于540 nm下測(cè)定其吸光值。

樣品測(cè)定：取2.5 mL樣品,加入2.5 mL體積分?jǐn)?shù)10%三氯乙酸溶液,振蕩混勻,靜置10 min,5 000 r/min離心10 min,取上清液1 mL,加4 mL雙縮脲試劑,振蕩混勻,放置30 min,于540 nm下測(cè)定其吸光值,將吸光值帶入標(biāo)準(zhǔn)曲線,可得樣品中的多肽含量。

1.3.7 消化前后多肽氨基酸測(cè)定

氨基酸含量：參照GB 5009.124—2016《食品安全國(guó)家標(biāo)準(zhǔn) 食品中氨基酸的測(cè)定》進(jìn)行測(cè)定。

1.3.8 消化前后多肽紅外光譜測(cè)定

利用單點(diǎn)衰減全反射(attenuated total reflection,ATR)模式對(duì)樣品信息進(jìn)行采集,室內(nèi)干燥(空氣濕度<40%)。樣品的紅外譜圖以空氣為背景,去除干擾。譜圖掃描波數(shù)為4 000～600 cm-1,分辨率為±4 cm-1,信號(hào)累加32次。使用軟件PeakFit v 4.12對(duì)1 600～1 700 cm-1的區(qū)域進(jìn)行基線校正以及二階導(dǎo)數(shù)擬合對(duì)膠原蛋白肽的二級(jí)結(jié)構(gòu)進(jìn)行分析[10]。

1.3.9 抗氧化活性的測(cè)定

參考樂(lè)彩虹等[12]的方法并稍作修改,取不同消化階段多肽產(chǎn)物,分別配制成1、5、10 mg/mL的多肽水溶液。

DPPH自由基清除率：取不同消化階段多肽水溶液各1 mL,分別加入1 mL DPPH溶液(0.4 mg/mL),混合均勻,室溫反應(yīng)30 min后,取200 μL于96孔板中,于517 nm處測(cè)其吸光值A(chǔ)1,計(jì)算方法如公式(2)所示：

(2)

式中：A0,超純水代替樣品吸光值；A1,樣品吸光值；A2,超純水代替DPPH溶液吸光值。

總還原能力：取不同消化階段多肽水溶液各0.5 mL,加入2.5 mL PBS緩沖液(0.2 mol/L,pH 6.6)和2.5 mL K4Fe(CN)6(體積分?jǐn)?shù)1%)混勻,在50 ℃的水浴中反應(yīng)20 min,迅速冷卻后加入2.5 mL 三氯乙酸(trichloroacetic acid,TCA)(體積分?jǐn)?shù)10%),混勻后在3 000 r/min下離心10 min,取上清液2 mL,加入2 mL H2O和1 mL FeCl3(體積分?jǐn)?shù)0.1%)混勻,室溫放置10 min后于700 nm處測(cè)其吸光值。

1.4 數(shù)據(jù)分析

所有實(shí)驗(yàn)均重復(fù)3次,結(jié)果以平均值±標(biāo)準(zhǔn)偏差(mean±SD)表示。使用SPSS 23.0軟件對(duì)數(shù)據(jù)進(jìn)行差異顯著性分析,P<0.05表示數(shù)據(jù)間存在顯著性差異；使用Origin 8.6(Origin Lab,USA)軟件處理和生成圖像。

2 結(jié)果與分析

2.1 消化前后多肽表面微觀結(jié)構(gòu)

掃描電子顯微鏡(scanning electron microscope,SEM)是使用聚焦電子束觀察物質(zhì)微納米尺度范圍的特征技術(shù)[13]。由掃描電鏡圖可知,TOSCP在120倍下呈大小不一的片狀并緊密排列,而CFSCP呈大小均一的小球狀排列,更加均勻細(xì)小,放大到1 000倍后,TOSCP呈不規(guī)則片狀、且表面帶有裂痕；CFSCP呈大小不一的球狀,且表面凹陷,這可能是CFSCP經(jīng)過(guò)造粒等工藝處理,外觀更加細(xì)膩光滑。由圖1-b可知,TOSCP胃消化后在120倍下呈不規(guī)則的塊狀、小球狀,放大到1 000倍后,呈大小不一的球狀黏著在一起,光滑程度不一,可能是膠原蛋白肽為抵抗胃蛋白酶水解發(fā)生了皺縮以及凍干造成的；由圖1-e可知,CFSCP胃消化后形狀不規(guī)則,孔隙大小不均,放大到1 000倍后呈現(xiàn)不均一塊狀且表面有孔洞；這可能是大分子質(zhì)量的CFSCP在胃蛋白酶作用下發(fā)生劇烈水解,肽鏈間作用力減小的原因?qū)е?這與FANG等[14]體外模擬消化鰱魚(yú)蛋白后所觀察的結(jié)果相似。由圖1-c可知,TOSCP和CFSCP腸消化后在120倍下表面松散,呈絮狀,放大到1 000倍后呈排列不規(guī)則蜂窩網(wǎng)狀結(jié)構(gòu),表面有大小不一的孔隙,這一結(jié)構(gòu)可有利于蛋白酶進(jìn)入TOSCP和CFSCP內(nèi)部,提高多肽消化程度。

圖1 TOSCP和CFSCP消化前后掃描電鏡圖Fig.1 SEM image of TOSCP and CFSCP during each digestion stage注：A～C為T(mén)OSCP各消化階段在×120的SEM圖；a～c為T(mén)OSCP各消化階段在×1 000的SEM圖；D～F為CFSCP各消化階段在×120的SEM圖；d～f為CFSCP各消化階段在×1 000的SEM圖,比例尺表示400 μm

2.2 消化前后多肽微觀結(jié)構(gòu)

采用FITC對(duì)2種膠原蛋白肽樣品進(jìn)行染色,使用CLSM觀察了膠原蛋白肽體系在胃腸消化過(guò)程中的微觀結(jié)構(gòu)變化。從TOSCP和CFSCP消化前的CLSM圖(圖2-A、圖2-a)中可以看出,2種樣品在未消化前均可觀察到明顯的綠色熒光(多肽)區(qū)域,但CFSCP的形狀更規(guī)則,接近于球形,與SEM顯示的結(jié)果一致,這可能是多肽粉末處理方式不同所致。從圖2-B、圖2-b可觀察到熒光顯色區(qū)域明顯減少,與傅丹宇[15]消化乳蛋白后熒光標(biāo)記物的變化相一致,說(shuō)明膠原蛋白肽經(jīng)胃消化后含量均減少。TOSCP和CFSCP進(jìn)一步經(jīng)腸消化后(圖2-C、圖2-c),熒光物質(zhì)基本消失。

圖2 TOSCP和CFSCP消化前后激光共聚焦圖Fig.2 CLSM image of TOSCP and CFSCP during each digestion stage注：比例尺表示250 μm

2.3 消化前后的分子質(zhì)量分布以及多肽消化率

膠原蛋白肽分子質(zhì)量大小與生物利用度直接相關(guān),低分子質(zhì)量的多肽在消化過(guò)程中可盡可能的保持完整并在組織中發(fā)揮活性[6]。多肽分子質(zhì)量分布和多肽消化率可直觀體現(xiàn)在不同消化階段中多肽肽鍵斷裂情況及氨基酸存在形式。由TOSCP和CFSCP消化前后的分子質(zhì)量比例分布圖(圖3)可知,TOSCP在消化前分子質(zhì)量主要集中在0.2 k～1 kDa,比例為63.49%,其次為3 k～10 kDa和1 k～3 kDa,比例為19.22%和13.22%；CFSCP消化前分子質(zhì)量>10 kDa的比例為27.82%,3 k～10 kDa為25.17%,1 k～3 kDa為21.37%,0.2 k～1 kDa為24.81%,其1 kDa以上的高分子質(zhì)量多肽遠(yuǎn)高于TOSCP。

TOCSP和CFSCP經(jīng)胃消化后多肽消化率如圖4所示,分別為(22.40±1.57)%和(25.55±0.20)%,無(wú)顯著性差異(P≥0.05),TOSCP在胃消化階段顯示出了較好的抗消化性,且分子質(zhì)量分布在各范圍內(nèi)并無(wú)明顯變化；CFSCP經(jīng)過(guò)胃消化后>10 kDa和1 k～3 kDa比例明顯減少,其他范圍比例增加,這可能因?yàn)镃FSCP自身分子質(zhì)量較大,更易在胃中被胃蛋白酶識(shí)別斷鍵,釋放小分子質(zhì)量多肽和游離氨基酸,所

圖3 TOSCP和CFSCP消化前后分子質(zhì)量比例分布Fig.3 Molecular weight ratio distribution of TOSCP和CFSCP during each digestion stage

圖4 TOSCP和CFSCP的多肽消化率Fig.4 Peptide digestibility of TOSCP and CFSCP during each digestion stage注：大寫(xiě)字母不同代表不同膠原蛋白肽,同種處理差異顯著;小寫(xiě)字母不同代表同種膠原蛋白肽,不同處理差異顯著(P<0.05),下同

以多肽消化率高于TOSCP,這說(shuō)明胃蛋白酶對(duì)高分子質(zhì)量多肽(>1 kDa)具有更強(qiáng)的嗜好性,其更加趨向于斷鍵大肽為小肽,破壞其可能形成的空間結(jié)構(gòu),并釋放部分游離氨基酸,這與大豆水解蛋白的體外模擬消化結(jié)果相似[16]。

TOSCP和CFSCP經(jīng)腸消化后多肽消化率進(jìn)一步增加,分別為(58.26±0.68)%和(59.57±2.81)%,兩者無(wú)顯著性差異(P>0.05)。但兩者之間分子質(zhì)量分布存在區(qū)別,CFSCP中0.2 k～3 kDa的多肽含量顯著上升,這是因?yàn)镃FSCP自身分子質(zhì)量較大,且經(jīng)胃蛋白酶作用可有效增加胰蛋白酶識(shí)別和切割位點(diǎn)數(shù)量[17],使肽鍵更易斷裂；而TOSCP經(jīng)腸消化后,發(fā)現(xiàn)3 kDa以上的多肽比例大量減少,說(shuō)明該組分更傾向于在腸道內(nèi)被胰蛋白酶水解。值得注意的是,2種活性肽<1 kDa比例在2段消化過(guò)程中均出現(xiàn)明顯提高,TOSCP經(jīng)腸消化后<1 kDa為85.39%,而CFSCP<1 kDa的比例明顯少于TOSCP,為52.55%,因此分子質(zhì)量在1 kDa以下的膠原蛋白活性肽可有效抵制胃蛋白酶作用,并有效減少胰蛋白酶的水解。先前的研究證實(shí),1 kDa以下的寡肽組分更易被吸收[18],因此經(jīng)腸消化后的TOSCP<1 kDa比例更多,分子質(zhì)量更小,更易吸收。

2.4 消化前后多肽紅外光譜分析及二級(jí)結(jié)構(gòu)變化

TOSCP和CFSCP經(jīng)胃腸消化后,2種膠原蛋白肽峰形均發(fā)生了變化。由于C—N伸縮和N—H彎曲振動(dòng),酰胺Ⅱ帶分別在TOSCP和CFSCP的1 537和1 528 cm-1處出現(xiàn)吸收峰。經(jīng)胃消化后,TOSCP中酰胺Ⅱ帶的出峰位置不變,但CFSCP發(fā)生紅移,經(jīng)腸消化后,二者均發(fā)生紅移,峰形也發(fā)生了變化,推測(cè)膠原蛋白肽亞基結(jié)構(gòu)發(fā)生了變化。酰胺Ⅲ帶分別在TOSCP和CFSCP的1 244和1 241 cm-1處有明顯吸收峰,經(jīng)胃消化后,TOSCP和CFSCP均無(wú)顯著變化,經(jīng)腸消化后,均發(fā)生紅移,2種膠原蛋白肽變化趨勢(shì)一致,具體變化還有待進(jìn)一步研究[20]。

圖5 TOSCP和CFSCP消化前后紅外光譜圖Fig.5 Infrared spectra of TOSCP and CFSCP during each digestion stage

二級(jí)結(jié)構(gòu)可從側(cè)面反映多肽分子的松散程度,多肽分子有序剛性結(jié)構(gòu)的基礎(chǔ)可歸因于具備較多氫鍵的α-螺旋與β-折疊[20]。由圖6可知,TOSCP和CF-SCP在消化前二級(jí)結(jié)構(gòu)主要以β-折疊為主,含量分

圖6 TOSCP和CFSCP消化前后二級(jí)結(jié)構(gòu)含量Fig.6 The secondary structure contents of TOSCP and CFSCP during each digestion stage

別為29.64%和34.56%,表明2種膠原蛋白肽肽鏈間多以平行或反平行排列,這種有序的二級(jí)結(jié)構(gòu)由于具備較大的氫鍵表面積而有利于多肽穩(wěn)定性。經(jīng)過(guò)胃消化后,2種膠原蛋白肽在酸性條件下經(jīng)胃蛋白酶處理,β-折疊和無(wú)規(guī)卷曲含量減少,α-螺旋和β-轉(zhuǎn)角含量增加。這類(lèi)變化可有效促進(jìn)分子內(nèi)部聚合,縮減肽鏈長(zhǎng)度增強(qiáng)其機(jī)械強(qiáng)度,使其鏈間變得更加穩(wěn)定以增強(qiáng)其對(duì)胃蛋白酶消化抵抗力[19],這與掃描電鏡圖(圖1)結(jié)果相對(duì)應(yīng)。TOSCP和CFSCP進(jìn)一步經(jīng)腸消化后,2種多肽β-折疊進(jìn)一步減少,而α-螺旋和β-轉(zhuǎn)角含量增加,這可能是因?yàn)棣?折疊含量減少有助于α-螺旋的形成[21],同時(shí)多肽鏈反轉(zhuǎn)180°形成β-轉(zhuǎn)角[22],使消化期間多肽消化產(chǎn)物β-折疊含量減少,β-轉(zhuǎn)角含量增加。這一結(jié)構(gòu)變化表明經(jīng)胰蛋白酶作用后肽鏈間變得松散,而鏈內(nèi)部收縮[21],形成蜂窩網(wǎng)狀結(jié)構(gòu)。VANGA等[23]發(fā)現(xiàn)胰蛋白酶活性與β-折疊的含量呈負(fù)相關(guān),與α-螺旋的含量呈正相關(guān),由二級(jí)結(jié)構(gòu)變化而引發(fā)的空間結(jié)構(gòu)的改變可能會(huì)進(jìn)一步改變酶的作用位點(diǎn)進(jìn)而影響活性肽的消化,這可解釋TOSCP和CFSCP在腸消化階段的多肽消化率和氨基酸釋放率更高的原因。膠原蛋白活性肽經(jīng)胃腸道消化后并不會(huì)完全水解成氨基酸,而是以一部分穩(wěn)定的空間結(jié)構(gòu)存在,并以α-螺旋結(jié)構(gòu)為主。α-螺旋具備跨越生物膜磷脂雙分子層的能力可直接被人體吸收[24],因此膠原蛋白活性肽會(huì)在胃腸道酶的誘導(dǎo)下逐漸轉(zhuǎn)化為具備剛性結(jié)構(gòu)的α-螺旋結(jié)構(gòu),進(jìn)而被吸收。

2.5 消化過(guò)程中多肽氨基酸含量變化

膠原蛋白活性肽的氨基酸組成是影響其消化特性的重要因素,可通過(guò)各消化階段過(guò)程中各類(lèi)氨基酸相對(duì)含量變化來(lái)揭示膠原蛋白肽的消化特性和對(duì)生物可及性的影響[6]。表2為T(mén)OSCP和CFSCP在模擬胃腸消化過(guò)程中氨基酸的相對(duì)含量。經(jīng)胃消化,TOSCP和CFSCP的疏水性氨基酸的相對(duì)含量顯著降低(P<0.05),分別為2.26%和1.93%,這與酶的專(zhuān)一性有關(guān),胃蛋白酶更嗜好于苯丙氨酸、纈氨酸等疏水性氨基酸殘基[25],這類(lèi)氨基酸作為β-折疊結(jié)構(gòu)的重要組成部分,它們的減少將進(jìn)一步導(dǎo)致β-折疊結(jié)構(gòu)的含量減少,與二級(jí)結(jié)構(gòu)變化相對(duì)應(yīng)[21]。經(jīng)胃腸消化后,TOSCP和CFSCP中堿性氨基酸和疏水性氨基酸含量進(jìn)一步降低,且具有顯著性差異(P<0.05),這可能與多肽序列差異有關(guān),胰蛋白酶的反應(yīng)位點(diǎn)一般是緊鄰精氨酸或賴氨酸的肽鍵[25],因此含有更多堿性氨基酸的多肽比含有更多酸性氨基酸的肽更易被消化。經(jīng)過(guò)胃腸消化,TOSCP和CFSCP兩種多肽在消化過(guò)程中的各類(lèi)氨基酸含量變化相似,且脯/羥脯氨酸可有效抵制胃腸蛋白酶作用(P<0.05)[26],呈現(xiàn)了較強(qiáng)的抗消化性,這與ZHONG等[27]的研究結(jié)果相似。結(jié)合多肽消化率和氨基酸含量、分子質(zhì)量的變化可知,膠原蛋白活性肽在胃消化階段主要以大肽斷鍵為主,而在腸消化階段,多肽的疏水性、堿性氨基酸殘基作為特異性反應(yīng)位點(diǎn)被水解,釋放大量1 kDa以下的多肽。

表2 TOSCP和CFSCP在各消化階段氨基酸相對(duì)含量變化 單位：%

續(xù)表2

2.6 消化前后多肽抗氧化性變化

抗氧化活性是膠原蛋白活性肽的重要功能特性之一,可有效遏制心血管疾病的發(fā)生,抵制由自由基引發(fā)的脂質(zhì)過(guò)氧化所導(dǎo)致的各類(lèi)疾病[6,12],故選取抗氧化性作為消化過(guò)程中多肽生物穩(wěn)定性的判斷指標(biāo)?？寡趸钚耘c多肽結(jié)構(gòu)特征密切相關(guān),如分子質(zhì)量、特定氨基酸組成以及二級(jí)結(jié)構(gòu)[6]等,通過(guò)對(duì)不同消化階段中多肽的DPPH自由基清除率和總還原力的測(cè)定,探究膠原蛋白活性肽消化過(guò)程中結(jié)構(gòu)特征變化對(duì)膠原蛋白肽生物穩(wěn)定性的影響。

DPPH自由基作為一種穩(wěn)定自由基,其中心結(jié)構(gòu)中的氮原子可與多肽自由基清除劑配對(duì),使其還原為DPPH-H非自由基形式,以此來(lái)判斷其抗氧化活性。在各濃度梯度下,TOSCP和CFSCP在不同消化階段展現(xiàn)出相同的變化趨勢(shì),在消化前,TOSCP和CFSCP抗氧化活性差異較大,在5 mg/mL質(zhì)量濃度下,TOSCP和CFSCP的DPPH自由基清除率分別為49.59%和7.89%(P<0.05)。經(jīng)胃消化后,TOSCP和CFSCP的抗氧化活性均出現(xiàn)顯著提高(5 mg/mL,P<0.05),在10 mg/mL質(zhì)量濃度下,CFSCP的DPPH自由基清除率可達(dá)28.77%,較未消化前活性上升3.60倍,這可能是因?yàn)槲傅鞍酌傅淖饔?使先前未表現(xiàn)或潛在的活性肽從親本序列中釋放出來(lái)生成新的抗氧化多肽,或經(jīng)水解后更多具備抗氧化活性的疏水性氨基酸殘基被暴露,使抗氧化活性升高[6]；經(jīng)過(guò)胃腸消化后,TOSCP的抗氧化活性出現(xiàn)小幅度下降(P>0.05),這是因?yàn)樘囟ǖ陌被嵯鄬?duì)含量的變化以及其序列中位置的改變所導(dǎo)致,由于胰蛋白酶作用,使具備抗氧化活性的疏水性氨基酸從肽鏈完整結(jié)構(gòu)中釋放致使抗氧化活性降低；同時(shí)已有研究證明,多肽α-螺旋結(jié)構(gòu)增加可降低其抗氧化性,因此在消化過(guò)程中,α-螺旋結(jié)構(gòu)的增加也是降低其抗氧化活性原因之一[13]。

A-DPPH自由基清除率；B-總還原能力(樣品濃度為5 mg/mL)圖7 TOSCP和CFSCP消化前后抗氧化活性變化Fig.7 Antioxidant activity changes of TOSCP and CFSCP during each digestion stage

多肽的總還原能力強(qiáng)弱可通過(guò)吸光度的大小來(lái)反映,并與吸光度數(shù)值呈正比[12]。在5 mg/mL質(zhì)量濃度下TOSCP和CFSCP在不同消化階段中總還原能力變化趨勢(shì)和DPPH自由基清除率相似,但在消化前或消化中任何一階段TOSCP還原能力顯著高于(P<0.05)CFSCP,這可能與分子質(zhì)量大小有關(guān),小分子質(zhì)量的TOSCP更易在N末端暴露出更多具備抗氧化活性的疏水性氨基酸和支鏈氨基酸[25],另外,TOSCP中高含量甘氨酸、谷氨酸、丙氨酸等氨基酸可通過(guò)作為H+供體促進(jìn)肽與自由基的反應(yīng),表現(xiàn)出較高的抗氧化活性[3]。BUSTAMANTE等[28]使用堿性蛋白酶、糜蛋白酶和風(fēng)味酶水解乳清蛋白制備的不同分子質(zhì)量多肽,發(fā)現(xiàn)低分子質(zhì)量水解物具備更高的抗氧化活性；WU等[1]從鮭魚(yú)皮中截取分子質(zhì)量<3 kDa的膠原蛋白肽組分,該組分DPPH自由基清除率可達(dá)73.29%；CHI等[29]從藍(lán)鰭金槍魚(yú)皮中制備純化了3種具有抗氧化性能的膠原蛋白肽,其分子質(zhì)量均<1 kDa。因此多肽分子質(zhì)量集中分布于1 kDa以下的TOSCP在胃腸消化過(guò)程中的抗消化性和結(jié)構(gòu)完整性優(yōu)于CFSCP,由此表現(xiàn)出較高的抗氧化活性。

3 結(jié)論與討論

本文利用INFOGEST體外消化模型探究了TOSCP和CFSCP在不同消化階段中結(jié)構(gòu)特征變化及其對(duì)抗氧化活性的影響。結(jié)果表明,小分子質(zhì)量的TOSCP表現(xiàn)出了更好的抗消化性和生物穩(wěn)定性。TOSCP和CFSCP在胃消化階段中多肽消化率分別為22.40%和25.55%,胃蛋白酶主要以斷鍵大肽為小肽為主,且對(duì)高分子質(zhì)量膠原蛋白活性肽(>1 kDa)具有更強(qiáng)的選擇專(zhuān)一性；消化過(guò)程中發(fā)現(xiàn),1 kDa以下多肽能有效抵制胃腸蛋白酶作用,且由于酶的專(zhuān)一性,脯氨酸和羥脯氨酸表現(xiàn)出了優(yōu)越的抗消化性能,疏水性氨基酸和堿性氨基酸更易釋放；多肽會(huì)在胃腸道酶誘導(dǎo)下逐漸轉(zhuǎn)化為具備剛性結(jié)構(gòu)的α-螺旋結(jié)構(gòu),并在掃描電鏡下可觀察到蜂窩網(wǎng)狀結(jié)構(gòu)。1 kDa以下的多肽在胃腸消化過(guò)程中可保持結(jié)構(gòu)完整性并發(fā)揮其抗氧化活性,因此集中分布于1 kDa以下的TOSCP在不同消化階段中其抗氧化活性始終較高；胃消化過(guò)程中小分子質(zhì)量多肽的釋放均促進(jìn)了TOSCP和CFSCP抗氧化活性提高,但經(jīng)過(guò)胃腸2個(gè)階段消化后,α-螺旋結(jié)構(gòu)的增加、具有抗氧化活性的疏水性游離氨基酸的大量釋放將導(dǎo)致抗氧化活性下降,該研究為膠原蛋白多肽功能性制品的研發(fā)提供實(shí)驗(yàn)依據(jù)。